ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE ALIMENTOS Moreno Luis Miguel1, Polanco C. Alejandro2, Ramírez R. Nayibe3 ESCUELA INGENIERIA DE ALIMENTOS, UNIVERSIDAD DEL VALLE
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RESUMEN Los riesgos ocasionados por peligros microbiológicos constituyen un problema grave e inmediato para la salud humana, los alimentos son un gran foco de atención ya que estos por una mala manipulación pueden ser peligrosos para la salud. En E n esta práctica se llevó a cabo el análisis microbiológico a una ensalada de frutas la cual fue comprada en el campus con el fin de conocer como es la calidad de los alimentos que se venden en este plantel; la muestra fue sometida a varios procesos para identificar, cuales microorganismo están presentes en el producto o por el contrario es un producto inocuo acto para el consumo humano, la ensalada de frutas dio positivo en el conteo de coliformes, mesofilos y levaduras dando unos rangos muy altos lo cual por medio de la literatura nos podemos dar cuenta que no es un producto acto para el consumo.
INTRODUCCION La presencia de microorganismos en los alimentos no significa necesariamente un peligro para el consumidor o una calidad inferior de estos productos. La mayor parte de los alimentos se convierten en potencialmente peligrosos para el consumidor sólo después de que han sido violados los principios de higiene, limpieza y desinfección. La puesta en evidencia de este riesgo se basa en el examen de muestras de alimentos en busca de los propios agentes causales o de indicadores de una contaminación no tolerable. Esto es posible ya que el microbiólogo prefiere utilizar un grupo o especies de microorganismos, cuya enumeración o recuento se realiza con gran facilidad y cuya presencia en el alimento indica que estos productos estuvieron expuestos a condiciones que pudieron haber introducido organismos peligrosos y permitido la multiplicación de especie infecciosa o toxigénicas. Los microorganismo indicadores son organismo que advierten oportunamente de un manejo inadecuado o contaminación que incrementa el riesgo de presencia de microorganismo patógeno en alimentos, los principales microorganismo indicadores son mesofilos aerobios, hongos y levaduras, coliformes, coliformes fecales, E. coli, enterococos, Cl. Perfringens. La selección de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de los riesgos que implicado y de los que se requiere para saber liberar, controlar o mejorar un alimento. (Olivas, 2004)
MATERIALES Y METODOS
Cajas de petri esterilizadas. Pipetas esterilizadas. Pipetas pasteur esterilizadas. Frasco con 90 mL de agua peptonada Tubos de ensayo con 9 mL de caldo lactosado Erlemeyer con agar cuenta gérmenes Erlemeyer con agar McConkey Erlemeyer con agar saboraud Erlemeyer con agar AMB Gradilla para tubos Mechero Cinta de enmascarar Caldo lauryl sulfato Caldo brila Caldo triptona Reactivo de Kovacks Agar cristal violeta Rojo neutro bilis glucosa Reactivo de catalasa
DILUCION DE LA MUESTRA DE ALIMENTOS Se empieza por hacer las diluciones de alimento desde 10-1 a 10-3, las diluciones se hacen de la siguiente manera; en la 10-1 se mide 10 mL o 1 g de la muestra en un frasco que contiene 90 mL de diluyente de agua peptonada, de ahí se renvalsa 1 mL de la dilución 10-1 a un tubo que contenga 9 mL de diluyente para así obtener la dilución 10-2 y así se siguen preparando las otras diluciones.
INOCULACIÓN DEL ALIMENTO Número más probable de coliformes totales Se debe pipetear 1 mL de cada una de las diluciones anteriores (10-1 a 10-3) en tubos con caldo Lauryl sulfato, este proceso se necesitan 3 tubos por cada dilución, los tubos deben ser inoculados por 24-48 horas a 37ºC. Pasado el tiempo observar si se presentó producción de gas.
Prueba confirmativa para coliformes totales Esta prueba es confirmativa, una vez pasado el tiempo de inoculación se debe observar si los tubos presentaron producción de gas, los que dieron positivos a esta prueba se le agrega de 2 a 5 gotas de reactivo de Kovacs de ahí de agitan un poco y observar la presencia de un anillo rojo en la superficie esto quiere decir que la prueba es positiva, si no sucede ningún cambio en la superficie se dice que la prueba es negativa.
Interpretación de resultados Una vez conociendo el número de tubos positivos, tanto de coliformes totales y coliformes fecales en la prueba de Kovacs se deben comparar con la tabla NMP (Numero mas probable). Los tubos positivos en la prueba confirmativa deben ser sembrados por estría; con un asa se toma muestra de la superficie de uno de los tubos y se siembra en la placa de agar EMB (Eosina azul de metileno). Esta caja se deja encubar por un tiempo de 24-48 hora a 37°C, pasado el tiempo se observar si hubo crecimiento de coliformes, las cuales tienen un color verde metálico brillante para que la prueba sea positiva.
RECUENTO DE MESOFILOS Transferir por triplicado 1 mL de cada una de las disoluciones 10 -3 a 10 -5 en cajas petri las cuales deben de estar vacías, estériles y rotuladas; verter en las caja agar cuenta gérmenes fundido a una temperatura de 45°C, inmediatamente mezclar haciendo movimientos suaves en forma circular dejar solidificar, incubar por 24-48 horas a 37°C después de pasado este tiempo observar.
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS Se procede de la misma manera que en el recuento de mesofilos pero se vierte en la caja Petri el agar cristal violeta rojo neutro bilis glucosa dejar solidificar e incubar por 48 horas, seleccionar la placas que contengan en 30 o 300 colonias violetas. Esta prueba se confirma con la prueba de oxidasa.
PRUEBA DE OXIDASA Tomar con un asa estéril, una de las colonias que crecieron en el agar cristal violeta neutro bilis glucosa, y esparcirla en la tira de papel impregnado con el reactivo para-amino-Ndimetil-anilina; si se observa un cambio de color a un morado oscuro la prueba da positiva y no se presenta cambio de color la prueba es negativa.
RECUENTO DE HONGOS Y LEVADURAS Transferir por triplicado 1 mL de cada una de las disoluciones (10-3 a 10-5) en las cajas Petri previamente esterilizadas y marcadas, inmediatamente verter el agar Saboraud
fundido agitar y dejar solidificar, incubar durante 5 a 8 días, pasado este tiempo observar las levaduras.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN Tabla 1. Resultados de análisis microbiológico en ensalada de frutas.
PRUEBAS
Coliformes totales y fecales (NMP/g)
METODOS
RESULTADOS Todas las pruebas dieron como resultado (+). La formación de colonias fue -Prueba presuntiva máxima, por lo tanto no se puedo -Prueba confirmativa determinar la cantidad exacta. -Recuento de placas Numero de colonias >300.
Mesofilos(UFC/g)
-Método de recuento Abundante formación de colonias de placa (PCA) Evitando dar un nuero exacto. Numero de colonias >300.
Enterobacterias(UFC/g)
Excesiva creación de colonias -Método de recuento Evitando dar un nuero exacto. de placa (CVRN) Numero de colonias >300.
Géneros: Pseudomonas Neisseria Moraxella Vibrio Aeromonas Otros Hongos y levaduras (UFC/g)
-Prueba oxidasa
La prueba oxidasa se realizó dos veces para confirmar su resultado el cual fue (-).
-Observación -Recuento de placas ( OGY) -Cultivo en agar EMB a partir de los tubos (+) -Identificación de color verde brillante
Solo hubo formación de levaduras, su formación fue abundante, por lo tanto no se logró contar. Después del tiempo de incubación no se presentó color verde brillando en el cultivo por lo tanto no hay formación de dicha bacteria.
E.coli
En la producción primaria de los alimentos, generalmente presenta una flora microbiana debido a las condiciones en las que se produce, ya sea por operadores, equipo, fauna o contaminaciones cruzadas y a su contenido nutricional que posibilita la supervivencia o el desarrollo de microorganismos. Si no se tiene un debido control pueden llegar a multiplicarse y ocasionar deterioro en los alimentos, perdida de nutrientes y riesgo en la salud debido a contaminación con microorganismos patógenos (Rosario et all, 1999).
El desarrollo de poblaciones microbianas que pueden estar presentes en un alimento va desde algunos miles hasta varios millones de células por gramo, su determinación cuantitativa requiere la preparación de diluciones conocidas de la muestra, la cual es costumbre utilizar para facilitar los cálculos e identificación de un microorganismo en específico.(Vicente 1997). Tabla 2. Especificaciones microbiológicas establecidas para la ensalada de frutas.
NOMBRE DEL PRODUCTO
DETERMINACIONES
LIMITE MAXIMO PERMISIBLE Ensalada de frutas Mesofilos aerobios UFC/g 150.000* Coliformes totales NMP/g 100* *Limite microbiológico de la ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods).
COLIFORMES TOTALES Y FECALES
Figura 1. Prueba presuntiva de coliformes en tubos de diluciones de 10 -1 , 10-2 y 10-3.
Figura 2. Tubos que presentan turbidez.
El análisis microbiológico de la ensalada de frutas dio positivo para este tipo de especie bacteriana. Los microrganismo coliformes desenmascaran malas prácticas higiénicas, algunas de origen intestinal y otra proveniente de materia orgánica. son bacterias facultativas aerobias y anaerobias, Gram negativas que fermentan la lactosa produciendo ácido y gas dentro de 48 h a 32ºC para los productos lácteos como el yogurt, crema de leche contenida en la muestra (Bib. Orton IICA / CATIE, 2001). La utilización de aguas de origen domestico llevan una carga microbiana “normal”, materia orgánica e inorgánica, hallándose bacterias de putrefacción, patógenas y algunos grupos utilizados como indicadores de contaminación, entre los cuales se encuentran, los coliformes (RHEINHEIMER, 1974). Los coliformes fecales son los coliformes totales relacionados con contaminación de materia fecal, crecen con lactosa y la fermentan, además con termotolerantes. En este grupo se encuentran principalmente la E scherichia Coli y K lebsiella, siendo organismos de origen totalmente intestinal. La presencia de este grupo en los alimentos indica: principalmente mala o nula práctica de lavado de manos, deficiencia de higiene personal y de utensilios de trabajo. (FRANCISCO BRAVO, 2004). En la figura 1 se puede observar las 3 diluciones de 10-1, 10-2 y 10-3, para esta prueba se considera como positivos los tubos que tengan producción de turbidez como los de la figura 2 y gas que es indicada por el desplazamiento de la campana de Durham, este gas es producido por la fermentación de la lactosa, indicando que si hay presencia de aire, en gran cantidad.
PRUEBA CONFIRMATIVA PARA COLIFORMES TOTALES
Figura 3 Prueba confirmativa con reactivo de Kovacs para coliformes.
Los tubos de la figura 3 que presentaron una prueba positiva en producción de gas y turbidez se le debe hacer una prueba para confirmar la presencia de estos coliformes en el medio, agregando 5 gotas del reactivo de Kovacs, marcando como positivo los tubos que presenciaran un anillo rojo en la superficie. Luego de determinar la cantidad de tubos positivos en esta prueba se procede a la clasificación para el NMP (Numero más probable) de estos microorganismos. Para determinar el NMP de esta prueba se deben seleccionar la cantidad de tubos positivos según su repetición, para este caso todos los tubos fueron positivos en sus 3 repeticiones por lo que en la tabla se buscó el 333, indicando el número más grande de esta que es >2400, por lo que este alimento esta en pésimas condiciones para ser consumido. Basados en la tabla 2 que indica el límite máximo permisible para coliformes es de de 100, limite que es sobrepasado por mucho en esta prueba.
RECUENTO MESOFILOS
Figura 4. Recuento de mesofilos, presencia de coliformes totales y fecales en diluciones 10 -3 , 10-4 y 10-5 , respectivamente en agar PCA.
Este tipo de procedimiento se utiliza para identificar las buenas prácticas de manufactura (BPM) de un producto determinado, el recuento identifica: el contenido microbiano, la eficiencia del procedimiento durante su elaboración, las condiciones de salubridad de los utensilios y equipos utilizados y la manipulación adecuada de alimentos perecederos. Este recuento no diferencia tipos de bacterias. (Decreto 3484,2000) En este grupo determinan las bacterias que crecen a los 35ºC en presencia de oxígeno y dentro de estas condiciones de crecimiento se encuentran bacterias de diferentes formas y agrupaciones, además de las incluidas; bacterias lipoliticas, proteolíticas, sacaroliticas y patógenas; la presencia alta de estos tipos de microorganismos en un alimento indica: la baja vida de anaquel de los alimentos, la posible presencia de microorganismos patógenos y las condiciones higiénicas con las que fue manipulado el alimento como el manejo de los mismos utensilios para elaborar diferentes productos ( FRANCISCO BRAVO,2004).
En la figura 4 podemos observar los 3 agares de dilución de 10-3, 10-4 y 10 -5, en todos ellos el conteo de colonias no fue posible, ya que se presentó una cantidad mayor a 300 colonias. Visualmente se podría decir que eran cientos de miles de microorganismos aun en la última dilución, por lo que se concluye que esta ensalada de frutas presenta una contaminación muy alta de coliformes y mesofilos, sobrepasando por mucho al límite máximo permisible de 150.000 para mesofilos indicado en la tabla 2, según la ICMSF.
RECUENTO DE ENTEROBACTERIAS
Figura 5 Recuento de enterobacterias en agar CVRN.
Las enterobacterias son microorganismos de forma bacilar, Gram negativos, anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan glucosa y reducen nitritos a nitratos; crecen en medios conteniendo sales bilares, como: escherichia (no todas las cepas), entrobacter, klebsiella, citrobacter y los no fermentadores de lactosa como: shigella, salmonella, edwarsiella, hafnia, proteus, providencia, entre otros. (ALMENAR, VANDEVENNE, VIÑAS, 1997). Se encuentran en el intestino del hombre y de los animales, pero también en otros ambientes: suelo, plantas, cascaras de huevo, etc. (ROSARIO, CALDERON, PASCUAL, 1999). El uso de las enterobacterias totales como índice de contaminación fecal ha adquirido una gran aceptación, se emplea preferentemente para señalar la calidad microbiológica de alimentos procesados: pasteurizados, cocidos, alimentos infantiles y similares, su presencia a niveles altos en los citados alimentos indica una elaboración inadecuada, una contaminación posterior a su fabricación o ambas y siempre implica un riesgo alimentario. (ALMENAR, VANDEVENNE, VIÑAS, 1997).
Para esta prueba para la que fue usado el agar cristal rojo, el medio inhibe el crecimiento de la flora, y el rojo neutro permite que se forme un halo violeta al borde de las colonias, las colonias en este medio adquieren una coloración violácea. Nuevamente no fue posible en conteo de bacterias, ya que en todas las diluciones presento un número de colonias “incontables” debido a la cantidad desarrollada.
PRUEBA CONFIRMATIVA PARA PRESENCIA DE E. COLI.
Figura 6 Cultivo de enterobacterias en agar EMB desarrollada en el agar CVRN.
Para este caso se escogió dos de los tubos positivos para la prueba de coliformes totales. Se sembró por estrías en un agar EMB para confirmar la presencia de E.Coli, dejándolo 3 días para su resultado. Esta prueba dio negativa ya que no hubo un crecimiento de colonias verdes metálica brillante, por lo que indica que no hay presencia de esta bacteria, así que se asume que hay otros tipos de bacterias de esta familia de enterobacterias, para identificarlas habría que hacer otro tipo de pruebas. (Olivas 2001).
PRUEBA OXIDASA
Figura 7 Prueba oxidasa para enterobacterias con halos morados.
Algunos citocromos actúan como el último eslabón en la cadena respiratoria aerobia al transferir electrones al oxígeno, con formación de agua, la oxidasa también conocida como cotocromo c oxidasa o indofenol oxidasa, activa la oxidación del citocromo c reducido por acción del oxígeno molecular
Esta enzima se encuentra en una gran variedad de seres vivos, incluso algunas bacterias, por lo que su determinación es de interés taxonómico en bacteriología, permite distinguir algunos géneros gran negativos, como aeromonas, Pseudomonas, Neisseria, Moraxella, Vibrio, Aeromonas, entre otros., se usa también para diferenciar coco o cocobacilos (Editorial Universidad de Costa Rica, 2005) El resultado de esta prueba confirmativa, oxidasa, fue negativo ya que no hubo un cambio de color, para esta prueba el color deberá cambiar a un rojo/fucsia en la tira, de lo contrario permanecerá igual. Como las bacterias que crecieron en el medio fueron de la familia Enterobacteriaceae, su resultado fue negativo ya que no tienen producción de la enzima oxidasa.
RECUENTOS DE HONGOS Y LEVADURAS La producción de hongos y levaduras nos indican la edad del alimento y contaminación ambiental, también pueden ser portadores por el hombre, su crecimiento depende de mucha cantidad humedad presente en el alimento. Producen micotoxinas cuyo daño puede ser a largo plazo. La presencia de estos microorganismos puede deberse a: que están en el ambiente, el alimento viene contaminado de origen, los empleados los portan por medio de las uñas, manos, ropa, etc., ello por la mala higiene, entre otras, por el inadecuado lavado de manos y así los introducen en el alimento (FRANCISCO BRAVO, 2004). La muestra analizada solo dio producción de levaduras.
Figura 8. Recuento de levaduras y hongos en agar OGY.
Para este alimento se hizo una prueba de crecimiento de levaduras y hongos, en esta prueba solo hubo un crecimiento de levaduras, que se determina por la presencia de colonias ovaladas convexas, y cremosas, para hongos fue negativo.
CONTAMINACIÓN DEL PRODUCTO POR CAUSAS AMBIENTALES El aire es uno de los medios más hostiles para la supervivencia de los microorganismos debido a su constante exposición con el oxígeno, cambios de temperatura, humedad relativa y radiación solar que puede contaminar como los Gram positivos, y llegar al producto analizado ya que no está cubierto totalmente. La contaminación por medio de la saliva también juega un papel importante, ya que estos son agentes contaminantes por vía oral, la cual contiene una flora microbiana y enzimas que pueden alterar el producto.(Orton et all, 2001).
ANEXOS -¿Cuál es el funcionamiento de las diferentes pruebas que ha realizado? Estas pruebas se llevan a cabo para poder determinar que alimentos son los adecuados y de buena calidad, apropiados para el consumo, como también mantener un control, en su procesamiento, manipulación y preparación de estos. Para poder detectar estos microorganismos en necesario llevar a cabo ciertas pruebas exigidas llevadas pasó por paso para una buena determinacion, para poder llevar una buena calidad y manufactura. (Francisco, 2004).
-¿Cuáles son los componentes de cada uno de los medios de cultivo y porque se utilizan? Agar Saboraud: es un medio de cultivo selectivo que contiene peptonas. Es utilizado para el cultivo de hongos, especialmente dermatofitos. Agar PCA: es utilizado para el examen bacteriológico de comida, agua, leche y otros derivados lácticos. Está compuesto por triptona, dextrosa, extracto de levadura y agar. Agar McConkey: este medio es utilizado para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fácil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clínicas, de agua y alimentos. Está compuesto por peptona, pluripeptona, lactosa, mezcla de sales biliares, cloruro de sodio, agar, rojo neutro y cristal violeta. Caldo lauryl sulfato Agar CVRN: En este medio, la peptona provee la fuente de carbono y nitrógeno necesaria para el desarrollo de los microorganismos. El extracto de levadura provee vitaminas del complejo B para estimular el crecimiento. Agar EMB: El Agar EMB es una combinación de la fórmula original y la de Levine donde las peptonas proveen la fuente de nitrógeno, la eosina y el azul de metileno son colorantes que se combinan para formar un precipitado a pH ácido. Los colorantes actúan como
inhibidores e indicadores. Los carbohidratos proporcionan la fuente de energía, los fosfatos actúan como buffer y el agar como agente solidificarte. (Rosario et all, 1999).
CONCLUSIONES El alimento al cual se hizo análisis microbiológico (ensalada de frutas), no presenta buenas prácticas de manufactura, por lo tanto este no es un producto inicuo, por lo que no es adecuado para el consumo humano. - Los microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, presenta resultados marcados para las diferentes pruebas. -
BIBLIOGRAFÍA Olivas E, 2001. Manual de prácticas de microbiología l, ll y parasitología1era reimpresión 2004, universidad autónoma de Juárez, pág. 29. BIB. ORTON IICA / CATIE, Manual de Procedimientos Para El Control Microbiológico de Alimentos, 2001. Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio, Editorial Universidad de Costa Rica, 475 paginas 2005. FRANCISCO BRAVO, El manejo higiénico de los alimentos / Hygiene Handling of Food: Guía para la obtención del distintivo H / Guide for Obtaining the Distintive H, lisuma 115 paginas, 2004. María del Rosario Pascual Anderson, Vicente Calderón y Pascual, Microbiología Alimentaria: Metodología Analítica para Alimentos y Bebidas, Ediciones Díaz de Santos, 464 pages, 1999. RHEINHEIMER, G: aquatic microbiology. Wiley interscience. London ,1974 Real Decreto 3484/2000, de 29 de diciembre por el que se establecen las normas de higiene para la elaboración, distribución y comercio de comidas preparadas. Boletín Oficial Español. Vicente Sanchís Almenar, Corrie Allaert Vandevenne, Inmaculada Viñas Almenar, Núria Sala Martí, Mercè Torres Grifo, Prácticas. Microbiología de alimentos, Universitat de Lleida, 1997.
