ANÁLISIS FISICOQUÍMICO DE LECHE ENTERA Y LECHE DESCREMADA Universidad De Cartagena Programa De Ingeniería de Alimentos Cartagena, Colombia 18 de septiembre del 2017 Granados Clemente1, Cardona Maryuris2, Flórez Diana2, Mercado Brayan2, Rodríguez Ketty2, Yate Jair 2 1. Docente de procesos V, 2. Estudiantes del programa de ing. de Alimentos
RESUMEN En esta práctica se realizaron diferentes pruebas para la determinación de adulterantes en leche entera y en leche descremada, además de realizar pruebas fisicoquímicas complementarias y así determinar características esenciales de estos dos tipos de leches para luego ser comparados con los datos encontrados en la literatura y determinar la calidad de la leche. Con la determinación de adulterantes encontramos lo que son la adición de sustancias tales como: agua (leche aguada), compuestos clorados, harinas, bicarbonatos, azúcar, etc. Con los análisis fisicoquímicos sé determinaron ciertos componentes químicos de la leche como grasa, densidad, acidez, así como aspectos microbiológicos en donde se determinó el tiempo de reducción del azul de Metileno (TRAM), obteniéndose una acidez de 1.5 y 1.6, densidad de 1.030 y 1.034, pH de 7.24 y 7.253, % de grasa de 3.34 y 0, punto de congelación de -0.459 y -0.500 para la leche entera y descremada respectivamente, así como resultados negativos para la prueba de alcohol, neutralizantes y reducción mínima del azul de metileno, concluyendo que ambas leches eran de calidad aceptable, puesto que están dentro del rango permitido según el decreto de creto 616 de 2006. Por lo tanto, se infiere que estos dos tipos de leche cumplen con la normatividad establecida por el ministerio de la protección social.
Palabras claves: Análisis, adulterantes, fisicoquímicos, leche entera, leche descremada, densidad, grasa, TRAM. ABSTRACT In this practice, different tests were carried out for the determination of adulterants in whole milk and in skim milk, as well as to perform complementary physicochemical tests and to determine essential characteristics of these two types of milk, to be compared with the data
found in the literature and to determine the quality of milk. With the determination of adulterants we find what are the addition of substances such as water (watery milk), chlorinated compounds, flour, bicarbonates, sugar, etc. With the physicochemical analyzes, certain chemical components of the milk were determined as fat, density, acidity, as well as microbiological aspects in which the time of reduction of the Methylene blue (TRAM) was determined, obtaining an acidity of 1.5 and 1.6, density of 1.030 and 1.034, pH 7.24 and 7.253, fat% 3.34 and 0, freezing point -0.459 and -0.500 for whole and skim milk respectively, as well as negative results for the alcohol test, neutralizing and minimum reduction of blue of methylene, concluding that both milks were of acceptable quality, since they are within the allowed range according to the decree 616 of 2006. Therefore, it is inferred that these two types of milk comply with the normativity norm ativity established by the ministry of social protection.
Key words: Analysis, adulterants, physicochemicals, whole milk, skim milk, density, fat, TRAM.
1. INTRODUCCIÓN
Según el reglamento sanitario de los alimentos citado por Chacón (2017) “leche, sin otra denominación, es el
producto íntegro y fresco de la ordeña completa e ininterrumpida de la vaca, bien alimentada y en reposo, exenta de calostro”
Esta capacidad secretora es una de las características que definen a los mamíferos. La principal función de la leche es la de nutrir a las crías hasta que son capaces de digerir otros alimentos. Además, cumple las funciones de proteger el tracto gastrointestinal de las crías contra microorganismos patógenos, toxinas e inflamación y contribuye a la salud metabólica regulando los procesos de obtención de energía, en especial el metabolismo de la glucosa y la insulina (Equipo2, 2008). La composición de la leche varía considerablemente teniendo en cuenta
aspectos tales como la raza, la genética, el estado de lactancia, el número de partos (por ejemplo aumenta del primer parto al quinto y disminuye en el séptimo), la alimentación, época del año (En Colombia la producción de la leche es estacionaria), la actividad del animal, así como el número de ordeños. Aun así, algunas de las relaciones entre los componentes son muy estables y pueden ser utilizados para indicar si ha ocurrido alguna adulteración en la composición de la leche (Mercado et al 2014). La leche entera está constituida por alrededor del 88% de agua y contiene en promedio 12% de sólidos totales. Se han identificado más de 100 diferentes componentes que resultan relevantes para la nutrición humana, tal es el caso de las vitaminas (D, A, B12), los minerales (Ca, K y P), las proteínas (caseína) y otros factores benéficos para la salud (ácidos grasos omega 3 y 6) (Chacón, 2017).
Cuando se considera a la leche desde el punto de la calidad se utiliza un vocablo de alcance muy general en el que van comprendidas, su composición, los diversos elementos que la constituyen, el sabor y el aroma, la posible presencia en ella de sustancias extrañas, la cantidad de microorganismos presentes (patógenos o no) y la acción de los mismos, las condiciones sanitarias del lugar de producción y la manipulación higiénica higiénica de la leche desde el lugar de producción al de consumo (González et al, 2002). La calidad de leche es un aspecto fundamental en la competitividad de la ganadería vacuna lechera, así mismo es insustituible en la alimentación de las personas perteneciendo a la canasta básica familiar, por tanto su inocuidad es importante como prioridad de la salud pública (Brousett et al, 2015).
obtener productos con prolongada capacidad de conservación. Caracteres sensoriales intachables. Escaso contenido celular como expresión de una composición normal de la leche, sin alterar por mamitis y trastornos secretorios.
Para cumplir con estos requerimientos se hace necesario evaluar la calidad de la leche por medio de análisis fisicoquímicos que garanticen el cumplimiento de la ley y la viabilidad de la leche para consumo (Acevedo y López, 2011).
Partiendo de esto, pueden expresarse los siguientes criterios aplicables a la calidad de la leche cruda, que determinarán a su vez la aptitud para el tratamiento industrial indus trial y la calidad de los productos terminados (Brousett et al, 2015):
Las determinaciones que se realizan comúnmente en el análisis químico de la leche, permiten comprobar si sus valores responden a los característicos de composición genuina, poner al descubrimiento alteraciones y adulteraciones o fraudes e indicar (entre ciertos límites) el estado de conservación. Un examen rutinario incluye frecuentemente las determinaciones de densidad, grasa, sólidos totales (análisis proximal), acidez, descenso crioscópico, estimación del grado de contaminación (Acevedo y López, 2011).
Ausencia absoluta de sustancias que puedan actuar perjudicialmente sobre la salud del consumidor, como sustancias extrañas y residuos de productos nocivos, pesticidas, medicamentos, toxinas microbianas, etc. Normal capacidad de acidificación, es decir, ausencia sobre todo de sustancias inhibitorias de acción antibiótica. Escaso contenido de gérmenes, como requisito previo fundamental para
El decreto 616 del 2006 y la norma técnica del ICONTEC NTC 506, exige a los productores que la leche procesada cumpla con ciertos requerimientos que aseguren la calidad del producto final, entre los cuales se destacan la densidad, % de materias grasas, % de sólidos totales, % de materias no grasas y % de acidez expresado como ácido láctico, teniendo para estos unos valores definidos de cumplimiento con los cuales se busca determinar a groso modo que la composición de la leche no ha
variado su composición proteica y de minerales, siendo así apta para el consumo (Acevedo y López, 2011). La crioscopia de la leche de vaca es un parámetro importante para la medición de adulterantes en leches, principalmente cuando se altera la leche mediante la adición de agua (Montoya y Obando, 2015). En cuanto a su composición la grasa es muy importante en el control de calidad de la industria láctea, tanto para conocer su contenido nutricional, para pactar precios y para detectar adulteraciones fraudulentas (aguado, desnatado) que pueden provocar cambios en el valor nutricional, alteraciones de las características organolépticas e incluso poner en peligro la salubridad del producto (Martínez et al, 2013). Los sólidos totales de la leche son una medición de suma importancia en las industrias lácteas, al ser responsables en gran parte de los buenos o malos rendimientos en productos lácteos. Están representados por todos los elementos sólidos de la leche incluyendo la grasa, por lo que están sometidos a los mismos factores de variación que esta. Los sólidos no grasos de la leche están compuestos por lactosa, proteínas y minerales principalmente, incluye todos los sólidos de la leche a excepción de la grasa, la variabilidad de este parámetro es menor que para las variables sólidos totales y grasa como lo reportado (Briñez et al, 2002). El pH es una prueba de rutina a nivel de planta utilizada para deducir la calidad
sanitaria de la leche cruda y para controlar la calidad en productos terminados, el pH de la leche puede variar entre 6.5 y 6.65. Valores distintos de pH se producen por deficiente estado sanitario de la glándula mamaria, por la cantidad de CO2 disuelto; por el desarrollo de microorganismos, que desdoblan o convierten la lactosa en ácido láctico; o por la acción de microorganismos alcalinizantes (Ledezma, 2009). La acidez titulable es una prueba que representa valiosa información sobre la calidad sanitaria del producto (Archundia et al, 2011). La leche es también considerada un excelente medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos banales y patógenos, de allí, que es fundamental mantenerla en óptimas condiciones higiénicas, libre de contaminaciones microbianas, para disminuir en lo posible el riesgo de provocar trastornos de la salud, tratando que llegue al consumidor exenta de sustancias nocivas y sin adulteraciones, garantizando la seguridad de todos aquellos que la consumen (Briñez et al, 2002). Por medio de esta práctica se verificaron las propiedades fisicoquímicas de la leche entera y la leche descremada para determinar su calidad, con el fin conocer, comprender y diferenciar dichas propiedades de los diferentes componentes de la leche, así como el cumplimiento de los estándares exigidos por la normatividad Colombiana, lo cual afirma su buena calidad.
1. MATERIALES Y MÉTODOS Antes de realizar las diferentes pruebas fisicoquímicas se procedió a verificar el volumen real de la leche entera (marca Colanta) y la leche descremada (marca Alpina) mediante una probeta y luego esta se comparó con lo reportado en la bolsa. También se verifico el tipo de leche y su procesamiento, la marca, la fecha de vencimiento, fecha de fabricación y el % de grasa reportado en la bolsa. A continuación se presentas las distintas pruebas fisicoquímicas realizadas:
Prueba TRAM (Tiempo de reducción del azul de metileno) Mediante una pipeta se tomaron 9 ml de leche entera y leche descremada y se colocaron en dos tubos de ensayo respectivamente, luego se les adiciono 1 ml de azul de metileno y se agito hasta has ta que se obtuvo una mezcla homogénea. Después se dejaron los tubos en una gradilla y se tomó el tiempo que tardaba en reducirse el color del azul de metileno de las muestras, indicando esta reducción que hay un alto contenido de microorganismos.
Determinación de Acidez titulable Se tomaron 9 ml de leche, mediante una pipeta y se colocaron en un erlenmeyer. Luego, se le adicionaron de 3 a 4 gotas de fenolftaleína y, a través de una bureta, se llevó a titular con hidróxido de sodio 0.1N se suspendió la adición de hidróxido de sodio hasta que se presentó una coloración rosa, anotando el gasto de hidróxido de sodio.
Los cálculos se realizaron de acuerdo a la siguiente ecuación: % =
× ×
Donde: V b = volumen de NaOH gastado en ml. N = normalidad de la solución de NaOH. milieq= mili equivalente del ácido predominante en la muestra, para ácido láctico es 0,09. Vm = volumen de la muestra en ml.
Analizador Se realizó tomando 20ml de leche entera (Colanta) con una pipeta, la cual se puso en el analizador de leche y este se encargó de arrojar los resultados, tales como el % grasa, punto de congelación, agua adicionada, sales, CHO, temperatura, minerales, proteínas y densidad. De igual manera se hizo para la muestra de leche descremada (Alpina).
Picnómetria Mediante una balanza una balanza analítica, primero se pesó un picnómetro vacío, luego el picnómetro con agua destilada y finalmente el picnómetro lleno con la muestra. El cálculo del valor correspondiente a la densidad de la muestra se realizó con la siguiente formula: =
− −
Donde: Wm: Peso del picnómetro con muestra
Wv: Peso del picnómetro vacío Wa: Peso del picnómetro con agua
Determinación de pH Se colocaron 9 ml de leche en un beaker a través de una pipeta y se midió el pH de la muestra con un potenciómetro por triplicado para mayor confiabilidad de los datos, entre cada muestra el potenciómetro fue enjuagado con agua destilada, para evitar daños en el electrodo.
Lactometria Se vertió 250ml de leche en una probeta y se colocó el lactodensímetro de tal manera que éste no tocara las paredes ni el fondo del recipiente, dejando que flotara libremente por 30 segundos. Posteriormente se realizó la lectura de la densidad y la temperatura tomando como base la parte superior del mecanismo.
Prueba de Alcohol
Una coloración roja se reporta como negativo y una coloración rojo-violeta positivo.
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN A continuación se presentan los valores obtenidos en la verificación del volumen real y el volumen reportado por la bolsa para la leche entera y descremada (Ver tabla 1), así como otros aspectos como la marca y tipo de leche, fechas de vencimiento y fabricación, y el contenido de grasa reportado por la bolsa (Ver tabla 2):
Tabla 1. Verificación del volumen de la leche entera y descremada. Leche Vr (ml) Vb (ml) Entera 920 900 Descremada 1075 1100 Vr= Volumen real, Vb= volumen de la bolsa
Se tomó 2 ml de leche con una pipeta y se depositó en un tubo de ensayo, luego se agregó 2ml de Alcohol al 68% y se invirtió el tubo 1 o 2 veces. Posteriormente se observó la formación de grumos pequeños o grandes, los cuales reportaran como positivos para la prueba de alcohol; en caso contrario estos se reportaron como negativo.
Determinación (Cuantitativo)
en 1000 ml de alcohol a 75 G) y se mezcló bien; observando el color.
de
Neutralizantes
En dos tubos de ensayo se colocaron, por medio de una pipeta, 2 ml de leche entera y leche descremada respectivamente, luego se les agregaron 3 ml de la solución de alizarina (Se prepara 0.5 g. De alizarina
Se evidencio que los valores de referencia del volumen de la bolsa de leche no coincidieron con los valores obtenidos en el laboratorio, esto debido a los márgenes de error que poseen las máquinas de las industrias procesadoras de leche.
Tabla 2. Verificación de otros aspectos. Leche entera Marca Colanta UHT larga vida Ven. 06 Nov. 17 L 2107010113 03377 6g grasa
Leche descremada deslactosada Marca Alpina UHT larga vida Ven. 27 Oct. 17 L APA237989 8 04.23 WP 0% grasa
Prueba TRAM
Determinación de Acidez titulable
Luego de transcurrido el tiempo de análisis (3 horas) se observó que en ambos tubos no hubo una reducción significativa del azul de metileno, indicando que las dos muestras tenían poca presencia de microorganismos. Sin embargo, se pudo evidenciar que la leche entera tenía mayor carga microbiana en comparación con la leche descremada, ya que esta tuvo una mayor reducción del azul de metileno (Ver Fig. 1).
Tabla 3. % de acidez de la leche entera y descremada.
Fig. 1. Prueba TRAM para la leche entera y descremada. Piñeros (citado por Botina y Ortiz, 2013) reporta que el tiempo de reducción del azul de metileno, es inversamente proporcional al número de bacterias. Tiempos de reducción del azul de metileno menores de dos horas significan que la calidad higiénica de la leche es muy pobre, pudiendo llegar a contener 2 a 5 millones de UFC/ml, con lo cual se puede inferir que las leches empleadas en esta práctica tenían una calidad aceptable.
Leche Vb (ml) % Acidez Entera 1.5 0.15 Descremada 1.6 0.16 V b = volumen de NaOH gastado en ml.
El valor de la acidez de la leche entera y la leche descremada fue de 0.15 y 0.16% de ácido láctico, el cual está dentro del rango aceptado según el decreto 616 de 2006, que va desde 0.13 a 0.17% ácido láctico para leche entera y descremada UHT. Por esto, se puede afirmar que estas leches no iniciaron un proceso de acidificación ya que su valor no fue superior al rango anterior. Cabe mencionar, además que esta leche seguramente no le añadió agua ni contenía sustancias alcalinas al no estar el valor de la acidez por debajo del rango mencionado.
Analizador Tabla 4. Resultados de la leche entera y descremada obtenida en el analizador de leche. Análisis % Grasa Punto de congelación Agua adicionada Sales CHO Temperatura Minerales Proteínas Densidad
L. E 3.34 -0.459
L. D 0 -0.500
11.73 0.65 3.73 22.7 7.63 2.59 1.02628
3.84 0.70 4.45 23.1 8.57 3.46 1.03166
L. E=leche entera, L. D= leche descremada.
Un aspecto a destacar del cuadro anterior es sobre el punto de congelación. El decreto 616 de 2006 establece que el punto de congelación tanto para la leche entera como para la descremada UHT es de 0.540 y -0.510, habiendo un incumplimiento para ambas leches. Este resultado es similar a lo reportado por Arango y Moreno (2013) para el caso de la leche entera marca Colanta, con un punto de congelación de -0.3, en donde dichos valores indican que hay un porcentaje de agua adicionada ya sea intencional o por razones de procesamiento. Cuando se le agrega agua a la leche, se diluyen sus solutos y el punto de congelación aumenta, acercándose al del agua (0). El aumento en el punto de congelación es proporcional a la cantidad de agua adicionada (Cátedra de Ciencia y Tecnología de la Leche, 2002). Debido a lo anterior, se puede inferir que los niveles bajos de los sólidos no grasos (proteína, lactosa y minerales) para el caso de la leche entera se deben a dicha adición de agua que tiene esta. En cuanto a la densidad, la leche descremada cumple con el decreto 616 de 2006 al igual que en la prueba de lactometria, sin embargo no cumple para el caso de la leche entera, en donde el rango de cumplimiento esta entre 1.0295 a 1.0330 g/ml. Por otra parte, se pudo evidenciar que el porcentaje de grasa arrojado por el analizador coincide con lo reportado en las bolsas de leche para ambos casos. casos .
Picnometria Se evidencio que la densidad fue la misma para ambas muestras (1.01 g/ml), siendo el peso del picnómetro vacío 17.8g, con la leche entera y descremada 28.9g y con el agua destilada 28.8g. Dicha densidad no coincide con los datos obtenidos por el lactodensímetro, con lo cual se puede decir que los valores obtenidos por este último método resulta más exacto que por el método del picnómetro. Se debe tener en cuenta que la densidad por sí sola no puede revelar la adulteración, ya que una leche a la vez desnatada y agregada de agua puede tener una densidad normal. La densidad de la leche puede disminuir por la adición de agua, descremado o por aumento de la temperatura, por el contrario aumenta con la adición de fécula y al disminuir la temperatura (Botina y Ortiz, 2013).
Determinación de pH Tabla 5. pH de la leche entera y descremada. pH 1 2 3 Promedio
L. E 7.25 7.23 7.24 7.24
L. D 7.28 7.29 7.19 7.253
L. E=leche entera, L. D= leche descremada.
Según Cárdenas (2013), la acidez de muestras sometidas al proceso de UHT debe ser muy cercana a 7 (entre 6,60 a 6,70), ya que el ácido láctico se produce por la degradación microbiana de los componentes de la leche y con la ultra pasteurización (UTH) la concentración de
microorganismos es casi nula y por ende se le conoce también a esta leche como de larga vida. Por lo anterior, se puede decir que los valores de pH para la leche entera y descremada de 7.24 y 7.253 respectivamente, presentaron valores mayores a 7 debido a posibles fallas en el aparato o por una inadecuada calibración del mismo.
Lactometria Tabla 6. Medida de densidad y temperatura de la leche entera y descremada en el lactodensímetro. ρ Leche T (ºC) Entera 1.030 25 Descremada 1.034 24
ρ=densidad, T=temperatura
Se encontró que la densidad para la leche entera y descremada a temperatura entre 25ºC y 24ºC fue de 1.030 y 1.034 grados de densidad respectivamente. La densidad de la leche está directamente relacionada con la cantidad de grasa, solidos no grasos y agua que contenga la leche. De acuerdo al decreto 616 de 2006 dispuesto por el Ministerio de la Protección Social plantea los parámetros fisicoquímicos que debe presentar la leche entera UHT para este parámetro, con un rango de 1.0295 g/ml a 1.033 g/ml, y la leche descremada UHT, con un rango de 1.033 g/ml a 1.036, cumpliendo en este caso con la norma para ambas leches.
Prueba de Alcohol En la prueba de alcohol las leches resultaron negativas, puesto que no se
observaron partículas de cuajada en la pared del tubo de ensayo, cumpliendo con la legislación colombiana según el decreto 616 de 2006 en el cual menciona que debe presentar estabilidad proteica en presencia presen cia de alcohol 68% m/m o 75% v/v.
Determinación (Cuantitativo)
de
Neutralizantes
Con respecto al test de neutralizantes este dio negativo para ambos tipos de leche (entera y descremada) por la presencia de un color rojo, indicando que la calidad composicional e higiénica de la leche es correcta.
4. CONCLUSIONES. Las propiedades fisicoquímicas de la leche, dependen fundamentalmente de la composición de la misma. Dicha composición varia, según la raza, estado de lactación, tipo de alimentación, estado de salud y edad etc. La materia grasa es el componente principal que se ha de analizar y determinar, pues este es el dato que servirá de base para la estandarización de los múltiples procesos industriales. La densidad de la leche entera (UHT), y leche descremada están dentro del rango permitido según el decreto 616 de 2006. Por lo tanto, se infiere que estos dos tipos de leche cumplen con la normatividad establecida por el ministerio de la protección social.
5. BIBLIOGRAFÍA
Acevedo, A. y López, D. (2011). Verificación de los métodos para el análisis proximal en leche entera en el laboratorio de análisis de aguas y
alimentos de la universidad tecnológica de Pereira (Tesis de pregrado). Universidad Tecnológica de Pereira, Pereira. Arango, S. y Moreno, G. (2013). Determinación de la adulteracion de la leche con agua y sacarosa. Recuperado de https://prezi.com/bwphcsx7sfko/deter minacion-de-la-adulteracion-de-laleche-con-agua-y-sacarosa/ Botina, E. y Ortiz, D. (2013). Evaluación de la calidad fisicoquímica, composicional y microbiológica de la leche cruda comercializada en el corregimiento de Catambuco (Tesis de pregrado). Universidad de Nariño, San Juan de Pasto. Brousett, M., Torres, A., Chambi, A., Mamani, B. y Gutiérrez, H. (2015). Calidad fisicoquímica, microbiológica y toxicológica de leche cruda en las cuencas ganaderas de la región Puno-Perú. Scientia Agropecuaria vol.6 (3). Cárdenas, E. (2013). Análisis de acidez total, densidad, pH, conductividad y propiedades organolépticas de leche entera UHT nutri leche. Pontifica Universidad Católica del Ecuador, Quito, Ecuador. Archundia, M., Domínguez, M., Martínez, T., Medizabal, A., Ramirez, S. y Sánches, K. (2011). Pruebas químicas de la leche. Recuperado de http://analisisquimicosdelaleche.blog spot.com.co/2011/11/analisisquimicos-de-la-leche.html Cátedra de Ciencia y Tecnología de la leche. (2002). Determinacion de
adulteración de la leche con agua, cloruros y sacarosa. Universidad del Zulia, Maracaibo. Chacón, F. (2017). Evaluación de los análisis físicos-químicos de la leche bovina (Tesis de pregrado). Universidad Politécnica Salesiana, Cuenca, Ecuador. Briñez, W., Valbuena, E., Castro, G., Fuentes., González, D. y Tovar, A. (2002). Calidad físico química de las principales marcas de leche pasteurizada consumidas en la ciudad ciuda d de Maracaibo. Revista Científica, FCV-LUZ / Vol. XII (3): 221-230. Equipo2. (2008). Análisis bromatológico de la leche bronca. Blog. Recuperado de: http://equipo2alimentos.blogspot.co m.co/2008/12/analisis bromatologico-de-la-leche.html
González, I.; Vega, J. y Castillo, R. (2002). Estudio de la calidad físicoquímico de la leche entera de vaca en un sistema Silvo Pastoril. Tropical and Subtropical Agroecosystems, vol. 1 (1): 25-27.
Ledezma, F. (2009). Análisi de le leche fresca de vaca. Recuperado de http://alimentoslab.blogspot.com.co/2009/01/anlisisde-leche-fresca-de-vaca.html Martínez, G., Fernández, E., Fuentes, I. y Ángulo, A. (2013). Determinación del contenido en grasa de la leche por el método Gerber. Universidad Politécnica de Valencia.
Mercado, M., González, V., Rodríguez, D. y Carrascal, A. (2014). Perfil sanitario nacional de leche cruda para consumo
humano directo. Pontificia Universidad Javeriana.
Ministerio de la Protección Social. Decreto número 616 de 2006. Montoya, J. y Obando, D. (2015). Prueba punto crioscópico. Recuperado de https://prezi.com/ttk8dfi66sbv/prueba -punto-crioscopico/