Química de la leche, Pruebas de Proteínas y Análisis de Aminoácidos Universidad de Costa Rica Facultad de Ciencias Escuela de Química Sección de Química Orgánica Laboratorio de Química Orgánica II QU0255
Estudiante Carne Profesores Asistente
Manrique Cubero Morales A41775 Lic. Graciela Artavia Dr. Víctor Hugo Soto Yulia Yuts
Se realizaron pruebas para el contenido de componentes y el estudio de propiedades de estos componentes componentes a varios tipos de leche (Caso particular: particular: En Polvo Descremada Descremada y Liquida Descremada). Los carbohidratos (Lactosa), grasa (Fosfolipidos) y proteínas (Caseína) de la leche leche fuero fueron n sepa separad rados os segú según n un esque esquema ma de sepa separac ración ión para para obte obtener ner de ellos ellos un porcentaje de rendimiento y caracterización. Además se llevaron a cabo diferentes pruebas de caracterización de proteínas, tales como las Pruebas de Biuret, Xantoproteica, Millon, para Azufre. Estas pruebas se le aplicaron a la caseína extraída en la práctica. Por otra parte se obtuvo ácido múcico a partir de la leche, posterior a un tratamiento con ácido acético y ácido nítrico.
Introducción
Las prot roteín eínas son son macrom romoléc olécu ulas formadas por cadenas de alrededor de 20 diferentes aminoácidos, unidos entre sí por medio de enlac nlaces es peptídicos y se encuent encuentran ran como como mezclas mezclas comple complejas jas en los los teji tejido doss orgán orgánic icos. os. Su separ separac ació ión n en fracciones fracciones con característi características cas moleculares moleculares definidas definidas ha permitido permitido alcanzar un enorme cono conoci cim mient iento o sobr sobre e sus sus funci uncion ones es y 1 estructuras. Estas macromoléculas poseen prop propie ieda dade dess y cara caract cter erís ístitica cass que que las las diferencian unas de otras y por medio de dichas propiedades, pueden ser separadas y aisladas de sus fuentes.2 Las proteínas se clasifican en dos tipos prin princi cipa pale less segú según n su comp compos osic ició ión: n: en proteínas simples y conjugadas . Las prote proteín ínas as simp simple less form forman an amin aminoác oácid idos os cuan cuando do se hidr hidrol oliz izan an,, en camb cambio io las proteínas conjugadas producen amin aminoá oáci cido dos, s, carb carboh ohid idra rato tos, s, gras grasas as o
ácidos nucleicos. Estas últimas son más comunes que las proteínas simples.3 Otra manera de clasificar las proteínas es según su forma tridimensional, en proteínas globulares o fibrosas . Las prote proteín ínas as globu globular lares es son aquel aquella lass que tienden a agregarse en formas esferoidales esferoidales y no establecen establecen interaccione interaccioness intermoleculares como son los puentes de hidrógeno, siendo solubles en agua. Por ejemplo la hemoglobina y la insulina. 4 Las Las prot proteí eína nass fibro ibrosa sass cons consis istten en cadenas cadenas de polipé polipépti ptidos, dos, arregla arregladas das en largos filamentos. Son insolubles en agua y muy resist resistent entes. es. Sirven Sirven para para constr construir uir materiales estructurales como los tendones, uñas, músculos; por ejemplo la queratina y el colágeno. 4 La leche leche contien contiene e vitami vitaminas nas,, minera minerales les,, prote proteín ínas, as, carbo carbohi hidra drato toss y lípi lípidos dos.. Los Los únicos elementos importantes de los que carece la leche son el hierro y la vitamina C (Figura 1). 5 3
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McMurry, J. Química Orgánica. 6ª ed., International Thomson: México. 2004. pp. 1009-1012. 2 Morrison, R. T.; Boyd, R. N. Química Orgánica. 5ª ed., Pearson Educación: México. México. 1998. pp. 1342-1343.
Wade, L. J. Jr. Química Orgánica. 5ª ed., Pearson Educación: Madrid. 2004. pp. 1151-1155. 4 Weininger, S. J.; Stermitz, F. R. Química General . Editorial Reverté: Barcelona, España . 1988. pp. 901-944. 5 Ribadeau-Dumas, B; Grappin, R. Milk protein analysis. Le Lait . 1989. pp. 357-416.
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En la leche hay tres clases de proteínas: caseína, lactoalbúminas y lactoglobulinas (todas globulares). La caseína es una proteína conjugada de la leche del tipo fosfoproteína que se separa de la leche por acidificación y forma una masa blanca. Las fosfoproteínas son un grupo de proteínas que están químicamente unidas a una sustancia que contiene ácido fosfórico. En la caseína la mayoría de los grupos fosfato están unidos por los grupos hidroxilo de los aminoácidos serina y treonina. La caseína en la leche se encuentra en forma de caseinato de calcio. La caseína representa cerca del 77% al 82% de las proteínas presentes en la leche y el 2,7% en composición de la leche líquida.5
Figura 1. Componentes de la leche.
La propiedad característica de la caseína es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la caseína cargada negativamente y solubilizada como sal cálcica. Si se añade ácido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza
(los grupos fosfato se protonan) y la proteína neutra precipita.6 El alto número de residuos de prolina en la caseína causa un especial plegamiento en la cadena de proteína e inhibe la formación de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La caseína no contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la caseína frente a la desnaturalización por calor.6 La carencia de estructura terciaria facilita la situación al exterior de los residuos hidrofóbicos lo que facilita la unión entre unidades proteicas y la convierte en prácticamente insoluble en agua. En cambio es fácilmente dispersable en álcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sódico y acetato sódico.6 La función biológica de las micelas de caseína (Figura 2) es transportar grandes cantidades de calcio y fósforo altamente insoluble en forma líquida a los lactantes y formar un coagulo en el estómago para favorecer una nutrición eficiente. Además de caseína, Ca y P, la micela formada también contiene citrato, iones, lipasa, enzimas plasmáticas y suero. Estas micelas ocupan del 6-12% del volumen total de la leche. 7
Figura 2. Estructura de la micela de la
caseína. 6
Miller, D. Química de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley: México. 2001. pp. 33-38. 7 Universidad Pablo de Olavide. Práctica 3: Extracción de la Caseína y determinación del Punto Isoeléctrico . Sevilla, España. http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbio mol/Practica3FQB.pdf. Visitado el 20 de oct del 2010 a las 20 horas.
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Las proteínas que aparecen en el sobrenadante cuando se precipita la caseína en medio ácido son proteínas globulares, hidrofílicas y solubles en agua así como susceptibles de 7 desnaturalización por calor. La caseína se emplea en la industria para la fabricación de pinturas especiales y en el apresto de tejidos, la clarificación de vinos, la elaboración de preparados farmacéuticos y la fabricación de plásticos. Parte Experimental
Para esta practica de laboratorio, no se hizo uso de ningún tipo de equipo especial. Los reactivos utilizados fueron proporcionados por la Proveeduría de la Escuela, y no se realizaron purificaciones de ninguno de ellos antes de la práctica en mención. Se siguió el procedimiento descrito por Pérez y Lamoureux en su “Manual de Practicas para laboratorio, para el curso de Química Orgánica I”. Se extrajo de la leche ácido múcico por tratamiento de la lactosa obtenida con ácido nítrico. También se aisló la lactosa por medio de la reacción del HOAC con la caseína y se purifico; asi como se separaron los componentes de la leche para caracterizarlos. Los ensayos realizados fueron: las Pruebas de Biuret, Xantoproteica, Millon, para Azufre. Lactosa
IR (fase KBr) (cm-1) 3379; 2900; 2394; 1426; 1116; 1094; 1035; 899; 876; 778. 1 H NMR: (400 MHz, CDCl 3) δ (ppm) 5.23 (d); 4.80 (s); 4.45 (d); 3.30 (t); 3.50 – 4.0 (m). Acido Mucico
IR (fase KBr) (cm-1) 3293; 2633; 1720; 1420; 1294; 1117; 1059; 919; 861; 799; 668.
Resultados Cuadro I. Síntesis del Ácido Múcico a partir de
Leche y ácido nítrico. O
HO
O
O HO
OH
HNO3
OH
2
OH
OH
O
OH
Reactivos Formula Limitant e Masa de muestra (g) Volumen (mL) Mol de reactivo Masa de reactivo (g) Concentr ación (mol/L)
OH
Productos C12H22O11
HNO3
Si
No
4,80
---
100 mL(*)
12 mL
687,1 μmol
687,1 μmol
235,2 mg
43,3 mg
---
5,0
(*) Tomando en cuenta que la porción diaria es de 250 mL con un valor de 12 g de carbohidratos. Por consiguiente para 100 mL = 4,80 g
Formula Equivalente s Masa esperada (g) Mol esperados Masa medida (g) Masa de producto (g) Mol de producto Porcentaje de rendimiento (%)
C6H10O8
2 288,78 mg 1,37 mmol 160 mg 160 mg 761,4 μmol 55,40
Cuadro II. Masas y porcentajes de recuperación
de otros compuestos aislados en el laboratorio. Compuesto
Lactosa Grasa Caseína
Masa Recuperada (g)
Masa Esperada (g)
Porcentaje de rendimiento
0,16 0,91 2,10
2,10 0,04 2,10
7,72% 227% 100%
Resultados de las pruebas de caracterización aplicadas a la muestra de caseína aislada. Cuadro
III.
Prueba
Resultado/Observaciones
Biuret Xantoproteica Millon Azufre
Positivo; azul-morado Positivo; Coloración amarilla Positivo; Precipitado rojo Positivo; Precipitado negro
Discusión
Dentro del esquema de separación de la leche (Figura 3) el primer paso es la separación de las proteínas y grasas de los carbohidratos (lactosa). Primeramente se disuelve la leche en agua y se calienta a 40 °C. Después se agrega poco a poco ácido acético al 10% para acidificar la leche en polvo, y alcanzar el punto 3
isoeléctrico del caseinato de calcio (pI = 4.6). Como en toda proteína, al alcanzarse el punto isoeléctrico existe una igualdad de cargas por lo que es una molécula neutra y se hace insoluble en disolventes polares, induciendo la precipitación. Al precipitar la caseína y otras proteínas, se forma un aglomerado blanco apolar fácilmente filtrable. En este aglomerado van adsorbidas las moléculas de grasa por lo que con solo la adición de ácido acético se separan estos dos componentes. En la mezcla ácida restante quedan disueltas trazas de proteínas y la lactosa. Para separar los triglicéridos y otras grasas de la leche del sólido de la caseína se agrega éter etílico para que disuelva los triglicéridos y todos los demás componentes apolares de la mezcla. En este momento es necesario agitar bien porque la caseína tiene adsorbidas las moléculas de grasa y al estar como un aglomerado semisólido es difícil poder asegurar la extracción completa de las grasas. En este punto ya se separaron la caseína (sólida) y las grasas (disueltas en éter etílico). La acetona se emplea como disolvente de la reacción.
Figura 3. Esquema de separación de los
componentes de la leche
En la separación de los componentes de la leche, el procedimiento que resulto mas fácil fue el de la obtención de la caseína (en forma de caseinato de calcio), debido a que se encuentra en una gran cantidad.
Figura 4. Reacción del ácido acético con
el caseinato de calcio para la formación de caseína sólida. A este sólido obtenido, correspondiente a la caseína, se le aplicaron una serie de pruebas para determinar la naturaleza de los grupos funcionales presentes en la misma, el análisis correspondiente es el siguiente: El reactivo de Biuret está formado por una solución de sulfato de cobre en medio alcalino, este reconoce el enlace peptídico de las proteínas mediante la formación de un complejo de coordinación entre los iones Cu2+ y los pares de electrones no compartidos del nitrógeno que forma parte de los enlaces peptídicos, lo que produce una coloración violeta. Según la intensidad del color del complejo formado, se puede estimar el número de enlaces peptídicos que hay en la proteína. Para sustancia con numerosos enlaces peptídicos se esperaría un complejo morado intenso, indicando que estas proteínas contienes muchos enlaces peptídicos, es decir, son cadenas polipéptidos muy largas. Para la caseína extraída, el complejo obtenido fue de color celeste/morado claro, debido a que esta proteína no contiene muchos enlaces peptídicos. Esta prueba no es exclusiva para identificar péptidos, sino que forma complejos con otros compuestos nitrogenados. A pesar de lo anterior, las aplicaciones de este método no solo van en el ámbito de la mera identificación visual de los enlaces peptídicos, también es posible utilizar Biuret para cuantificar la cantidad de 4
proteína presente en una determinada matriz. Otros métodos para cuantificar esto podrían ser la determinación de nitrógeno por Kjeldahl o la titulación con formaldehído.8 CuSO4 NaOH
PROTEÍNA
COMPLEJO VIOLETA
BAX ANTOPROTEICA
HNO3
PROTEÍNA
COLORACIÓN NARANJA
BADE M ILLON
PROTEÍNA
HNO3 Hg(NO3)2
COLORACIÓN ROJA
EBAP ARA AZUFRE S
CH 2
S NH
CH2 HN C
O
CH
CH
HN
C
O
1. NaOH
PbS
2. Pb(OAc)2 NH
Figura 5. Reacciones de pruebas de
identificación cualitativa para las proteínas. La prueba Xantoproteica reconoce los grupos aromáticos presentes en las proteínas, o sea, aquellas proteínas que contengan tanto tirosina como fenilalanina, con el cual el ácido nítrico forma compuestos nitrados amarillosanaranjados, la intensidad del color depende de la cantidad de grupos aromáticos presentes en la molécula. La prueba de Millón identifica residuos fenólicos en las proteínas, es decir, aquellas proteínas que contengan tirosina. Las proteínas que dan prueba positiva ante este reactivo, se precipitan por acción de los ácidos inorgánicos fuertes del mismo (HNO3, Hg(NO3)2 y HgNO3), dando un precipitado blanco que gradualmente se vuelve rojo, al calentar. Al igual que en las pruebas anteriores, la coloración del precipitado de esta prueba 8
Revilla, A. Tecnologías de las Leche: Procesamiento, manufactura y análisis. 2da Ed. CIDIA. San José, Costa Rica. pp. 7 – 40.
va a depender de la cantidad de residuos fenólicos presentes en la proteína, entre más fenoles haya, el precipitado será cada vez más rojo. Las pruebas Xantoproteica y de Millón están muy relacionadas entre sí, mientras con una se determina la presencia de residuos aromáticos, en la otra determina si tales compuestos aromáticos son fenólicos o no. La presencia de azufre en las proteínas se determina por medio de la prueba para Azufre. En dicha prueba se rompe el enlace disulfuro con NaOH y luego se precipita el azufre con el acetato de plomo, dicho precipitado es de color negro (PbS). La síntesis de ácido múcico, cabe destacar, depende directamente de la cantidad de lactosa presente en la reacción (Cuadro I), se producen 2 equivalentes del mismo al reaccionar la lactosa con el ácido nítrico. Se obtuvo un sólido amarillento, lo cual difiere de lo esperado (Sólido cristalino blancuzco), esto puede deberse a otros componentes de la leche no tomados en consideración (Ver Figura 1). Se podría determinar de manera mas eficiente la cantidad precisa de cuanto ácido múcico mediante la determinación de la cantidad precisa de lactosa presente en una muestra, esto podría lograrse al utilizar métodos analíticos como polarimetría, cromatografía o valoraciones con ácido pícrico o tricoloroamina. En este caso particular se utilizó leche descremada, que difiere en la leche normal debido a que es eliminada una gran mayoría de su contenido graso, en la mayoría de los casos se utilizan procedimientos de separación que involucran el hecho básico de la diferencia de gravedad especifica entre la grasa y el resto del producto lácteo. Actualmente también se utilizan medio mecánicos de centrífuga para realizar esta separación. El uso de este tipo de leche es muy factible porque reduce el procedimiento enormemente, las extracciones con 5
éter/acetona son reducidas significativamente debido a lo anterior. También puede ser una razón para que otras sustancias liposolubles pueda que hayan permanecido en el sólido graso final y por ello el porcentaje de recuperación excediera lo esperado. En el caso del análisis con espectroscopia 1 H-RMN, las señales entre 3.5 – 4.0 ppm corresponden a los múltiples protones de los grupos OH ligados a las estructura molecular de la lactosa. La señal a 3.3 ppm corresponde a los hidrógenos α al puente glucosídico en el componente correspondiente a la galactosa. La señal a 4.5 ppm corresponde al hidrogeno en posición 2 del componente galactosa. A 4,8 aparece una señal correspondiente al agua. En 5,23 ppm aparece una señal correspondiente al hidrogeno α al enlace glucosídico en el componente glucosa.
En esta práctica no se determinó la pureza de la caseína extraída, aunque basándose en los resultados, el producto obtenido contenía otras sustancias aparte de la caseína. A pesar de todas las limitaciones, las pruebas de identificación de las proteínas dieron los resultados esperados.
Conclusiones
La leche es un complemento alimenticio muy importante por su alto contenido de aminoácidos esenciales, vitaminas, minerales, carbohidratos y grasas. La caseína es uno de los componentes mayoritarios en la leche, junto con las grasas, el agua y la lactosa. La composición de la leche varía de acuerdo al mamífero que la sintetice. La leche puede separarse en sus componentes principales de una manera muy sencilla, al adicionarse HOAc, en conjunto con otros reactivos orgánicos comunes. Una mezcla de varios componentes puede ser separada por medios simples tan sólo controlando el pH y luego la polaridad/proticidad de los disolventes utilizados, de manera que ciertos compuestos precipiten y otros no, obteniendo así una mezcla fácilmente separable por medio de filtración, decantación, centrifugación o una combinación de estas. 6
