ANALISIS DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS BASADOS EN TECNICAS DE CULTIVO Este proceso es muy importante por que nos permite el estudio integro de la comunidad microbiana, a este procedimiento se le conoce como enriquecimiento. Este proceso es muy importante porque se obtiene cultivos para estudios detallados y controlados de laboratorio y para su aplicación en biotecnología y microbiología industrial que es la que nos interesa más a nosotros. Tomando en cuenta que una comunidad microbiana es la mayor unidad biología en una jerarquía ecológica conformada por individuos y poblaciones; están viven en un habitad determinado de ahí es donde podemos citar el proceso medio de cultivo o enriquecimientos, ya que cada comunidad bacteriana solicitan un medio especial para vivir ahí. Un medio de enriquecimiento es un medio de cultivo que contiene los nutrientes necesarios para apoyar el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos. Ciertos organismos no crecen en medios de cultivo ordinarios. Requieren ingredientes que promueven el crecimiento como la sangre, glucosa, suero, huevo, entre otros. Algunos ejemplos de medios de cultivo de enriquecimiento son:
Agar sangre Agar CLED Agar McConkey Agar chocolate Agar sabouraud Caldo selenito
TECNICA DEL ENRIQUECIMIENTO
CULTIVO
DE
Este método requiere que el medio de cultivo y las condiciones de incubación sean selectivos para el organismo que se desea aislar y contra selectivos para los organismos no deseados. Por tanto se necesita reproducir lo más fielmente posible los recursos y las condiciones que se dan en este nicho ecológico y buscar luego los habitantes potenciales de aquel hábitat capaces de desarrollarse en las condiciones de enriquecimiento seleccionadas. Para que un cultivo de enriquecimiento tenga éxito es necesario contar con un inóculo apropiado (una muestra que contenga el microorganismo). Por tanto, la metodología del cultivo de enriquecimiento se inicia con la elección del hábitat adecuado. El cultivo de enriquecimiento suele establecerse sembrando el inóculo directamente en un medio altamente selectivo; muchos de los procariotas más frecuentes pueden aislarse de esta manera. Tanto el medio de cultivo como las condiciones de incubación son críticos para que tenga éxito un cultivo de enriquecimiento; es decir deben optimizarse tanto los recursos como las condiciones para tener las mejores posibilidades de enriquecer el microorganismo que interesa. La Xylella Fastidiosa es una bacteria fitopatogena, de la clase protobacteria con gran potencial de daño económico. Ataca sin curación en la actualidad a diversas plantas de utilidad económica como el olivo, almendro, melocotón y el limonero asi como otros que no producen frutos como el laurel la mecion de esta bacteria es que este es uncaso de bacterias que es complica de aislar y cultivar de en laboratorio, de donde deriva el adjetivo de FASTIDIOSA. Asi como la anterior bacteria mencionada hay muchas que el ser humano no puede controlar de ahí es que tenemos enfermedades aun sin cura, si no lo retrasan la enfermedad.
LA COLUMNA DE WINOGRADSKY Este es un dispositivo simple que permite el cultivo de una gran diversidad de microorganismos. Este aparato consiste en una columna llena de agua y fango con una fuente de carbono organico y otra de azufre. Incubando esta columna bajo luz solar durante meses, se forma un gradiente de oxigeno y otros de sulfuros, que determinan una amplia variedad de ambientes en las que se disponen diferentes especies de microorganismos. El funcionamiento general de la columna de Winogradsky es una demostración clásica de como los microorganismo ocupan microespacios altamente específicos de acuerdo con sus tolerancias de acuerdo con sus tolerancias medioambientales y sus necesidades vitales y que , además, ilustra como diferentes microorganismos desarrollan sus ciclos , y la interdencia que llega a existir entre ellos. Esta columna es un sistema completo y autónomo de reciclado, mantenido solo por energía de la luz. La columna se enfoca sobre todo al ciclo del azufre, pero podría desarrollar igualmente la reproducción de otros ciclos biogeoquímicos equivalentes para nitrógeno, carbono y otros elementos.
En una columna de Winogradsky típica se desarrolla una mezcla de organismos. Las algas y cianobacterias ocupan rápidamente la parte superior y al producir O 2 ayudan a mantener esta zona óxica. El proceso de descomposición en el sedimento lleva rápidamente a la producción de ácidos orgánicos, alcoholes y H 2, sustratos adecuados para las bacterias sulfato reductoras. El sulfuro producido por las bacterias sulfato reductoras provoca el crecimiento de bacterias rojas y verdes del azufre. Estos organismos aparecen generalmente como zonas de crecimiento en el lodo de la columna, pero también pueden desarrollarse profusamente en el agua si los fotótrofos oxigénicos son escasos. Para el muestreo de bacterias fototróficas de la columna se introduce una pipeta larga con la que se recoge un poco de lodo o agua coloreada. Estas muestras se pueden usar para microscopía y para inocular medios de enriquecimiento para aislamiento y caracterización.
SESGO EN EL ENRIQUECIMIENTO Aunque el cultivo de enriquecimiento es una herramienta poderosa, en muchos casos se produce un sesgo en el enriquecimiento. En los cultivos líquidos de enriquecimiento típicos, el organismo más adaptado a las condiciones escogidas puede convertirse en la población dominante. Desgraciadamente, el organismo mejor adaptado en los cultivos de laboratorio a menudo es sólo un componente minoritario del ecosistema microbiano, en lugar de ser el mayoritario o el más relevante desde el punto de vista ecológico. El sesgo en el enriquecimiento puede demostrarse cuando se comparan los métodos de dilución con el clásico enriquecimiento en líquido. La dilución del inóculo seguida de un enriquecimiento a menudo da lugar a un organismo diferente que cuando se enriquece un inóculo sin diluir. Se cree que la dilución elimina aquellas poblaciones minoritarias pero de rápido crecimiento, dando de este modo la oportunidad de desarrollarse a otros miembros de la comunidad. Por tanto, la dilución del inóculo es una práctica común en el cultivo de enriquecimiento en la microbiología actual. AISLAMIENTO EN CULTIVO AXÉNICO Los cultivos axénicos (o puros) se pueden obtener de muchas maneras a partir de un enriquecimiento, un cultivo axenico consiste en una sola especie microbiana proveniente de una sola celula; los métodos empleados más frecuentes son la siembra por estría en superficie (en placa petri), la siembra en profundidad (agar shake) y la dilución en líquido. Para aquellos microorganismos que crecen bien en medio de cultivo sólido (con agar), el método de elección es la siembra por estría. A partir de una población mixta, mediante la siembra por estría se obtienen colonias separadas; repitiendo esta técnica con una de estas colonias aisladas se consigue un cultivo
axénico, que puede ser transferido a un medio líquido. Las placas sembradas de este modo e incubadas en las condiciones adecuadas (por ejemplo en una jarra anóxica para anaerobios) nos permiten aislar tanto microorganismos aerobios como anaerobios. Proedimiento para una siembra por estrías:
SIEMBRA EN PROFUNDIDAD Y NÚMERO MÁS PROBABLE El método de siembra en profundidad consiste en la dilución de un cultivo mixto en tubos de agar fundido; cuando el agar solidifica, las colonias se desarrollan embebidas en el tubo de agar en vez de en la superficie, como ocurre en la siembra por estría en placa. Es un método de gran utilidad para purificar determinados tipos de microorganismos anaerobios, por ejemplo, las bacterias fototróficas del azufre y sulfato reductoras de las columnas de Winogradsky. Es posible obtener cultivos axénicos mediante diluciones sucesivas de una suspensión de células en tubos de agar fundido. A partir de una colonia crecida en el tubo de mayor dilución utilizada como inóculo, se puede volver a hacer otro banco de diluciones, de tal manera que se acabe obteniendo un cultivo axénico. Un procedimiento similar sin usar agar es la dilución seriada de un inóculo en un medio líquido hasta que el tubo o tubos finales de la serie no muestran crecimiento.
Utilizando diluciones seriadas de diez en diez, por ejemplo, el último tubo que muestre crecimiento tiene que haberse originado a partir de 10 células o menos. Si se repite varias veces este proceso se obtienen cultivos axénicos. Esta técnica se conoce como la Técnica del Número Más Probable (NMP). La Técnica del NMP se usa para estimar el número de microorganismos en alimentos, aguas residuales y en otras muestras donde hay que evaluar rutinariamente el número de células. Se puede hacer con medios altamente selectivos y condiciones de incubación dirigidos a uno o a un pequeño grupo de organismos, como por ejemplo un determinado patógeno, o usando un medio complejo para obtener una estimación del número total de células. Con independencia del método utilizado para purificar el cultivo, una vez obtenido un supuesto cultivo axénico es esencial comprobar su pureza. Se utiliza para ello una combinación de técnicas microscópicas, observación de las características de la colonia en placas, o en siembras en profundidad en tubo, y comprobación del crecimiento en medios donde el microorganismo que nos interesa aislar crece muy poco, pero que favorecen el crecimiento de los microorganismos acompañantes. La observación microscópica de un solo tipo morfológico de célula, junto con unas características uniformes de la colonia y ausencia de contaminación en test con diversos medios de cultivo, puede tomarse como prueba de que un cultivo es axénico (puro). Debemos tener en cuenta que este método se usa para contar microorganismos difíciles de cultivar en medio solido, o para determinar el numero de células que pueden crecer en un medio liquido determinado, como el análisis para determinar la contaminación del agua potable, determinando el numero de bacterias Escherichia coli que pueden crecer en un medio con lactosa. La presencia de E. coli en el agua potable es una prueba de contaminación. En microbiolagia , el método se emplea habitualmente realizando diluciones en serie de un cultivo de bacterias en un medio de crecimiento, y luego divisiones adicionales en serie hasta obtener partes alícuotas. Los cultivo son incubados y evaluados a ojo, eludiendo el tedioso recuento de colonias, o caro y tedioso recuento microscópico. En biología molecular, una aplicaion habitual se da en las pastillas de ADN diluidas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
A continuación procedimiento animado del NMP:
CULTIVOS AXÉNICOS DE ALTA TECNOLOGÍA: LAS PINZAS DE LÁSER Además de los métodos clásicos descritos, los avances tecnológicos han permitido la utilización de nuevas herramientas para la obtención de cultivos axénicos; una de ellas son las pinzas (ópticas) de láser. Las pinzas de láser consisten en un microscopio óptico invertido equipado con un láser infrarrojo enfocado con precisión y un instrumento de micro manipulación. Una célula individual del campo de visión es atrapada por el haz de rayos laser y separada del resto de microorganismos. La célula queda atrapada por que la fuerza creada por el láser que empuja hacia abajo los objetos pequeños (como las células microbianas) y los mantiene en el lugar; cuando el haz de láser se desplaza, las células atrapadas se mueven junto con él. Si la muestra está en un tubo capilar, se atrapa una única célula que después se aísla rompiendo el tubo en un punto entre la célula y el resto de la población. La célula recogida se introduce entonces en un tubo pequeño de medio estéril para iniciar su crecimiento como cultivo axénico. La tecnología de pinzas de láser es especialmente útil para el aislamiento de bacterias de desarrollo lento, que pueden ser superadas por el desarrollo rápido de otras poblaciones en los cultivos de enriquecimiento típicos, o para los organismos presentes en números tan bajos que podrían perderse con los métodos de enriquecimiento a partir de la dilución. Y junto con el uso de tinciones específicas capaces de identificar organismos determinados en un campo del microscopio, las pinzas de láser se emplean para seleccionar organismos a partir de una mezcla para su purificación y posterior estudio en el laboratorio.
LAS PINZAS DE LÁSER
LAS PINZAS OPTICAS APLICADAS AL ESTUDIO DE LOS MOTORES BIOLOGICOS Actualmente existen un enorme interés por parte de muchos físicos en estudiar diversos tipos de sistemas biológicos. El estudio de estos sistemas presentan un enorme reto, ya que se trata de los sistemas más complejos que puedan encontrarse en la naturaleza. Esta reciente incursión de los físicos en el estudio de los sistemas biológicos complejos involucra diversas ramas, desde la biología molecular y celular, hasta la ecología, pasando por la genómica, las proteínas, el ADN, la sincronización de ritmos biológicos, las redes neuronales, los fenómenos de auto-organización y las propiedades emergentes en sociedades de insectos, por mencionar algunos campos. En particular, un avance reciente se refiere al estudio del transporte intracelular de las llamadas proteínas motoras, o motores moleculares. Estos motores son proteína que transportan diversas sustancias y vesículas dentro de las células eucariontes y que llevan a cabo muchos tipos de funciones en el organismo. Como ejemplos de proteínas motoras podemos citar a un tipo de miosinas, que son responsables del movimiento de los músculos, o las cinesinas, que se encargan de transportar sustancias dentro de las células y que se desplazan a lo largo del citoesqueleto. Un motor molecular que ha despertado el interés de algunos físicos es un tipo de cinesina que tiene una estructura con dos porciones, que simula una especie de caminante a escala de nanómetros y que alterna las dos porciones, dando como resultado una caminata a lo largo de los microtúbulos que forman parte del citoesqueleto. La cinesina utiliza como fuente de energía la hidrólisis de ATP y como todo sistema biológico, se encuentra fuera del equilibrio termodinámico. Aun cuando el estudio de los motores moleculares ha tenido un avance sorprendente, no es claro el mecanismo mediante el cual la cinesina logra moverse preferentemente en una dirección, ya que las fuerzas que actúan sobre la proteína no tienen una dirección particular, sino que se trata de fuerzas fluctuantes de promedio cero. Desde la perspectiva de la física, estos motores nos llevan a
preguntarnos: ¿Es posible generar transporte unidireccional a partir de fluctuaciones fuera del equilibrio? La respuesta es positiva ya que en un sistema fuera de equilibrio es posible generar trabajo sin violar por ello la segunda ley de la termodinámica. Además de tener un sistema lejos del equilibrio, es necesario romper alguna simetría del sistema para poder rectificar las fluctuaciones.
Conclusiones
Sin duda alguna el método del numero mas probable es una herramienta muy valiosa para nosotros los profesionales ingenieros sanitarios, que debemos manejar con un amplio conocimiento para poder dar soluciones a nuestros problemas hídricos y por ende dar un buen uso a nuestros conocimientos. Hoy en dia hemos desarrollado mucho nuestra tegnologia para poder cultivar bacterias y poder dar solución a nuestras necesidades desde un punto de vista microbilogico, pero aun no nos hemos enfocado del todo en nuestras necesidades básicas ya que hay profesionales que usan estos avances para obrar mal, como por ejemplo nuevas drogas .
