2. Métodos de análisis de aminoácidos en alimentos. alim entos. Métodos oficiales. Determinación de prolina en miel. Reacción de la prolina con ninhidrina en medio ácido y posterior determinación a 517 nm de la absorbancia del compuesto formado. Preparación de la muestra muestra:: Suponiendo que la miel ya ha s ido separada del panel por escurrimiento a través de un filtro de luz de malla, optaremos por realizar el siguiente paso, la homogeneización. Reblandecer la muestra calentando entre 25-30ºC agitándola al mismo tiempo tiempo.. Una vez homogeneizada se calienta a 50ºC al baño María hasta que se consiga la fusión y se deja enfriar rápidamente. Determinación de hidroxiprolina en carnes. Previa hidrólisis en medio ácido de las proteínas y oxidación de la hidroxiprolina. El derivado formado con el p dimetilaminobenzaldehido dimetilaminobenzaldehido se valora colorimétricamente a 560 nm.. Preparación de la muestra: Primero, se quitan las diferentes capas protectoras del producto para poder poder tomar tomar una muestra representativa. Se parten trozos de 0,5 - 1 cm y se cortan dichos trozos en pequeños cubos. Después se pasan por una trituradora varias veces hasta conseguir una mezcla homogénea. Se guarda e n frascos limpios y secos para prevenir la pérdida de humedad. Se conserva en e n refrigeración de forma que evite su deterioro y cualquier cambio cualquier cambio en su composición. Métodos estándares. Determinación de prolina en miel. Determinación de hidroxiprolina en carnes. Determinación de aminoácidos en preparados vitamínicos. Determinación de lisina en s uplementos nutricionales. Los grupos amino de las proteínas reaccionan con DNFB dando lugar a los derivados lisina -DNFB. Posteriormente se produce una hidrólisis ácida y la determinación en un analizador de aminoácidos de la lisina. Determinación de triptófano en alimentos. La muestra es hidrolizada en medio básico, seguidamente se realiza un ajuste de pH. El triptófano es separado por cromatografía líquida de intercambio iónico y determinado por un detector UV a 280 nm. Determinación de aminoácidos sulfurados en alimentos (metionina y cisteína). En primer lugar las proteínas son oxidadas con ácido perfórmico para conseguir ácido cisteico y metionina sulfonada, luego se realiza una hidrólisis ácida con HCl. Realizamos una cromatografía de intercambio iónico aplicándole un detector que sea capaz de medir a 570 nm. Métodos recomendados. Análisis de aminoácidos por HPLC seguido del método del fenilisotiocianato. (Lab. Enzymology and Physical Chemistry of Proteins). A continuación, incluimos incluimos un protocolo típico del análisis de aminoácidos en harinas: - Dejar a reflujo la muestra con HCl 6N durante 24 horas. Evaporar a sequedad en evaporador rotatorio. - Añadir agua Añadir agua y evaporar a sequedad. - Realizar el examen cromatográfico de una solución problema al 10% de la muestra tratada en solución acuosa de isopropanol a 10%. - El sistema solvente: n-butanol/Hac/H2O en proporción 12:3:5. - Soporte papel Whatman nº1. - Longitud del papel 50 cm. - Método cromatográfico descendente. - Duración: 12 horas. - Solución reveladora: solución acetónica de ninhidrina al 0.25%. - Condiciones de revelado: 20 min a 105ºC. - Comparación frente a muestras puras de clorhidratos de aminoácidos. 3. Técnicas de separación de aminoácidos. A menudo es necesario identificar identificar y cuantificar los aminoácidos individuales de de una mezcla, tanto en estudios metabólicos como en las investigaciones de la estructura de las proteínas. El uso de la cromatografía en capa fina o de la electroforesis son adecuados para averiguar el número y la
cantidad relativa de los diferentes aminoácidos presentes en una muestra (análisis cualitativo), aunque para los análisis cuantitativos es necesaria la cromatografía de gases o un analizador de aminoácidos. Cromatografía en capa fina Una importante aplicación de la cromatografía en capa fina es la de servir como guía para el desarrollo de las condiciones óptimas para realizar separaciones por cromatografía de líquidos en columna. Proporciona una idea rápida de los aminoácidos mayoritarios existentes en la muestra. Las ventajas de este procedimiento son la rapidez y el bajo coste de los ensayos experimentales. De hecho, algunas cromatografistas son de la opinión de que los ensayos en capa fina deberían preceder siempre al uso de la columna. En la cromatografía de papel se pueden aplicar grandes volúmenes de muestra, lo que permite la elución posterior de un aminoácido en particular para su posterior purificación y análisis, factor que tiene gran importancia en la identificación de un constituyente desconocido de la muestra. Antes de la realizar la cromatografía, es necesario eliminar las sustancias que interfieren, tales como proteínas, carbohidratos y sales, lo que puede hacerse con una resina de intercambio iónico. Los aminoácidos retenidos pueden eluirse a continuación añadiendo a la columna un pequeño volumen de amoniaco y lavando después con agua destilada. La separación de los aminoácidos se basa en que éstos se reparten de modo diferencial entre la fase móvil y la fase estacionaria. Generalmente se realizan por el procedim iento ascendente: introduciendo el borde inferior de la placa cromatográfica en el eluyente que será succionado por acción de las fuerzas capilares del recubrimiento de la superficie de la placa. La identificación de un aminoácido se realiza comparando los valores de Rf (factor de retraso: cociente entre la distancia recorrida por el compuesto desde el origen y la distancia recorrida por el solvente desde el origen), con otros tomados como referencia, debiéndose utilizar al menos tres sistemas de disolventes distintos para establecer su identidad con un cierto grado de seguridad. La naturaleza de los aminoácidos es un factor importante a la hora de elegir un disolvente, ya que los diferentes solventes pueden permitir una mejor resolución de los componentes ácidos, básicos o neutros. En general, aumentando la proporción de agua en el disolvente se incrementan todos los valores de Rf e introduciendo pequeñas cantidades de amoniaco aumentan los valores del factor de retraso de los aminoácidos básicos. Algunos disolventes contienen compuestos nocivos, por ejemplo el fenol, lo que restringe su uso rutinario. La composición química del disolvente puede también limitar el rango de reactivos de localización que pueden aplicarse satisfactoriamente. Por ejemplo, el ácido sulfanílico no puede utilizarse con disolventes fenólicos. El poder de resolución de la cromatografía de capa fina puede aumentarse empleando técnicas bidimensionales, o sea, utilizando dos disolventes distintos. Se aplica una cantidad de muestra mayor que la utilizada generalmente para la separación cromatográfica de una dimensión (aproximadamente el triple) en una esquina del papel o placa y se hace correr en una dimensión. Entonces el cromatograma se seca completamente al aire, se gira un ángulo de 90º y se desarrolla con el segundo solvente. Tras un nuevo secado, se sumerge en el reactivo de localización elegido. En la cromatografía de dos dimensiones, la composición de los dos disolventes es la que determina el orden en que debe utilizarse . Las separaciones bidimensionales permiten la resolución de un gran número de aminoácidos presentes en una muestra, ya que los que tienen una movilidad similar en la primera dimensión se separan en la segunda. Ésto es muy útil en la detección de los componentes que están en muy baja c oncentración y pueden quedar enmascarados por otros compuestos que tengan una concentración alta c uando se utiliza la cromatografía en una dimensión. Electroforesis. La electroforesis es un proceso en el cual las especies cargadas (iones o partículas coloidales) se separan en función de su distinta velocidad de migración en un campo eléctrico. Desde los años cincuenta, las separaciones electroforéticas fueron la piedra angular de gran parte de la investigación de químicos y biólogos moleculares relacionada con la separación y análisis de p roteínas, polinucleótidos y otros biopolímeros. Estas separaciones han sido (y continúan siendo) muy eficientes y de una extensa aplicación, pero por desgracia, son unas técnicas muy l entas y laboriosas que tienen tendencia a ser poco reproducibles. A mediados de los ochenta, esta situación cambió espectacularmente con la aparición de aparatos comerciales para realizar electroforesis analíticas a microescala en columnas capilares (electroforesis capilar). El hecho de que los distintos aminoácidos transporten diferentes cargas netas a un pH particular, permite separarlos de una mezcla mediante la electroforesis de alto o bajo voltaje. Los medios utilizados más
frecuentes como soporte son el papel o las placas de capa fina (celulosa o gel de sílice), pudiéndose utilizar para visualizar las manchas, los reactivos de l ocalización que describiremos más adelante. Las separaciones se pueden realizar más fácilmente con alto que con bajo voltaje, siendo una de las principales ventajas de la primera, el que las sales y o tras sustancias presentes en la muestra afectan en menor extensión la calidad del electroforetograma. A pesar de que se pueden conseguir separaciones electroforéticas con támpones a distintos pH, en la práctica los valores de pH escogidos están entre 2 y 5’3. A pH 2 todos los aminoácidos tienen carga positiva
y los de tipo básico que tienen la mayor carga positiva migran más rápidamente hacia el cátodo, mientras, que a pH 5 los aminoácidos se dirigen hacia ambos electrodos, dependiendo de la carga transportada. Las separaciones a pH 5’3 se utilizan para determinar la naturaleza ácida o básica de un aminoáci do desconocido. Cromatografía de gases. Se han hecho muchos ensayos para aprovechar la velocidad y sensibilidad que ofrece la cromatografía de gases, pero aunque se han realizado considerables progresos en el desarrollo de tales métodos, aún no se utiliza de forma rutinaria para el an álisis de aminoácidos en muestras biológicas. La razón de ésto radica en el hecho de que los aminoácidos, aunque similares, son compuestos químicamente heterogéneos y además no son suficientemente volátiles a menos que se conv iertan en algún derivado apropiado. Aparecen dificultades no sólo a la hora de elegir el método de obtención de tales derivados, sino también en la selección de una fase estacionaria que sea capaz de resolver los derivados de todos los elementos de un grupo tan diverso de compuestos. A lo hora de elegir el detector aparecen también problemas similares. Analizador automático de aminoácidos - HPLC. Existen dos técnicas para la determinación de aminoácidos a través de cromatografía líquida: cromatografía de reparto en fase reversa y cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía de líquidos de alta resolución es la técnica de separación más ampliamente utilizada. Las razones más importantes son su sensibilidad, su fácil adaptación a las d eterminaciones cuantitativas exactas, su idoneidad para la separación de especies no volátiles o termolábiles y, sobre todo, su gran aplicabilidad a sustancias que son de primordial interés en la industria, en muchos campos de la ciencia y para la sociedad en general. Algunos ejemplos de estos materiales incluyen los aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos y otros. Cromatografía de reparto en fase reversa. La cromatografía en fase reversa c onsiste en un disolvente fundamentalmente polar como fase móvil y una cadena hidrocarbonada ligada como fase estacionaria. Algunas de las ventajas más sustanciales de esta alternativa son su gran reproducibilidad, tiempos de retención cortos, velocidad de muestreo alta, sistema cromatográfico simple y amplio c ampo de aplicación. Por todo ello, las aplicaciones son cada vez más numerosas. La selectividad se basa en las interacciones específicas entre el soluto y la fase móvil, ya sea de tipo polar, de formación de puentes de hidrógeno o mediante equilibrios secundarios provocados al variar la composición de la fase móvil (ácido-base, formación de complejos o pares iónicos, adición de complejos metal-ligando o reactivos quirales para separar los isómeros ópticos, etc.). Cromatografía de intercambio iónico. La cromatografía iónica está relacionada con los métodos modernos y eficaces para la determinación de iones que se basan en el uso de resinas de intercambio iónico. Existen métodos automatizados para la separación y detección de aminoácidos y otras especies iónicas en mezclas complejas. El desarrollo de la HPLC moderna empezó a finales de los años sesenta, pero su aplicación a la separación por intercambio iónico se retraso debido a la inexistencia de un método general y sensible para la detección de especies como los cationes alcalinos y alcalinotérreos, y aniones como los haluros, acetato y nitrato. Esta situación se remedió en 1975 al desarrollarse por técnicos de Dow Chemical Company la técnica de supresión del efluente, la cual hace posible la detección conductimétrica de los iones eluídos. El analizador de aminoácidos, con el que se lleva a cabo la cuantización de los aminoácidos se b asa en esta técnica. Analizador automático de aminoácidos. La separación de aminoácidos fue el primer proceso cromatográfico automatizado con derivatización post-columna. La separación fue llevada a cabo por Moore, Spackman y
Stein (1958), mediante un intercambio iónico, seguido de su cuantización de cada componente eluido de la columna por reacción con ninhidrina y posterior d etección en el visible. Este método se ha realizado durante más de treinta años, en cualquier laboratorio de proteínas. El equipo usado actualmente se basa en el original pero introduciendo algunas modificaciones para conseguir un mejor grado de eficacia. Consiste en bombear tampones de pH o de fuerza iónica variables, a través de una columna termostatizada. Entre las novedades está la fabricación de resinas de alta calidad, desarrollo del HPLC, sistemas de automatización sofisticados y un aumento en la sensibilidad de los métodos de detección. La separación tiene lugar en una columna de resina de poliestireno sulfonado. Inicialmente el pH de la fase móvil es bajo, por lo que los aminoácidos cargados positivamente se verán atraidos por los grupos sulfurosos ( SO3- ). Conforme se va aumentando el pH del támpon los aminoácidos se eluyen diferencialmente al disminuir su carga positiva y ser menos atraidos por el anión. A pH 3.5 los aminoácidos con un grupo ácido extra, de su cadena tendrán muy poca afinidad por l a resina y serán los primeros en salir de la columna, mientras que los que tengan un grupo extra ion izable capaz de transportar una carga positiva (e.g. lisina, histidina) serán retenidos fuertemente por la resina y se eluirán sólo cuando el pH haya aumentado sustancialmente y se haya reducido su carga neta positiva. Además del pH también hay que considerar la concentración del tampón eluyente, pues influye en la elución de tal modo que cuando la concentración de ion aumenta en mismo, los aminoácidos se eluyen más rápidamente. Las interacciones no iónicas entre los a minoácidos y la resina también influyen en la secuencia de e lución, permitiendo que algunos aminoácidos que tienen un comportamiento similar se eluyan de forma separada. La resolución cuantitativa de mezclas de aminoácidos se consigue variando la composición del támpon, bien incrementando del pH y manteniendo constante la concentración, o viceversa, o incluso variando ambos. Hay otros factores menos significativos en la calidad de la s eparación como son la temperatura, la velocidad de flujo del tampón o el tipo de catión utilizado. Aspectos prácticos del analizador: Columna: en los analizadores tipo se usan dos columnas, una para separar los aminoácidos ácidos y neutros y otra para los básicos. Las de vidrio o acero inoxidable dan picos estrechos y altos, mejorando la separación de aminoácido similares. Solución tampón: suele ser citrato sódico o de litio, al que s e le añade un detergente, un antioxidante y un conservante. Actualmente se utilizan dos disoluciones tampón, una ácida y otra básica. Se mezclan en proporciones variables para conseguir un aumento de pH. De esta forma se mejora la separación disminuyendo el tiempo de análisis y se eliminan las fluctuaciones bruscas de la linea base debidas a cambios repentinos en el tampón, como sucedia con anteriores técnicas. Temperatura: puede ser constante para evitar cambios en el pH y en la ionización de los aminoácidos, o bien puede utilizarse un programa de temperaturas que implica un cambio de ésta en diversos momentos del proceso. Flujo de la columna: se requiere un flujo de tampón constante para permitir la reproducibilidad. Se consigue por uso de bombas de presión o de desplazamiento constante. Detección: es necesaria una segunda bomba para el reactivo derivatizante (generalmente ninhidrina) que se ha de mezclar con el eluyente de la columna. Cuando la reacción ha tenido lugar, la corriente se controla en una célula de flujo de un color ímetro o un fluorímetro. Se mide la absorbancia continuamente a 570 y 440 n m. para detectar los amino e iminoácidos respectivamente. El análisis aminoacídico es un buen ejemplo del hecho de que raramente hay un único sistema de separación para problemas analíticos, sino que de la elección del s istema apropiado depende el problema analítico. Por ejemplo, de la matriz en la cual los aminoácidos van a ser determinados, de la sensibilidad deseada y en la velocidad requerida para el análisis. Los actuales métodos de detección para aminoácidos dependen de la reacción del grupo amino primario del aminoácido para formar un derivado coloreado o fluorescente, esta derivatización tiene lugar tanto
antes como después de que la s eparación de los aminoácidos haya sido efectuada. La menor variedad de tipos de aminoácidos en comparación con las estructuras de los péptidos hace que los modos de HPLC disponibles para el investigador sean la cromatografía de intercambio catiónico (CEC), y la cromatografía de fase reversa (RPC). La cromatografía en fase reversa es más apropiada para la separación de derivados aminoacídicos que para aminoácidos libres. La elección de HPLC está limitada por la elección d el agente de derivatización y/o la decisión de usar tanto pre- como post-columna de derivatización, de hecho, algunos de los más interesantes descubrimientos llevados a cabo en la separación de aminoácidos por HPLC reside en el desarrollo y optimización de nuevos agentes de derivatización. Reacciones muy rápidas como la der ivatización con fluorescamina y ortoftaldehido (OPA) están siendo empleadas en aumento con el clásico método de la ninhidrina. Leer más: http://www.monografias.com/trabajos7/amin/amin.shtml#tec#ixzz2YwOgjp00 4. Reactivos de derivatización. El problema de la derivatización de aminoácidos está concentrado en la detección selectiva y sensible de los mismos. Las cantidades de muestra disponibles son muy pequeñas, ya sean proteínas cuya estructura vaya a ser determinada o muestras de investigaciones en el campo de la ciencia alimenticia, de modo que la reacción de derivatización debería permitir la detección en el rango del pmol. La derivatización puede ser llevada a cabo antes de la separación. Debería ocurrir cuantitativamente para producir productos sencillos para cada aminoácido, el reactivo no debería interferir. Es probable que la derivatización genere productos que son más parecidos el uno al otro, de cualquier modo, la a lta selectividad de separación de los sistemas cromatográficos implica que raramente hayaproblemas. La derivatización precolumna puede ser llevada a cabo automáticamente inmediatamente antes de la separación. La derivatización tras la separación requiere, en general, una complejidad instrumental mayor. Los instrumentos comerciales a menudo necesitan ser optimizados para alcanzar sensibilidad de detección más alta. Ninhidrina. La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con los aminoácidos e n medio ácido (pH entre 3 y 4) y en caliente produciendo amoniaco, dióxido de carbono y un complejo de color púrpura azulado. Todos los aminoácidos primarios forman el mismo complejo tras su reacción con ninhidrina, haciendo este agente inapropiado para la precolumna de derivatización. La mayoría de columnas de HPLC de intercambio catiónico utilizadas para el análisis de aminoácidos con postcolumna basada en la ninhidrina todavía e mplean resinas de sulfonato de poliestireno/divinilbenceno. Los primeros sistemas automáticos para el análisis de aminoácidos descritos en 1958 basados en la separación de aminoácidos por cromatografía de intercambio catiónico y posterior reacción con ninhidrina, permanecen hoy día como la metodología más fiable para el análisis de aminoácidos en péptidos y proteínas. Analizadores comerciales basados en esa metodología están disponibles en compañías como Beckman y Pharmacia. A altas temperaturas (³ 100ºC), todos los aminoácidos primarios reaccionan con dos moléculas de ninhidrina para formar un cromóforo (púrpura de Ruthermann) con máxima absorción a 570 nm. En la cuantificación de los aminoácidos individuales puede utilizarse el coeficiente de absorción molar del compuesto coloreado, aunque su valor varía de un aminoácido a otro y debe determinarse para las condiciones particulares del análisis. Sin embargo, se debe escoger un valor de referencia para utilizarlo en la cuantificación de los aminoácidos totales de una mezcla. La reacción coloreada de la ninhidrina se utiliza en trabajos analíticos, así como en la visualización de las bandas de los aminoácidos después de su separación por electroforesis o por cromatografía. El reactivo que se utiliza en estas circunstancias se prepara generalmente disuelto en etanol; cuando se añade 2,4-6colidina, las diferencias de color entre cada mancha ayudan a la identificación de los distintos aminoácidos. OFtaldehido (OPA). El OPA fue originalmente introducido como un reactivo alternativo a la ninhidrina en la postcolumna de derivatización y suministró un significante incremento en la sensibilidad. Los aminoácidos reaccionan con el OPA en presencia de un reductor fuerte, en condiciones alcalinas (pH 9-11), dando un compuesto
fluorescente. La separación en fase reversa seguida de detección fluorescente constituye un métodode detección rápido, sensible y selectivo para todos los aminoácidos con grupos amino primario. Los péptidos son menos reactivos que los -aminoácidos y las aminas secundarias no reaccionan. Aunque el OPA fue originalmente aplicado solamente para postcolumnas de derivatización ahora está ampliamente usado como un agente para precolumnas. Mientras que la separación de aminoácidos siguiente a una precolumna de derivatización está llevada a cabo por cromatografía de fase reversa, ambas, cromatografía de fase reversa y cromatografía de intercambio catiónico pueden ser utilizadas cuando el OPA es el agente de derivatización en la postcolumna. Una desventaja del OPA reside en la relativa inestabilidad de sus derivados, quizás añadida a los problemas de cuantización, aunque ésto no es de gr an dificultad en la técnica de derivatización en postcolumna. Sin embargo, en precolumna y desde el punto más bajo de pH 7’2 hasta un p H típico de reacción de 9’5, los
productos deben ser inmediatamente aplicados a un sistema cromatográfico. Bajando estos dos pH se amortigua la reacción y sirve para estabilizar ligeramente los productos de reacción. La mayor desventaja del OPA es que no reacciona con aminas secundarias (prolina e hidroxiprolina) aunque ésto puede ser solventado con su oxidación por cloramina-T o hipoclorito. Una estratégica combinación del uso de OPA con FMOC (9fluorenilmetil cloroformato) ha sido recientemente introducida para solucionar esta deficiencia. El método con OPA se utiliza específicamente con precolumna de derivatización para el análisis de aminoácidos porque es más sensible y tarda menos tiempo que otros métodos HPLC. Fluorescamina. La fluorescamina fue también introducida como una posible alternativa a la ninhidrina en postcolumnas de derivatización. Todas las aminas primarias reaccionan con la fluorescamina en medio básico (pH 9 -11) dando un producto fluorescente con un incremento en sensibilidad de detección mayor que la ninhidrina, aunque la fluorescamina por si misma no tiene fluorescencia. El producto fluorescente es inestable en disolución acuosa y el reactivo debe prepararse en acetona. Las aminas secundarias no reaccionan, a menos que se conviertan previamente en aminas primarias, lo que puede hacerse con N -clorosuccinimida, hipoclorito o cloramina-T. Aunque el reactivo tiene interés por su rápida velocidad de reacción con los aminoácidos a temperatura ambiente, la reacción no es tan sensible como la de la ninhidrina. Isotiocianato de fenilo (PITC). El PITC, también conocido como reactivo de Edman, ha sido largamente usado para la secuenciación de polipéptidos y proteínas y fue introducido para el análisis de aminoácidos al principio de los años ochenta. Es actualmente, el agente más usado para precolumnas de derivatización, seguido de cromatografía en fase reversa, en análisis de aminoácidos, siendo empleado para mezclas de aminoácidos de una gran variedad de fuentes. En lugar de ser analizados como derivados d e PTH (feniltiohidantoin), como ocurre durante la secuenciación de péptido o proteínas, los aminoácidos son analizados como derivados de PTC (feniltiocarbamol). Así, a pH alcalino, los aminoácidos primarios y secundarios producen derivados de PTC, que pueden ser registrados por absorbancia UV (240-255 nm) con un límite de detección en el rango de 5 a 50 pmol. Todos los aminoácidos forman derivados mono-PTC, excepto lisina y cisteína, que producen dobles formas PTC. Los productos son relativamente estables, aunque alguna conversión al derivado PTH puede ocurrir si el pH no s e controla adecuadamente. Aunque la metodología PITC puede ser considerada superior al resto de las técnicas en un gran número de aspectos, tiene una mayor desventaja en que algunos derivados PTC de aminoácidos son fuertemente afectados por la presencia de algunas sales, c ationes divalentes, metales e iones tampon. Así, mientras el acetato amónico, el cloruro sódico y el borato s ódico se ha encontrado que no tienen efecto en aminoácidos PTC, otras sales, como el fosfato de sodio y el bicarbonato de sodio si que lo tienen. Además la contaminación por trazas de iones metálicos se ha encontrado que reduce la formación de aminoácidos PTC. Incluso añadiendo EDTA se han conseguido mejores rendimientos para la derivatización. Cloruro de dansilo y cloruro de dabsi lo. El cloruro de dansilo (cloruro de 1-dimetilaminonaftaleno-5-sulfonilo) fue inicialmente introducido para el análisis del nitrógeno terminal de los aminoácidos en péptidos y proteínas, un propósito para el cual todavía es empleado. Reacciona con aminas primarias y secundarias pa ra producir derivados fluorescentes. Su aplicación adolece de la presencia de numerosos productos laterales y de la formación de múltiples derivados
de ciertos aminoácidos. Además de ésto está el requerimiento de un largo tiempo d e reacción. Así, aunque el cloruro de dansilo es frecuentemente empleado por lo investigadores para la derivatización en precolumna seguida de cromatografía en fase reversa, este método nunca ha sido ampliamente aceptado para el análisis automático de aminoácidos. El cloruro de dabsilo (cloruro de dimetilaminoazobencenosulfonilo) es un agente muy relacionado con el cloruro de dansilo. Fue introducido y desarrolla por Chang y sus colaboradores, para la detección de aminoácidos en el rango del visible y en el nivel del pmol. Reacciona con aminoácidos primarios y secundarios para producir derivados que tienen una gran absorbancia en el rango del visible. La reacción se realiza a unos 70ºC y un pH de 8 a 8’5, produciendo derivados altamente estables en 10 o 12 m inutos. Se forman mono y bis-derivados de lisina, tirosina e histidina. A pesar de las ventajas sobre el cloruro de dansilo como agente de derivatización, la técnica del cloruro de dabsilo tiene una tolerancia limitada a la presencia de sales, y aun no está clara cómo se vería afectada la detección a altos niveles de sensibilidad (rango del 10 al 20 pmol) por la presencia de metales, sales y otros contaminantes. Aunque no se usa ampliamente en análisis automáticos de aminoácidos como la ninhidrina, el OPA y el PITC, una adaptación comercial del método del cloruro de dabsilo está disponible en Beckman Instruments. Cloruro de 9-Fluoroenilmetil cloroformato (FMOC-Cl). El FMOC-Cl reacciona con grupos amino para formar derivados carbamados altamente fluorescentes y estables. Este agente altamente reactivo, originalmente y todavía us ado como grupo amino protector en síntesis de péptidos, fue primeramente aplicado como un agente derivatizante en precolumna para análisis de aminoácidos. El FMOC-Cl reacciona con todos los aminoácidos a pH alcalino y temperatura ambiente para producir derivados aminoacídicos altamente estables que tienen una fluorescencia comparable a los derivados de OPA. Se pueden formar mono- y bis-derivados con histidina, tirosina y lisina. Las proporciones relativas de estos derivados varían en función del pH y de la proporción de reactivo y aminoácido. Durante la reacción con FMOC-Cl, los productos de hidrólisis del reactivo que se forman tienen fluorescencia parecida a la de los derivados aminoacídicos. Estos productos interfieren en la separación por cromatografía de fase reversa a menos que s ean eliminados por el disolvente orgánico de extracción, antes de aplicar la muestra a la columna de cromatografía de fase reversa. Una versión automatizada de este procedimiento de derivatización ha sido desarrollada y comercializada. Betnér y Foldi solucionaron el problema de las interferencias por la elución de grandes picos de FMOC-Cl y sus productos de hidrólisis, FMOC-OH, que son eluídos en la misma región cromatográfica que muchos de los aminoácidos FMOC, por derivatización del volumen de exceso FMOC-Cl con una amina hidrofóbica. El derivado resultante es eluído más tarde en el cromatograma después de todos los aminoácidos FMOC. Una combinación entre OPA/FMOC ha sido descrita, la cual usa un analizador comercialmente disponible (Hewlett-Packard Amino Quant). La reacción de aminoácidos primarios es llevada a cabo inicialmente por OPA, seguida por la reacción de prolina e hidroxiprolina con FMOC. La determinación de la fluorescencia para los derivados de aminoácidos primarios OPA y FMOC-prolina es llevada a cabo entonces a longitudes de onda apropiadas. 7-cloro y 7-fluro-4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole (NBD-Cl y NBD-F). Reactivos de derivatización basados en la estructura del nitrobenzofurazan, NBD-Cl y NBD-F, tienen probada utilidad para aplicaciones específicas en el análisis de todos los aminoácidos. El NBD-Cl fue introducido por Ghosh y por W hitehouse como un agente fluorigénico para aminas, incluyendo aminoácidos y posteriormente Rot como una útil herramienta para el análisis de aminoácidos, particularmente por su realzada reactividad con aminas secundarias. Desde en tonces, este reactivo ha tenido empleo ocasionalmente para la detección de aminoácidos, con particular énfasis en la detección de prolina e hidroxiprolina. NBD-Cl ha sido aplicado a la derivatización en pre- y post-columna, con un límite de detección en éstas últimas de 1 nmol para p rolina e hidroxiprolina y un límite de detección en las primeras algo menor. Aunque NBD-Cl es estable y permite una detección sensible de aminoácidos, reacciona algo más despacio con aminas y no ha tenido un uso extendido como agente analítico general para aminoácidos. NBD-F es más reactivo que su análogo de cloro, permitiendo una derivatización más rápida, acompañada de una gran fluorescencia para prolina e hidroxiprolina. De forma similar al NBD -Cl, el NBD-F ha sido aplicado tanto a derivatizaciones precolumna como postcolumna. Los límites de detección para la precolumna están definidos en el rango de 5-15 fmol para la mayoría de los aminoácidos. El NBD-F tampoco ha sido utilizado
ampliamente como método analítico para aminoácidos, aunque algunos investigadores emplean este reactivo habitualmente. Otros reactivos derivados del isotiocianato. El 4’-N,N-dimetilamino-4-azobencenoisotiocianato (DABITC) ha sido usado satisfactoriamente en la secuenciación manual y análisis de nitrógeno terminal de péptidos y proteínas. La degradación tipo Edman de péptidos y proteínas efectuada por este agente produce derivados tiohidantoin coloreados (DABTH), que pueden ser separados por cromatografía de fase reversa. El método de degradación generalmente comprende un doble acoplamiento, primero con DABITC y luego con PITC. La 4-N,N-dimetilnaftilazobenzeno homologa del DABITC (DANABITC) ha sido también aplicada con éxito, aunque en menor grado que el DABITC. Difenilindenonilisotiocianato (DIITC) ha sido estudiada para ser utilizada cuando la espectrometría de masas por ionización química es acoplada con identificaciones previas por cromatografía de fase reversa. La detección de derivados de tiohidantoin (DITH) se lleva a cabo por determinación UV (en el rango por debajo del pmol). La detección electroquímica es un utensilio alternativo. Otros reactivos isotiocianatos de derivatización precolumna son 4-(t-butiloxicarbonilaminometil)fenil isotiocianato (BAMPITC, detección fluorescente), trimetilsisil isotiocianato para análisis de secuencia de carbono terminal (detección UV) y p-N,N-dimetilaminofenil isotiocianato (DMAPI) como una instrumento electroquímico para el análisis de aminoácidos. Reactivos mixtos. Otros reactivos están siendo continuamente desarrollados y utilizados para detecciones de aminoácidos. Algunos tienen aplicaciones muy específicas y limitadas, mientras otros son tratados como posibles competidores para amplios usos en sistemas automáticos. Tales reactivos incluyen el ácido 2,4,6 trinitrobencensulfónico (TNBS) y su análogo 2,4 -dinitrobenceno (DNBS), N,N-dietil-2,4-dinitro-5-fluoroanilina, fluoro-2,4-dinitrobenceno, ácido 1,1-difenilbórico y 1-fluoro-2,4-dinitrofenil-5-L-alanina amida (reactivo de Marfey). La detección fluorescente es posible cuando se emplean reactivos tales c omo pentano-2,4diona/formaldehido, 9-antrildiazometano, cloruro laril, 2,3-naftaleno-dicarboxialdehido, succinimida naftilcarbamato, 3-benzoil-2quinolina-carboxaldehido, 9-hidroximetilantraceno e isotiocianato fluorescente y 1naftil isocianato. Un reactivo quimioluminiscente, 4-isocianatoftalhidrazida, también ha sido investigado. Con excepción del pentano-2,4-diona/formaldehido, donde el reactivo fue usado en derivatización postcolumna seguida de intercambio iónico HPLC de aminoácidos, todos los demás fueron utilizados para la derivatización previa de cromatografía de fase reversa. En la siguiente tabla se pueden comparar las diferentes características de los reactivos de derivatización más importantes para la determinación de aminoácidos: REACTIVOS DE DERIVATIZACIÓN Complejos con:
Método de separación
Post- o precolumna
Detección
1os
CIC o electroforésis
Post-
VIS 570 nm
OPA
1os
CFR (en postcolumna,CIC)
Pre- y post-
Fluorescencia
Fluorescamina
1os
CIC o electroforésis
Post-
Fluorescencia
PITC
1os y 2os
CFR
Pre-
UV 240-255 nm
Cloruro de dansilo
1os y 2os
CFR
Pre-
Fluorescencia
Cloruro de dabsilo
1os y 2os
CFR
Pre-
VIS
FMOC-Cl
1os y 2os
CFR
Pre-
Fluorescencia
NBD-Cl
1os y 2os
CFR
Pre- y post-
Fluorescencia
NBD-F
1os y 2os
CFR
Pre- y post-
Fluorescencia
Preparación de las muestras. La reacción con los derivatizantes forma el mismo cromóforo con las aminas primarias que con las secundarias, por tanto las muestras deben estar libres de sales y lípidos antes de que tengan lugar la hidrólisis y los pasos de derivatización. La mayor causa de los bajos rendimientos en las reacciones de derivatización es la presencia d e contaminantes en la muestra, como son las sales no-volátiles, detergentes y lípidos. Las sales y los támpones interfieren tanto en la hidrólisis como en la posterior derivatización, distorsionan la cromatografía y añaden picos extra al cromatograma. Las sales pueden ser eliminadas de las proteínas y de los péptidos usando támpones volátiles y HPLC de fase reversa, precipitación, diálisis o columnas de filtración de gel. 5. Derivatización pre-columna frente a post-columna Las opiniones de investigadores sobre los ventajas relativas de la derivatización antes o después del HPLC, de aminoácidos serán determinadas por los requerimientos de la aplicación específica. Factores como la sensibilidad requerida en la detección, cantidad de muestra disponible, tipo de muestra, fuente d e muestra, velocidad de análisis y reproducibilidad e incluso consideraciones económicas influirán en la elección entre la derivatización pre- o post-columna de aminoácidos. Derivatización post-columna. La derivatización siguiendo a una cromatografía de intercambio catiónico de aminoácidos libres tiene distintas ventajas, con tal de que la instrumentación produzca velocidades y temperaturas de reacción reproducibles. Además, para la derivatización no es n ecesario proceder al completo, y los problemas de estabilidad del derivado son insignificantes. Otras ventajas son que laautomatización es fácil y que el tiempo consumido y la pérdida a causa de la preparación de la muestra son innecesarias. También pueden ser usados detectores en serie. Una gran cantidad de experiencias han sido adquiridas del tradicional método de intercambio catiónico y tinción con ninhidrina, el cual ha resultado ser fiable, preciso y capaz de una separación excelente de mezclas complejas de aminoácidos y sus metabolitos. Una desventaja con un sistema HPLC convencional es q ue son necesarios instrumentos más complejos que para el método de pre-columna. La derivatización post-columna requiere la adición de una o más bombas para los disolventes y reactivos derivatizantes. También se requiere la adición d e un reactor post-columna, el cual llevará a un ensanchamiento de banda adicional, y por esto, un decrecimiento en la sensibilidad de detección. La columna de elución es continuamente diluida por el reactivo derivatizante, provocando un descenso en la s ensibilidad de detección. Así, la máxima sensibilidad alcanzable por derivatización post-columna será menor que en el caso de la precolumna. Derivatización pre-columna. Ésta, acoplada con cromatografía de fase reversa en lugar de con c romatografía de intercambio catiónico, fue originalmente introducida como respuesta al incremento en la demanda de mayor sensibilidad y mayor velocidad de análisis. Las ventajas de la metodología de la derivatización precolumna incluyen simplicidad, velocidad y alta sensibilidad. Por ello, si se requiere máxima sensibilidad de detección, un reactivo fluorescente combinado con la derivatización pre-columna es el método más indicado. Como desventaja está la necesidad de garantizarse la completa reacción del reactivo derivatizante y la posibilidad de interferencia con la separación por exceso de reactivo, el medio de reacción o la producción de diferentes derivados de un componente. Además, la estabilidad del derivado puede ser un importante factor durante la derivatización pre-columna, la demora entre la derivatización y la inyección llega a ser fundamental para los resultados obtenidos. 6. Bibliografía. David J. Holme y Hazel Peck, Bioquímica Analítica, Longman Group Limited, 1983. Hans-Dieter Belitz y Werner Grosch, Química de los Alimentos, Springer-Verlag GmbH & Co., 4ª edición. Adolfo Leandro Montes, Bromatología, Editorial Universitaria de Buenos Aires, 2ª edición, 1981. Valcarcel-A. Gómez, Técnicas Analíticas de Separación, Ed. Reverté S.A., 1994. Skoog y J.J.Leary, Análisis Instrumental, Ed. McGraw Hill Interamericana, 1994. Métodos Oficiales de Análisis, Ministerio de Agricultura, Pesca y Alimentación, Dirección General de Política Alimentaria. 1986. Methods of Analysis of AOAC, Association o f Official Analytical Chemist, 1995.
Autor: Óscar Burriel López Daniel Salavera Muñoz Víctor M. Gimeno Gil
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