Gesiane G. Ferreira
RELATÓRIO DE BIOFÍSICA Análise pelo espectrofotômetro e curva padrão.
UNIPAC - IPATINGA 2009
Gesiane G. Ferreira
RELATÓRIO DE BIOFÍSICA Análise pelo espectrofotômetro e curva padrão.
Finalidade: adquirir o conhecimento de manuseio do aparel aparelho ho espect espectrof rofotô otômet metro ro e analisar os resultados obtidos.
UNIPAC - IPATINGA 2009
INTRODUÇÃO
A espectrofotometria é uma técnica analítica que avalia a capacidade dos solutos de absorver luz em comprimentos de onda específicos. A medida da luz absorvida permite inferir sobre a concentração do soluto em determinada solução. Comp Compos osto toss desc descon onhe heci cido doss pode podem m ser ser iden identi tifi fica cado doss por por seus seus espe espect ctro ross característicos ao ultravioleta, visível ou infravermelho. Quando uma radiação eletromagnética, por exemplo, a luz visível, incide em uma solução, se os fótons da radiação têm energia adequada, a energia associada a essa radiação pode sofrer três diferentes tipos de variações: - ser refletida nas interfaces entre o ar e a parede do frasco contendo a solução (cubeta); - ser dispersa por partículas presentes na solução; - ser absorvida pela solução. Nas aplicações espectrofotométricas, quando se usa energia monocromática em um simples comprimento de onda (λ), a fração de radiação absorvida pela solução, ignorando perdas por reflexão, será função da concentração da solução e da espessura da solução. Portanto, a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com com o aume aument ntoo da espe espess ssur uraa atra atrave vess ssad adaa – Lei Lei de Lamb Lamber ertt – e o aume aument ntoo da concentração concentração ou da intensidade de cor da solução – Lei de Beer. A relação relação entre energia emergente (I) e energia incidente (I0) indica a transmitância (T) da solução. Em espect espectrof rofoto otomet metria ria,, uti utili lizaza-se se a absor absorbân bância cia (A) como como a int intens ensida idade de de radiaç radiação ão absorvida pela solução, seguindo as leis de Lambert-Beer. Determinação do espectro de absorção da solução de CuSO 4 e construção de uma curva-padrão. A determinação de concentração de um soluto em uma solução-problema por espectrofotometria envolve a comparação da absorbância da solução-problema com uma solução de referência, na qual já se conhece a concentração do soluto. Em geral, é utiliza util izada da uma solução-p solução-padrã adrãoo com diferente diferentess concentra concentrações ções (pontos), (pontos), que tem sua absorbância determinada. Esses pontos são preparados diluindo-se a solução-padrão na proporção necessária para a obtenção das concentrações desejadas. desejadas. Com os valores de absorbância e de concentração conhecidos, pode-se traçar um gráfico cujo perfil é conhecido como “curva-padrão”. Nesse gráfico, a reta, indica a proporcionalidade entre o aumento da concentração e da absorbância e a porção linear correspondente ao limite de sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto em questão. OBJETIVO:
Determinar o espectro de absorção da solução de CuSo 4 em vários níveis de concentração. Construir uma curva-padrão e determinar a concentração desconhecida da solução x.
MATERIAL UTILIZADO:
Espectrofotômetro. Água destila q.s.p. 2 Beckers 80ml. Balão volumétrico 500ml. 9 tubos de ensaio. 2 pipetas de 10 ml . Pêra. Solução de CuSO 4 [200mg/dl]. PROCEDIMENTO:
1. Completar a tabela com os valores de volume de água destilada e de solução de CuSO4 para atingir as concentrações desejadas. Pela fórmula CV=C’V’, que considera ralação da contração padrão e seu volume com a concentração e volume final desejado, podemos calcular o volume da solução de CuSO4 necessário para o fracionamento. Tubo de ensaio nº 1: CV=C’V’ 200.V= 20. 10 V= 200/200 V= 1ml Tubo de ensaio nº 2: CV=C’V’ 200.V= 40. 10 V= 400/200 V= 2ml Tubo de ensaio nº 3: CV=C’V’ 200.V= 60. 10 V= 600/200 V= 3ml Tubo de ensaio nº 4: CV=C’V’ 200.V= 80. 10 V= 800/200 V= 4ml
Tubo de ensaio nº 5: CV=C’V’ 200.V= 100. 10 V= 1000/200 V= 5ml Tubo de ensaio nº 6: CV=C’V’ 200.V= 120. 10 V= 1200/200 V= 6ml Tubo de ensaio nº 7: CV=C’V’ 200.V= 140. 10 V= 1400/200 V= 7ml Tubo de ensaio nº 8: CV=C’V’ 200.V= 160. 10 V= 1600/200 V= 8ml
Completa-se com água destilada, para alcançar o volume final de 10ml para cada tubo de ensaio. 2. Após a misturar os volumes necessários da solução e da água destilada, deve-se homogenizar a mistura da melhor forma possível. 3. Utiliza-se água destilada como branco para calibrar o espectrofotômetro em λ = 650nm. 4. Identi Identifi ficar car a absorb absorbânc ância ia de cada cada conce concentr ntraçã ação. o. Inclus Inclusive ive da soluçã soluçãoo de concentração concentração desconhecida desconhecida (X). ( X). 5. Construção de um gráfico para a curva-padrão [C] x (A) RESULTADOS
Tudo de ensaio
Concentração final
1 2 3 4 5 6 7 8 9
20 40 60 80 100 120 140 160 Conc = X
V de água (ml) 9 8 7 6 5 4 3 2
V de solução (ml) 1 2 3 4 5 6 7 8
V total (ml)
Absorbância em 650nm
10 10 10 10 10 10 10 10
0,060 0,118 0,177 0,236 0,292 0,349 0,417 0,468 0,241
Curva Padrão 0,5 0,45 0,4 a 0,35 i c n 0,3 â b 0,25 r o s 0,2 b A0,15 0,1 0,05 0
y = 0,0029x + 0,0009 2
R = 0,9996 Absorbância Linear (Absorbância (Abso rbância))
0
50
10 0
150
2 00
Concentração
Gráfico da curva padrão da solução de CuSO 4 em diferentes concentrações.
Para calcular a concentração de X: y = 0,0029x + 0,0009 0,241= 0,0029x + 0,0009 x = 0,241-0,0009 = 82,79 mg/dl 0,0029 Ou: 80 – 0,236 X – 0,241 X= 80 x 0,241 = 81,69 mg/dl 0,236 Média: X = 82,79 + 81,69 = 82,24 mg/dl 2 CONCLUSÃO
Através Através de processo processoss físicos, físicos, realizado realizadoss pelo aparelho aparelho de espectro espectrofotom fotometri etria, a, podemos analisar as propriedades das soluções, por exemplo, a concentração. E com a utiliz uti lizaçã açãoo de cálcul cálculos os jun juntam tament entee com com os result resultado adoss obt obtid idos os pela pela aparel aparelhag hagem, em, é poss possíve ívell defini definirr a conce concentr ntraç ação, ão, em marge margens ns mui muito to aproxi aproximad madas, as, de soluç soluçõe õess de concentração desconhecida. BIBLIOGRAFIA
MASTROENI, Marco; GERN, Regina. Bioquímica - Práticas adaptadas. Atheneu, 2008. Cap. 2.
