BAB 1 PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG
Jumlah mikroorganisme yang berada dalam suatu sampel atau bahan sangat bervariasi, tergantung dari jenis bahan itu sendiri dan kondisi lingkungannya. Pada individu multiseluler, bila sel-selnya membelah, maka individunya
bertambah
banyak,
pada
mikroorganisme
uniseluler
pembelahannya bakteri multiplikasi. Bakteri bermultiplikasi secara seksual dengan cara pembelahan menjadi dua, dua menjadi empat, empat menjadi delapan, dan seterusnya.
Jumlah mikroorganisme dalam suatu sampel dapat dihitung dengan menggunakan beberapa metode yaitu analisa secara langsung yaitu dalam hal ini digunakan ruang hitung (counting chamber). Alat ini biasa digunakan adalah hoemoeitometer, keuntungannya menggunakan alat ini adalah pemeriksaan secara cepat dan tidak menggunakan banyak peralatan, namun kelemahannya tidak dapat dibedakan sel hidup dan sel mati. Sedangkan analisa secara langsung terdiri atas beberapa cara yaitu metode cawan tuang dan metode cawan permukaan.
1
1.2 RUMUSAN MASALAH
Berdasarkan uraian latar belakang masalah di atas, maka rumusan masalah dalam paper ini adalah sebagai berikut : 1. Apa yang dimaksud dengan uji kuantitatif pada mikroba dan teknik pengenceran ? 2. Bagaimana pengenceran dan uji kuantitatif dengan metode hitungan cawan pada sampel ? 3. Bagaimana pengenceran dan uji kuantitatif dengan metode Most Probable Number pada sampel ?
1.3 TUJUAN
Dari rumusan masalah di atas, maka tujuan penulisan paper ini adalah sebagai berikut : 1. Mengetahui uji kuantitatif pada mikroba dan teknik pengenceran 2. Mengetahui pengenceran dan uji kuantitatif dengan metode hitungan cawan pada sampel 3. Mengetahui pengenceran dan uji kuantitatif dengan metode Most Probable Number pada sampel.
2
BAB 1I TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Analisa kuantitatif mikroorganisme dan teknik pengenceran
A. Analisa Jumlah Mikroba pada Bahan Pangan berfungsi untuk :
Menentukan jenis dan sumber kontaminan
Evaluasi proses sanitasi, penanganan bahan dasar dan proses pengolahan
Menentukan kualitas mikrobiologis makanan
Menentukan umur simpan makanan
Menentukan apakah makanan memenuhi syarat
Analisa kuantitatif bertujuan untuk mengetahui berapa jumlah mikroba yang ada pada bahan pangan. Contoh : jumlah E coli pada air minum, jumlah bakteri pada susu segar
B. Teknik pengenceran
Bahan pangan yang diperkirakan mengandung lebih dari 300 sel mikroorganisme per ml, per gram atau per cm (jika dilakukan pengamatan pada permukaan luar bahan pangan), memerlukan perlakuan pengenceran sebelum ditumbuhkan pada medium agar di dalam cawan petri sehingga setelah inkubasi akan terbentuk koloni pada cawan tersebut dalam jumlah yang dapat dihitung, dimana jumlah yang terbaik adalah antara 30 sampai 300 koloni. Pengenceran biasanya dilakukan secara desimal, yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dst. Pengambilan contoh dilakukan secara aseptik dan pada tiap pengenceran
dilakukan
pengocokan
kira-kira
25
kali
untuk
memisahkan sel-sel mikroorganisme yang bergabung menjadi satu. Pengenceran secara desimal memudahkan dalam perhitungan jumlah koloni sedangkan pengenceran yang bukan secara desimal, misalnya 1:5, 1:25 dst. Jarang dilakukan karena tidak praktis dalam perhitungannya. Untuk mengetahui jumlah mikroorganisme pada
3
permukaan luar bahan pangan, misalnya daging sapi, ayam atau ikan, pengambilan contoh dapat dilakukan menggunakan metode ulas (swab). Larutan yang digunakan untuk pengenceran dapat berupa larutan buffer fosfat, larutan garam fisiologi 0,85% atau larutan ringer. Untuk bahan pangan yang sukar larut, ke dalam larutan pengencer pertama dapat ditambahkan pasir putih atau butir-butir gelas. Sebagai contoh jika contoh yang akan dianalisa adalah tepung/ pati, digunakan satu sendok pasir ke dalam 90 atau 99 ml larutan pengencer pertama sehingga sewaktu dikocok pemecahan partikel dari tepung/ pati akan lebih mudah. Butir-butir gelas dapat digunakan misalnya jika kita akan menganalisa total mikroorganisme dari telur sehingga bagian yang bersifat koloid dari telur dapat lebih mudah dipecah.
4
2.2 Metode hitungan cawan A. Prinsip
Prinsip dari metode hitungan cawan adalah jika sel mikroorganisme yang
masih
hidup
ditumbuhkan
pada
medium
Agar
maka
sel
mikroorganisme tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop.
Metode HC merupakan cara yang paling sensitif untuk menentukan jumlah mikroorganisme karena: a. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung b. Beberapa jenis mikroorganisme dapat dihitung sekaligus c. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasi mikroorganisme karena koloni yang terbentuk mungkin berasal dari satu sel mikroorganisme dengan penampakan pertumbuhan yang spesifik. Metode HC mempunyai kelemahan-kelemahan, yaitu: a. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel mikroorganisme yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan mungkin membentuk satu koloni. b. Medium dan kondisi yang berbeda mungkin menghasilkan nilai yang berbeda. c. Mikroorganisme yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar. d. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi yang lama sehingga pertumbuhan koloni dapat dihitung. Metode HC dapat dibedakan atas dua cara, yaitu metode tuang ( pour plate) dan metode permukaan ( spread plate)
5
Metode Tuang ( Pour Plate) 1. Dari pengenceran yang dikehendaki sebanyak 1 ml atau 0,1 ml larutan tersebut dipipet ke dalam cawan petri menggunakan pipet 1 ml atau 1,1 ml.
Sebaiknya
waktu
antara
dimulainya
pengenceran
sampai
menuangkan ke dalam cawan petri tidak lebih dari 30 menit. 2. Kemudian ke dalam cawan tersebut dimasukkan Agar cair steril yang telah didinginkan sampai 47-50 0C sebanyak
15-20 ml. Selama
penuangan medium, tutup cawan tidak boleh dibuka terlalu lebar untuk menghindari kontaminasi dari luar. 3. Segera setelah penuangan cawan petri digerakkan di atas meja secara hati-hati untuk menyebarkan sel-sel mikroorganisme secara merata yaitu dengan gerakan melingkar atau gerakan seperti angka delapan. 4. Setelah agar memadat, cawan-cawan tersebut dapat diinkubasikan di dalam inkubator dengan posisi terbalik. Inkubasi dilakukan pada suhu dan waktu tertentu sesuai dengan jenis mikroorganisme yang akan dihitung. Media agar yang digunakan juga disesuaikan dengan jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Selama inkubasi, sel-sel yang masih hidup akan tumbuh dan membentuk koloni yang dapat terlihat langsung oleh mata. 5. Setelah akhir masa inkubasi, koloni yang terbentuk dihitung. Setiap koloni dapat dianggap berasal dari satu sel yang membelah menjadi banyak sel, meskipun mungkin juga berasal dari lebih darii satu sel yang letaknya berdekatan. Perhitungan jumlah koloni dapat dilakukan menggunakan quebec colony counter. Ketelitian akan lebih tinggi jika dilakukan pemupukan secara duplo, yaitu menggunakan dua cawan petri untuk setiap pengenceran. Cara ini harus dilakukan dalam suatu pekerjaan penelitian. Selanjutnya untuk praktikum dimana biaya dan jumlah sangat terbatas dapat digunakan satu cawan petri setiap pengenceran.
6
Metode permukaan (Spread Plate) 1. Pada metode ini, agar steril terlebih dahulu dituangkan ke dalam cawan petri dan dibiarkan membeku. 2. Setelah membeku dengan sempurna, kemudian sebanyak 0,1 ml contoh yang telah diencerkan dipipet pada permukaan agar tersebut. 3. Sebuah batang gelas melengkung (hockey stick) dicelupkan ke dalam alkohol 95% dan dipijarkan sehingga alkohol hasil terbakar. 4. Setelah dingin batang gelas tsb digunakan untuk meratakan contoh di atas medium agar dengan cara memutarkan cawan petri di atas meja. 5. Selanjutnya inkubasi dan perhitungan koloni dilakukan seperti pada metode penuangan. Tetapi harus diingat bahwa jumlah contoh yang ditumbuhkan adalah 0,1 ml sehingga harus dimasukkan dalam perhitungan Total Count.
B. Cara Menghitung Koloni
Perhitungan jumlah koloni akan lebih mudah dan cepat jika pengenceran
dilakukan
secara
desimal.
Sebagai
contoh
misalnya
penetapan jumlah koloni pada susu. Pengenceran awal 1:10 dibuat dengan mengencerkan 1 ml susu ke dalam 9 ml larutan pengencer dan dilanjutkan dengan pengenceran yang lebih tinggi misalnya sampai 10 -5 atau 10-6 tergantung pada mutu susunya. Semakin tinggi jumlah mikroorganisme yang terdapat di dalam susu semakin tinggi pengenceran yang harus
7
dilakukan. Jika setelah inkubasi misalnya diperoleh 62 koloni cawan yang mengandung pengenceran 10 -4 maka jumlah koloni dapat dihitung sebagai berikut ( 1 ml larutan pengencer dianggap 1 g):
Faktor pengenceran = pengenceran awal x pengenceran selanjutnya x j umlah yg ditumbuhkan
= 0,1
x 0,1 x 0,1 x 0,1
x1
= 10-4 Koloni per ml = jumlah koloni X
1 Faktor Pengenceran
= 62 x 1/ 10 -4 = 6,2 x 10 -5
C. Standar Perhitungan
Untuk melaporkan suatu hasil analisa mikrobiologi digunakan suatu standar yang disebut Standar Palte Count (SPC) yang menjelaskan mengenai cara menghitung koloni pada cawan serta cara memilih data yang ada untuk menghitung jumlah koloni di dalam suatu contoh. Cara menghitung koloni adalah sebagai berikut. 1. Cawan yang dipilih dan dihitung adalah yang mengandung jumlah koloni antara 30-300. 2. Beberapa koloni yang bergabung menjadi satu merupakan suatu kumpulan koloni yang besar dimana jumlah koloninya diragukan, dapat dihitung sebagai satu koloni. 3. Suatu deretan (rantai) koloni yang terlihat sebagai suatu garis tebal dihitung sebagai satu koloni. 4. Hasil yang dilaporkan hanya terdiri dari dua angka yaitu angka pertama (satuan) dan angka kedua (desimal). Jika angka yang ketiga sama dengan atau lebih besar dari lima, harus dibulatkan satu angka lebih tinggi pada angka kedua. 5. Jika pada semua pengenceran dihasilkan kurang dari 30 koloni mikroba pada cawan petri, berarti pengenceran yang dilakukan terlalu tinggi. Oleh karena itu jumlah koloni pada pengenceran
8
yang terendah yang diukur/dihitung. Selanjutnya hasil yang kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di dalam tanda kurung. 6. Jika pada semua pengenceran dihasilkan lebih dari 300 koloni pada medium, berarti pengeceran yang dilakukan terlalu rendah. Oleh karena itu jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung. Hasilnya dilaporkan kemudian dikalikan dengan faktor pengencernya, tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di dalam tanda kurung. 7. Jika digunakan dua cawan petri per pengenceran, data yang diambil harus dari kedua cawan tersebut, tidak boleh diambil salah satu. 8. Jika cawan dari dua tingkat pengenceran dihasilkan koloni dengan jumlah 30 - 300, dan perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah
> 2, maka yang dilaporkan hasil yang terkecil.
Jika
perbandingan antara hasil tertinggi dan terendah ≤ 2, yang dilaporkan rata-rata dari kedua nilai tersebut.
2.3 Metode Most Probable Number (MPN) A. Definisi
Berbeda dengan metode cawan dimana digunakan medium padat (Agar), dalam metode MPN digunakan medium cair di dalam tabung reaksi, dimana perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroorganisme setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan, atau terbentuknya gas di dalam tabung Durham untuk mikroorganisme pembentuk gas. Pada umumnya untuk setiap pengenceran digunakan 3 atau 5 seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi tetapi alat gelas yang digunakan juga lebih banyak. Dalam metode MPN, pengenceran harus dilakuakn sedemikian rupa sehingga beberapa tabung yang berisi medium cair yang diokulasikan
9
dengan
larutan
hasil
pengenceran
tersebut
mengandung
sel
mikroorganismr, beberapa tabung mungkin mengandung lebih dari satu sel sedangkan tabung lainnya tidak mengandung sel. Dengan demikian setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung yang dinyatakan sebagai tabung positif sedangkan tabung lainnya negatif. Untuk mendapatkan beberapa tabung positif, pengenceran dilakukan dalam metode MPN harus lebih tinggi dibandingkan dengan metode cawan. Metode
MPN
biasnya
dilakukan
untuk
menghitung
jumlah
mikroorganisme di dalam contoh yang berbentuk cair, meskipun dapat digunakan untuk contoh berbentuk pasat dengan terlebih dahulu dibuat suspensi 1:10 dari contoh tsb. Kelompok mikroorganisme dapat dihitung dengan metode MPN juga bervariasi tergantung medium yang digunakan untuk pertumbuhan. Perhitungan MPN Sebagai contoh misalnya terdapat suatu bahan pangan dilakukan pengenceran secara desimal, kemudian masing-masing pengenceran dimasukkan 1 ml ke dalam tabung yang berisi Nutrient Broth. Untuk tahap pengenceran digunakan 3 seri tabung. Setelah inkubasi suhu dan waktu tertentu, dilihat tabung yang positif yaitu yang ditumbuhi mikroorganisme yang dapat ditandai dengan timbulnya kekeruhan. Misalnya pada pengenceran 10-2 ketiga tabung menghasilkan pertumbuhan positif, pada pengenceran 10-3 dua tabung positif, pada pengenceran 10-4 satu tabung positif dan pada pengenceran 10 -5 tidak ada tabung positif. Kombinasinya menjadi 3,2,1,0 dan jika diambil tiga pengenceran yang pertama kombinasinya adalah 3,2,1. Setelah dicocokkan dengan tabel yang menunjukkan nilai MPN, hasilnya sebagai berikut: Kombinasi 3,2,1 Nilai MPN dari tabel MPN (3 tabung) = 1,5 MPN Count = Nilai MPN X 1/ Pengenceran tabung yg ditengah = 1,5 x 1/10 -3 = 1,5 x 10 -3
10
Metode MPN dapat digunakan untuk menghitung jumlah mikroorganisme jenis tertentu yang terdapat di antara mikroorganisme-mikroorganisme lainnya. Sebagai contoh jika digunakan Lactose Broth maka adanya bakteri
yang
dapat
memfermentasi
laktosa
ditunjukkan
dengan
terbentuknya gas di dalam tabung Durham. Cara ini biasanya digunakan untuk menentukan MPN coliform terhadap air atau minuman karena bakteri coliform termasuk bakteri yang dapat memfermentasi laktosa.
Pengenceran
Contoh kombinasi tabel yang positif (yg berwarna kuning menandakan positif) sehingga nilai tabel 3;2:1
11
Tabel MPN
12
BAB III METODELOGI
3.1 ALAT DAN BAHAN A. Hitungan Cawan
1) Alat a) Tabung reaksi
5
b) Cawan petri
3
c) Pipet tetes
1
Pipet ukur
1
d)
e) Inkubator
Kertas pembungkus
f)
1 3
2) Bahan a) Ikan segar
1
b) Ikan pindang
1
c) Daging sapi
50 gr
d) Sosis sapi
1
e) Dendeng sapi
50 gr
f)
Buffer Phospat
g) Medium PCA
36 ml 45 ml
B. Hitungan MPN
1) Alat a) Tabung reaksi
4
b) Pipet tetes
1
c) Rak kayu
1
d) Tabung Durham
4 series
e) Pipet ukur
1
f) g)
Inkubator
1
Kapas
secukupnya
13
2) Bahan a) ½ air es batu
1 ml
b) Air matang
1ml
c) Air Sumur
1 ml
d) Air Kolam
1 ml
e) Air Kran
1 ml
f)
Media Lactose Broth
100 ml
3.2 CARA KERJA A. Prosedur Hitungan Cawan
Sterilisasai semua alat dan media
5 tabung reaksi steril, satu tabung diisi air steril 5 ml, 4 tabung diisi larutan buffer phosphat 9 ml (10 -1, 10-2, 10-3, 10-4)
Swab permukaan bahan (2x2 cm) dengan alat swab yang telah dibasahi dengan buffer pospat.
masukkan alat tersebut ke dalam air steril dan diaduk.
Setelah itu ambil 1 ml masukkan ke dalam tabung pengenceran 10 -1, ambil larutan tersebut 1 ml dengan pipet steril dan pindahkan ke tabung 10-2, dst sampai tabung 10 -4
Dari masing-masing tabung pengenceran (10 -2, 10-3, 10-4) ambil 1 ml lalu masukkan ke cawan petri yang telah diberi label pen genceran
Isi masing-masing cawan petri dengan medium PCA yang masih hangat (suhu 380C) sebanyak 15 ml.
kemudian homogenkan dengan menggoyangkan cawan
14
Biarkan agar memadat
lalu bungkus dengan kertas pembungkus dengan posisi terbalik dan inkubasi di dalam inkubator dengan suhu 35 0C selama 3 hari
B. Prosedur MPN
Sterilisasi semua alat dan media
Sediakan 4 tabung reaksi steril, isi masing-masing dengan larutan buffer pospat 9 ml, 1 tabung diisi 9 ml (10 -1, 10-2, 10-3, 10-4)
Ambil 1 ml sampel air, lalu masukkan ke dalam tabung pengenceran 10-1, lalu aduk dan homogenkan
Dari tabung pengenceran 10-1, ambil 1 ml larutan dengan pipet steril dan masukkan ke dalam tabung pengenceran 10 -2, lalu aduk dan homogenkan. Lakukan hingga pengenceran 10 -4
Dari masing-masing tabung pengenceran (10 -1, 10-2, 10-3, 10-4), ambil 1 ml dan masukkan pada 4 series (@ 5 tabung) yang sebelumnya telah berisi tabung Durham sesuai dengan pengenceran yang diberi label (sudah diisi media LB 1/3 tabung)
Inkubasi tabung series selama 24 jam di dalam inkubator dengan suhu 350C.
Amati perubahan yang ada.
15
BAB IV PENUTUP
4. I Kesimpulan
1. Hitungan Cawan (PLATE COUNT)
Prinsip: Jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel tsb akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata telanja ng.
Pengambilan sampel Bahan pangan yang akan dihitung diambil sampel satu gram / satu ml
Pengenceran sampel dengan kelipatan 10, yaitu 1:10, 1:100, 1:1000 dst. Dengan menggunakan aquades steril.
Jumlah koloni per cawan
x
1 faktor pengenceran
2. Metode Most Probable Number
Metode ini digunakan untuk menghitung mikroba pada medium cair. Dimana perhitungan dilakukan berdasarkan tabung yg positif, yaitu ditumbuhi mikroba setelah diinkubasi.
Penentuan Tabung Positif Dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan/ terbentuknya gas dalam tabung kecil.
Cara kerja Setiap pengenceran dimasukkan 1 ml ke dalam tabung seri (3-5 tabung) yg berisi medium. Diinkubasi pada suhu ruang selama 3 hari. Kemudian dihitung jumlah tabung yg positif.
Nilai MPN = Nilai MPN Tabel x
1 Pengenceran Tabung Tengah
16
4.2 Saran
Untuk menentukan jumlah mikroorganisme dapat digunakan dengan cara Hitungan cawan (plate count) atau metode most probable number. Metode dipilih berdasarkan media dan sampel yang digunakan. Masing-masing cara memiliki keuntungan dan kerugian, namun ketelitian dalam perlakuan dapat meminimalisir kesalahan.
17
