METODE ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF KARBOHIDRAT
Oleh :
Ni Luh Mega Desyanti P07134011035
KEMENTERIAN KESEHATAN REPUBLIK INDONESIA POLITEKNIK KESEHATAN DENPASAR JURUSAN ANALIS KESEHATAN 2013
Metode Analisis Kualitatif Dan Kuantitatif Karbohidrat A. Uji Kualitatif 1. Uji Molisch Uji ini untuk semua jenis karbohidrat. Monosakarida, disakarida, dan polisakarida akan memberikan hasil positif. Uji positif jika timbul cincin merah ungu yang merupakan kondensasi antara furfural atau hidroksimetil furfural dengan a-naftol dalam pereaksi molish. a.
Prinsip Prinsip reaksi ini adalah dehidrasi senyawa karbohidrat oleh asam sulfat pekat. Dehidrasi heksosa menghasilkan senyawa hidroksi metil furfural, sedangkan dehidrasi pentosa menghasilkan senyawa fulfural. Uji positif jika timbul cincin merah ungu yang merupakan kondensasi antara furfural atau hidroksimetil furfural dengan a-naftol dalam pereaksi molish.
Uji molisch adalah uji kimia kualitatif untuk
mengetahui adanya karbohidrat. Uji ini untuk semua jenis karbohidrat. Mono-, di-, dan polisakarida akan memberikan hasil positif. b.
Cara Kerja 1. 15 tetes larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi. 2. 3 tetes pereaksi Molisch ditambahkan dan dicampur dengan baik. 3. Tabung reaksi dimiringkan lalu dialirkan dengan hati-hati 1 mL H2SO4 pekat melalui dinding tabung agar tidak tercampur. 4. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya cincin berwarna ungu pada batas antara kedua lapisan
2. Uji Benedict Uji Benedict adalah uji kimia untuk mengetahui kandungan gula (karbohidrat) pereduksi (yang memiliki gugus aldehid atau keton bebas) . Gula pereduksi meliputi semua jenis monosakarida dan beberapa disakarida seperti laktosa, glukosa dan maltosa. Uji benedict berdasarkan reduksi Cu2+ menjadi Cu+ oleh gugus aldehid atau keton bebas dalam
suasana alkalis, biasanya ditambahkan zat pengompleks seperti sitrat atau tatrat untuk mencegah terjadinya pengendapan CuCO3. Uji positif ditandai dengan terbentuknya endapan merah bata, kadang disertai dengan larutan yang berwarna hijau, merah, atau orange. a. Prinsip : Gula yang mempunyai gugus aldehid atau keton bebas akan mereduksi ion Cu
2+
dalam suasana alkalis menjadi Cu+ yang
mengendap sebagai Cu2O berwarna merah bata. b. Cara kerja 1. Alat dan bahan disiapkan 2. 3 tetes sampel(dalam bentuk larutan) dimasukkan kedalam tabung reaksi yang masih kering dan bersih 3. 2 mL pereaksi Benedict ditambahkan, kemudian dikocok. 4. Dimasukkan
kedalam
penangas air selama 5 menit. Amati
perubahan warna endapannya. 5. Pembentukan warna endapan hijau, kuning, atau merah menunjukan reaksi positif karbohidrat. 3.
Uji Seliwanoff Uji Seliwanoff bertujuan untuk mengeahui adanya ketosa
(karbohidrat yang mengandung gugus keton). Pada pereaksi seliwanoff, terjadi perubahan oleh HCl panas menjadi asam levulinat dan 4hidroksilmetilfurfural. Jika dipanaskan karbohidrat yang mengandung gugus keton akan menghasikan warna merah pada larutannya. Disakarida sukrosa yang mudah dihidrolisa menjadi glukosa dan fruktosa memberi reaksi positif dengan uji Seliwanoff. Glukosa dan karbohdrat lain dalam jumlah banyak dapat juga memberi warna yang sama. a. Prinsip : Dehidrasi
fruktosa
oleh
HCl
pekat
menghasilkan
hodroksimetilfurfural dan dengan penambahan resorsinol akan mengalami kondensasi membentuk senyawa kompleks berwarna merah oranye.
b. Cara kerja 1. 5 tetes larutan uji dan 15 tetes pereaksi Seliwanoff dimasukkan ke dalam tabung reaksi 2. Tabung dididihkan di atas api kecil selama 30 detik atau dalam penangas air mendidih selama 1 menit. 3. Hasil positif ditandai dengan terbentuknya larutan berwarna merah orange. 4.
Uji Barfoed Uji ini untuk membedakan monosakarida dan disakarida dengan
jalan mengontrol kondisi-kondisi percobaan, seperti pH dan waktu pemanasan. Pada analisa ini, karbohidrat direduksi pada suasana asam. Disakarida juga akan memberikan hasil positif bila didihkan cukup lama hingga terjadi hidrolisis. a. Prinsip Ion Cu2+ (dari pereaksi Barfoed) dalam suasana asam akan direduksi lebih cepat oleh gula reduksi monosakarida daripada disakarida dan menghasilkan endapan Cu2O berwarna merah bata. b. Cara kerja 1. 1 mL larutan uji karbohidrat dimasukkan kedalam tabung reaksi yang masih kering dan bersih. 2. 1 mL pereaksi Barfoed ditambahkan, kemudian dikocok. 3. Tabung dimasukkan kedalam penangas air selama 3 menit. 4. Dinginkan dalam air mengalir. 5. Bila tidak terjadi reduksi selama 5 menit, lakukan pemanasan selama 15 menit sampai terlihat adanya reduksi. 5. Uji Osazon Untuk membedakan bermacam-macam karbohidrat dari gambar kristalnya. a. Prinsip
Suatu aldosa atau ketosa dengan fenil hidrazin akan membentuk Kristal osazon. Kristal osazon yang terbentuk khas sesuai dengan jenisnya. b. Cara kerja 1. 2 mL larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi 2. Seujung spatel fenilhidrazin-hidroklorida dan kristal natrium asetat ditambahkan ke dalam tabung. 3. Tabung dipanaskan dalam penangas air mendidih selama beberapa menit. 4. Didinginkan perlahan dibawah air keran. 5. Perhatikan kristal yang terbentuk dan diidentifikasi dibawah mikroskop. 6. Uji Tollens Uji ini untuk positif terhadap karbohidrat pentosa yang membedakannya dengan heksosa. Aldehida dapat mereduksi pereaksi Tollens sehingga membebaskan unsur perak (Ag). Pereaksi tollens, pengoksidasi ringan yang digunakan dalam uji ini, adalah larutan basa dari perak nitrat. Larutannya jernih dan tidak berwarna. Untuk mencegah pengendapan ion perak sebagi oksida pada suhu tinggi, maka
ditambahkan
beberapa
tetes
larutan
amonia.
Amonia
membentuk kompleks larut air dengan ion perak. a. Prinsip Aldehid dioksidasi menjadi anion karboksilat, ion Ag+ dalam reagensia Tollens direduksi menjadi logam Ag. Uji positf ditandai dengan terbentuknya cermin perak pada dinding dalam tabung reaksi. b. Cara kerja 1. Masukkan beberapa tetes larutan uji karbohidrat kedalam tabung rekasi yang telah diisi 2 mL pereaksi Tollens. 2. Masukan kedalam penangas air selama 1 menit. Perhatikan perubahan warna yang terjadi. 3. Hasil dicatat
7. Hidrolisa Sukrosa Mengidentifikasi hasil hidrolisis sukrosa a. Prinsip Sukrosa dalam HCl dalam keadaan panas akan terhidrolisis, lalu menghasilkan fruktosa dan glukosa. Hal ini menyebabkan uji Benedict dan Seliwanoff yang sebelumnya hidrolisis menghasilkan hasil negative menjadi positif. Uji Barfoed menjadi positif pula dan menunjukkan bahwa hidrolisis sukrosa menghasilkan monosakarida. b. Cara kerja 1. Isi tabung reaksi dengan 5 mL larutan uji sukrosa. 2. Tambahkan 1 mL HCl 10%. 3.
Masukan kedalam penangas air selama 15 menit.
4. Dinginkan perlahan-lahan, kemudian netralkan. 5. Tes hidrolisa dengan pereaksi Benedict, Seliwanoff dan Barfoed. 6. Catat hasil dan buatlah kesimpulannya 8.
Uji Bial Uji bial untuk menguji adanya gula pentose. Pemanasan pentose dengan HCl pekat akan menghasilkan furfural yang berkondensasi dengan orcinol dan ion feri. Hasil pemanasan akan menghasilkan warna biru hijau yang menunjukkan adanya gula pentosa.
a. Prinsip Dehidrasi pentosa oleh HCl pekat menghasilkan furfural dengan penambahan orsinol (3.5-dihidroksi toluena) akan berkondesasi membentuk senyawa kompleks berwarna biru. b. Cara kerja 1. 5 tetes larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi. 2. 10 tetes peraksi Bial dan 2 tetes HCl pekat ditambahkan
3. Campurlah dengan baik, lalu dipanaskan di atas api kecil sampai timbul gelembung-gelembung gas dipermukaan larutan. 4. Perhatikan warna atau endapan yang terbentuk. Terbentuknya warna biru menunjukan adanya pentose. 9. Uji Iodium Uji iod bertujuan untuk mengidentifikasi polisakarida. Uji iod juga dapat membedakan amilum dengan nitrogen. Reaksi antara polisakarida dengan iodin membentuk rantai poliiodida. Polisakarida umumnya membentuk rantai heliks (melingkar), sehingga dapat berikatan dengan iodin, sedangkan karbohidrat berantai pendek seperti disakarida dan monosakaraida tidak membentuk struktur heliks sehingga tidak dapat berikatan dengan iodin. a. Prinsip Polisakarida dengan penambahan iodium akan membentuk kompleks adsorpsi berwarna yang spesifik. Amilum atau pati dengan iodium menghasilkan warna biru , dekstrin menghasilkan warna merah anggur, sedangkan glikogen dan sebagian pati yang terhidrolisis bereaksi dengan iodium membentuk warna cokelat. b. Cara kerja 1. 3 tetes larutan uji dimasukkan ke dalam tabung reaksi 2. Ditambahkan 2 tetes larutan iodium 3. Diamati perubahan warna yang terjadi 4. 10. Hidrolisa Pati Mengidentifikasi hasil hidrolisis amilum (pati). a. Prinsip Pati dalam suasana asam bila dipanaskan akan terhidrolisis menjadi senyawa-senyawa yang lebih sederhana. Hasil hidrolisis dapat diuji dengan iodium dan menghasilkan warna biru sampai tidak berwarna. Hasil akhir hidrolisis ditegaskan dengan uji Benedict.
b. Cara kerja 1. 5 mL amilum 1% dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2,5 mL HCl 2 N 2. Campurlah dengan baik, lalu dimasukkan ke dalam penangas air mendidih. 3. Setelah 3 menit, ujilah dengan iodium dengan mengambil 2 tetes larutan ditambah 2 tetes iodium dalam porselin tetes. Catatlah perubahan warna yang terjadi. 4. Lakukan uji iodium setiap 3 menit sampai hasil berwarna kuning pucat. 5. Lanjutkan hidrolisis selama 5 menit lagi. 6. Setelah didinginkan, diambil 2 mL larutan hasil hidrolisis, lalu netralkan dengan NaOH 2%. Uji dengan kertas lakmus. 7. Kemudian ujilah dengan Benedict. 8. Simpulkan apa yang dihasilkan hidrolisis pati. 11. Uji Asam Musat Dilakukan untuk membedakan antara glukosa dan galaktosa. a. Prinsip Larutan uji dicampurkan dengan HNO3 pekat kemudian dipanaskan.
Karbohidrat
dengan
asam
nitrat
pekat
akan
menghasilkan asam yang dapat larut. Namun, laktosa dan galaktosa menghasilkan asam musat yang dapat larut. b. Cara kerja 1. 10 tetes larutan uji dan 2 tetes HNO3 pekat dimasukkan di dalam tabung reaksi. 2. Selanjutnya dipanaskan dalam penangas air mendidih sampai volumenya kira-kira tinggal 2-3 tetes. 3. Lalu
didinginkan
perlahan-lahan,
dan
terbentuknya kristal-kristal keras seperti pasir. 4. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop.
perhatikan
B.Uji Kuantitatif 1. Analisis total gula (Metode Anthrone)
Gula dapat bereaksi dengan sejumlah pereaksi menghasilkan warna spesifik. Intensitas warna dipengaruhi oleh konsentrasi gula. Intensitas warna yang terbentuk diukur dengan spektofotometer. Pereaksi Anthrone (9,10-dihidro-9-oksoantrasena) 0,1% dalam asam sulfat pekat. Pereaksi Anthrone bereaksii dengan karbohidrat dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna biru kehijauan. Intensitas absorbansnya diukur pada λ=630nm. Metode ini digunakan untuk analisis total gula bahan padat atau cair. a. Prinsip : Prinsip dasar dari metode anthrone adalah senyawa anthrone akan bereaksi secara spesifik dengan karbohidrat dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna biru kehijauan yang khas. Senyawa anthrone (9,10dihydro-9- oxanthracene) merupakan hasil reduksi anthraquinone. b. Cara kerja 1. Pembuatan kurva standar : a) Kedalam tabung reaksi bertutup, pipet larutan glukosa standar sebanyak 0,2;0,4;0,6;0,8; dan 1,0 ml (glukosa standar 0,2 mg/ml), lalu encerkan sehingga total volume masing-masing tabung 1,0 ml. b) Buat larutan blanko dengan cara memipet 1 ml air destilata ke dalam tabung reaksi lain. c) Tambahkan pereaksi 5 ml Anthrone dengan cepat ke dalam larutan glukosa standard an blanko kemudian tutup. Voertex dan kocok hingga merata. d) Panaskan tabung reaksi di atas penangas air 100 oC selama 12 menit. Dinginkan e) Pindahkan larutan ke dalam kuvet dan baca absorbans dengan UV-Vis spektrofotometer pada 630 nm. f) Buat plot kurva yaitu konsentrasi (g) glukosa standar pada sumbu x dan nilai absorbans pada sumbu y.
2. Analisis contoh : a) Lakukan pengenceran contoh b) Masukkan sebanyak 1ml contoh kedalam tabung reaksi tertutup c) Lakukan tahap seperti pada pembuatan kurva standar 3. Perhitungan Perhitungan metode ini adalah dengan menentukan konsentrasi gula dalam contoh mengguanakan kurva standar (hubungan antara konsentrasi gula standar dengan absorbans) dan memperhitunkan pengenceran yang dilakukan. Rumusnya dapat ditulis sebagai berikut. Total gula (%) = ((GxFP)/W)x100 Dimana: G
= konsentrasi gula dari kurva standar
FP
= faktor pengenceran
W
= berat contoh (gram)
(gram)
2. Analisis total gula (Metode Fenol) Metode ini digunakan untuk menetapkan total gula semua bahan pangan. Sebelumnya contoh harus disiapkan seperti pada persiapan contoh untuk analisis gula. a. Prinsip Gula
sederhana,
oligosakarida,
polisakarida,
dan
turunannya dapat bereaksi dengan fenol dalam asam sulfat pekat menghasilkan warna oranye kekuningan yang stabil. b. Prosedur 1.
Pembuatan kurva standar :
a) Ambil sebanyak 2ml larutan pada beberapa konsentrasi b) Tambahkan 1ml larutan fenol (5%), lakukan vortex c) Tambahakan 5 ml larutan asam sulfat pekat dengan cepat secara tegak lurus kepermukaan cairan d) Diamkan selama 10 menit, vorteks, dan tempatkan dalam penangas air selama 15 menitUkur absorbansnya pada 490nm untuk hekstosa sedangkan untuk pentosa dan asam uronat 480 nm. e) Buat plot kurva standar. Lalu tentukan persamaan regresi linier. 2. Analisis contoh a) Lakukan pengenceran contoh b) Masukkan 2ml contoh ke dalam tabung reaksi dan lakukan tahap seperti pada pembuatan kurva standar. 2. Perhitungan Perhitungan menggunakan metode fenol adalah konsentrasi gula dalam contoh ditentukan dengan menggunakan kurva standar (hubungan antara konsentrasi gula standar dengan absorbans) dan memperhitungkan
pengenceran
yang
dilakukan.
perhitungannya dapat ditulis sebagai berikut. Total gula (%) = ((GxFP)/W)x100 Dimana: G
= konsentrasi gula dari kurva standar (gram)
FP
= faktor pengenceran
W
= berat contoh (gram)
3. Analisis gula reduksi (Metode Lane-Eynon)
Rumus
Gula
pereduksi
dalam
bahan
pangan
dapat
ditentukan
konsentrasinya berdasarkan pada kemampuannya untuk mereduksi pereaksi lain. Analisis gula pereduksi dengan metode Lane-Eynon dilakukan secara volumetri dengan titrasi/titrimetri. Metode ini digunakan untuk penentuan gula pereduksi dalam bahan padat atau cair seperti laktosa, glukosa, fruktosa, maltosa. a. Prinsip Metode Lane-Eynon didasarkan pada reaksi reduksi pereaksi Fehling oleh gula-gula pereduksi. Penetapan gula pereduksi dengan melakukan pengukuran volume larutan gula pereduksi standar yang dibuthkan untuk mereduksi pereaksi tembaga (II) basa menjadi tembaga (II) oksida (Cu2O). Udara yang mempengaruhi reaksi dikeluarkan dari campuran reaktan dengan cara mendidihkan laruta selama titrasi. Titik akhir titrasi ditunjukkan dengan metilen blue yang warnanya akan hilang karena kelebihan gula pereduksi di atas jumlah yang dibutuhkan untuk mereduksi semua tembaga b. Prosedur 1. Standarisasi larutan fehling : a) Masukkan 10 ml laruta campuran Fehling A dan B kedalam erlenmeyer dan tambah 2-4 tetes metilen blue 0,2%. b) Kemudian lakukan tahapan seperti pada analisis contoh. 2. Analisis contoh : a) Campurkan larutan fehling A dan B dengan volume yang sama b) Pipet 10 ml larutan dari hasil persiapan contoh kedalam erlemeyer
c) Tambahkan
kedalam
erlenmeyer
10 ml larutan
campuran fehling A dan B serta 2-4 tetes metilen blu 0,2 %. d) Panaskan campura larutan di atas hot plate magnetic stirrer e) Setelah mendidih, lakukan titrasi sengan larutan gula standart sampai warna biru hilang f) Titrasi
dilakukan
dengan
cepat,
maka
perlu
ditambahkan larutan glukosa standar dengan volume tertentu. 3. Perhitungan Gula pereduksi (%) = [(V0-Vs)xGxTsxFx100]/(TxW) Dimana: Vo
= volume larutan glukosa standar untuk titrasi larutan
Fehling (ml) Vs
= volume larutan glukosa standar untuk titrasi contoh
(ml) G
= konsentrasi larutan glukosa standar (g/ml)
Ts
= volume contoh total dari persiapan contoh (ml)
T
= volume contoh yang diperlukan untuk titrasi (ml)
W
= berat contoh (g)
F
= faktor pengenceran
3. Analisis Gula Reduksi (Nelson-Somogyi) Metode in digunakan unttuk mengetahui kadal gula pereduksi dalam sampel. a. Prinsip Metode Nelson-Somogyi didasarkan pada reaksi reduksi pereaksi tembaga sulfat oleh gula-gula pereduksi. Gula
pereduksi mereduksi pereaksi tembaga (II) basa menjadi tembaga (I) oksida (Cu2O). Cu2O ini bersama dengan arsenomolibdat
membentuk
senyawa
komplek
berwarna.
Intensitas warna menunjukkan banyaknya gula pereduksi dengan pengujian menggunakan λ=520 nm. b. Prosedur Kerja 1.
Pembuatan kurva standar a) Siapkan 6 tabung reaksi masing masing diisi dengan 0; 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 dan 1 ml larutan glukosa standar. b) Tambahkan aquadest dalam tiap tiap tabung tersebut sehingga volume untuk tiap-tiap tabung mencapai 1 ml c) Tambahkan 1 ml reagensia Nelson pada tiap-tiap tabung dan panaskan dalam air mendidih selama 20 menit d) Dinginkan semua tabung dengan cara direndam dalam air dingin hingga suhu mencapai 250C e) Tambahkan 1 ml reagen Arsenomolibdat pada tiap-tiap tabung,
kocok
homogen
sampai
semua
endapan
kuprooksida larut semua. f) Tambahkan 7 ml aquadest,kocok homogen g) Tera
absorbansinya
pada
λ
540
nm
dengan
spektrofotometer h) Buat kurva standar hubungan antara absorbansi dan konsentrasi i) Tentukan persamaan kurva standarnya 2. Penentuan kadar gula reduksi sampel: a) Ambil 1 ml larutan sampel jernih, lakukan prosedur yang sama dengan pembuatan kurva standar mulai dari no. 3 – 7. b) Tentukan kadar gula reduksi sampel dengan menggunakan persamaan kurva standar. 3. Perhitungan
Perhitungan dalam metode ini adalah kandungan gula pereduksi dalam contoh ditentukan dengan menggunakan kurva standar (hubungan antara konsentrasi gula standar dengan absorbans) dan memperhitungkan pengenceran yang dilakukan. Apabila kandungan gula pereduksi diketahui, maka kandungan gula non-pereduksi dapat ditentukan sebagai selisih antara kadar total gula dengan kadar gula pereduksi. Total gula = gula pereduksi + gula non-reduksi 4. Analisis Total Pati, Amilosa, Amilopektin Kandungan pati dalam bahan pangan dapat ditentukan secara volumetrik/titrimetri atau kolorimetri. Penentuan total pati adalah dengan cara menghidrolisis pati secara sempurna menjadi glukosa. Hidrolisis pati menjadi gula dapat terjadi saat ada perlakuan asam yaitu memecah ikatan glikosidik yang menghubungkan antar glukosa. Dapat juga terjadi secara enzimatis (enzim α-amilase dan glukoamilase) yang memecah molekul-molekul amilosa dan amilopektinn menjadi gula sederhana. Kandungan glukosa dapat ditentukan menggunakan metode penetapan gula seperti metode Anthrone, metode fenol, metode Lane-Eynon, metode Nelson-Somogyi. Kandungan pati ditentukan menggunakan fakor pengali (0,9). Sehingga kandungan pati adalah kandungan glukosa x 0,9. Dapat ditentukan untuk analisis kadar pati pada contoh padat atau cair. a. Prosedur kerja 1.
Persiapan sampel
a) Masukkan sebanyak 2 – 5 g contoh padat atau cair ke dalam gelas (untuk contoh padat perlu dihaluskan dahulu) b) Tambahkan ke dalam gelas piala sebanyak 50 ml alkohol 80%. Aduk selama 1 jam
c) Saring suspensi yang terbentuk dengan kertas saring dan cuci dengan air sampai volume filtrat 250 ml (filtrat ini mengandung karbohidrat yang larut dan dibuang) d) Untuk menghilangakn lemak, cuci pati yang terdapat sebagai residu dengan 10 ml eter (sebanyak 5 kali). Saring setiap pencucian dengan kertas saring. Biarkan menguap eter yang tersisa dalam residu. e) Cuci lagi residu dengan 150 ml alkohol 10% untuk membebaskan lebih lanjut karbohidrat yang terlarut. f) Pindahkan residu secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam gelas piala dengan cara pencucian dengan 200 ml air. Tambahkan 20 ml HCl 25%. g) Tutup suspensi residu di dalam gelas piala dengan pendinginan balik (kondensor). h) Setelah didinginkan, netralkan larutan yang terbentuk dengan larutan NaOH 45% dan masukkan ke dalam labu takar 500 ml secara kuantitatif. i) Tepatkan larutan sampai tanda tera dengan menggunakan air destilat. j) Saring kembali larutan dengan menggunakan kertas saring. 2.
Pembuatan kurva standar 1. Timbang sebanyak 40 mg amilosa murni dan masukkan ke dalam tabung reaksi. 2. Tambahkan ke dalam tabung reaksi 1 ml etanol 95% dan 9 ml NaOH 1N. 3. Panaskan tabung reaksi di dalam air mendidih sekitar 10 menit sampai semua amilosa membentuk gel.
4. Setelah
didinginkan,
pindahkan
campuran
secara
kuantitatif ke dalam labu takar 100ml dan tepatkan dengan air sampai tanda tera 5. Pipet gel amilosa (beberapa seri konsentrasi) ke dalam labu takar 100ml 6. Tambahkan ke dalam masing – masing labu takar asam asetat 1N, kemudian tambahkan masing – masing 2 ml larutan iod. 7. Tepatkan larutan iod dengan air hingga tanda tera. 8. Setelah didiamkan selama 20 menit, ukur absorbans dari intensitas warna biru dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 625 nm. 9. Buat kurva standar sebagai hubungan antara kadar amilosa (sumbu x) dengan absorbans (sumbu y) 3. Analisis contoh : 1. Gunakan contoh tepung yang mengandung pati (apabila contoh mengandung komponen lain maka pati perlu diekstrak dahulu) 2. Timbang sebanyak 100mg contoh dan masukkan ke dalam tabung reaksi 2. Tambahkan ke dalam tabung reaksi 1ml etanol 95% dan 9ml NaOH 1 N. 3. Panaskan
tabung
reaksi
selama
10
menit
untuk
menggelatinisasi pati 4. Setelah didinginkan, masukkan pasta pati ke dalam labu takar 100ml dan tepatkan hingga tanda tera dengan menggunakan air
5. Pipet larutan pati tersebut dan dimasukkan ke dalam labu takar 100ml, lalu ditambahkan asam asetat 1N, 2 ml larutan iod, dan air hingga tanda tera 6. Setelah didiamkan selama 20 menit, ukur absorbansinya dengan spektrofotometer pada 625 nm. 4.
Perhitungan Kandungan amilosa ditentukan berdasarkan kemampuan amilosa untuk bereaksi dengan senyawa iod yang menghasilkan kompleks berwarna biru. Intensitas warna biru tergantung pada kadar amilosa dan dapat ditentukan secara spektofotometri. Kandungan amilopektin ditentukan sebagai selisih antara kandungan pati dengan amilosa. Pati = amilosa + amilopektin Perhitungan dalam menentukan berat pati dalam contoh diperoleh dengan mengalikan berat glukosa dengan 0,9. Angka 0,9 adalah faktor konversi untuk pembentukan glukosa dari hidrolisa pati.
Perhitungan kadar amilosa ditentukan
dengan menggunakan kurva standar, dengan menggunakan rumus: Kadar amilosa (%) = (CxVxFPx100)/W Dimana, C= konsentrasi amilosa contoh dari kurva standar (mg/ml) V
= volume akhir contog (ml)
FP
= faktor pengenceran
W
= berat contoh (mg)
Kadar amilopektin (%) = Kadar pati (%) – Kadar amilosa (%)
5. Analisis Karbohidrat Yang Tidak Dapat Dicerna Analisis Karbohidrat Yang Tidak Dapat Dicerna yaitu meliputi Analisis serat kasar (crude fiber) dan analisis serat makanan (dietary fiber).Serat kasar ditentukan dari residu setelah contoh diperlakukan dengan asam dan basa kuat. Serat makanan ditentukan berdasarkan kadar acid detergent fiber (ADF) dan neutral detergen fiber (NDF). ADF itu sendiri terdiri dari sebagian besar selulosa dan lignin, dan sebagian kecil hemiselulosa dan substansi pektat sehingga umumnya dianggap sebagai selulosa dan lignin. NDF terdiri dari selulosa, hemiselulosa, dan lignin. Penetapan lignin yaitu dengan metode klason. Sedangkan penetapan substansi pekat dengan metode spektrifotometer. Kadar hemiselulosa diperoleh dengan menghitung selisih kadar NDF dengan kadar ADF. Kadar selulosa diperoleh dengan menghitung selisih kadar ADF dan kadar Lignin. Total serat makanan dihitung dengan menjumlahkan kadar NDF dengan kadar substansi pektat. Serat kasar yaitu residu dari bahan makanan yang telah diperlakukan dengan asam dan alkali mendidih. Terdiri dari selulosa, sedikit lignin dan pentose. a. Prosedur Kerja • Giling contoh sampai halus sehingga dapat melewati saringan berdiameter 1 mm. Bila contoh tidak dapat dihaluskan, maka digiling hingga homogen. • Timbang sebanyak 2 gram contoh dan ekstrak lemaknya dengan menggunakan soxhlet dengan pelarut petrolium eter. • Pindahkan contoh yang sudah bebas lemak secara kuantitatif ke dalam erlenmeyer. Tambahkan 0,5 g asbes yang telah dipijarkan dan 2 tetes zat anti buih.
• Tambahkan ke dalam erlenmeyer sebanyak 200 mL larutan H2SO4mendidih. • Letakkan erlenmeyer di dalam pendingin balik. • Didihkan contoh di dalam erlenmeyer selama 30 menit dengan sesekali digoyang-goyangkan. • Setelah selese saring suspensi dengan kertas saring. • Cuci residu yang tertinggal dengan air mendidih. Pencucian dilakukan hingga air cucian tidak bersifat asam lagi (diuji dengan kertas lakmus). • Pindahkan residu secara kuantitatif dari kertas saring ke dalam erlenmeyer kembali. • Cuci kembali sisa residu di kertas saring dengan 200 mL larutan NaOH mendidih sampai semua residu masuk ke dalam erlenmeyer. • Didihkan kembali contoh selama 30 menit dengan pendingin balik sambil sesekali digoyang-goyangkan. • Saring kembali contoh melalui kertas saring yang diketahui beratnya sambil dicuci dengan K2SO4 10%. • Cuci residu di kertas saring dengan air mendidih kemudian dengan alkohol 95%. • Keringkan kertas saring dalam oven 1100C sampai 1-2 jam. • Setelah didinginkan dalam desikator, timbang conto • Hitung berat residu serat kasar dengan menghitung selisih antara berat contoh dan kertas saring dengan berat kertas saring.
b. Perhitungan Kadar
serat
kasar
(g/100
g
contoh)
= [(W2-
W1)/W]/x100 Dimana: W2= berat residu kertas saring yang telah dikeringkan (g) W1
= berat kertas aring
W
= berat contoh yang dianalisis.
Daftar Pustaka
Nurlita. 2009 .Karbohidrat. Diakses dalam (http://filzahazny.wordpress.com / 2009/07/10/ karbohidrat/). Diakses pada tanggal 22 April 2013. Riyadi,Wahyu.2009.Uji
Kualitatif
(http://wahyuriyadi.blogspot
Karbohidrat. .com
Diakses
/2009/
dalam
10/uji-kualitatif-
karbohidrat.html) Diakses pada tanggal 22 April 2013 Sudarmaji, B. dkk. 1982. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Liberty : Yogyakarta Yazid, Estien dan Lisda, Nursanti. 2006. Penuntun Praktikum BIOKIMIA untuk Mahasiswa Analis. Andi Offset : Yogyakarta. Winarno, F.G. 1986. Kimia Pangan dan Gizi. Gramedia : Jakarta
