LAPORAN PRAKTIKUM ANALISA PANGAN ANALISA KUANTITATIF MIKROBA (METODE TPC DAN MPN)
DISUSUN OLEH: FAHRUDIN YUDA KARTIKA
PROGRAM PENDIDIKAN CALON PENDIDIK AKADEMI KOMUNITAS JURUSAN TEKNOLOGI PANGAN POLITEKNIK NEGERI LAMPUNG BANDAR LAMPUNG 2013
I. PENDAHULUAN A. Teori
Suatu jenis koloni mikroba yang terpisah dari koloni campurannya akan lebih mudah untuk diamati. Selain itu teknik untuk memisahkan dan mendapatkan koloni tunggal serta pemeliharannya terdapat beberapa jenis. Teknik-teknik tersebut memiliki kelebihan dan kelemahan. Beberapa cara dapat dilakukan untuk menentukan jumlah bakteri yang terdapat pada bahan pemeriksaan. Cara yang paling sering digunakan adalah cara penghitungan koloni pada lempeng pembiakan ( plate count ), atau juga dapat dilakukan penghitungan langsung secara mikroskopis (Burrows, 2004). Media agar merupakan substrat yang sangat baik untuk memisahkan campuran mikroorganisme sehingga masing-masing jenisnya menjadi terpisahpisah. Teknik yang digunakan untuk menumbuhkan mikroorganisme pada media agar memungkinkannya tumbuh dengan agak berjauhan dari sesamanya, juga memungkinkan setiap selnya berhimpun membentuk koloni, yaitu sekelompok massa sel yang dapat dilihat dengan mata telanjang. Bahan yang diinokulasikan pada medium disebut inokulum, dengan menginokulasi medium agar nutrient (nutrien agar) dengan metode cawan gores atau media cawan tuang, sel-sel mikroorganisme akan terpisah sendiri-sendiri. Setelah inkubasi, sel-sel mikroba individu memperbanyak diri secara cepat sehingga dalam waktu 18 sampai 24 jam terbentuklah massa sel yang dapat dilihat dan dinamakan koloni. Koloni dapat terlihat oleh mata telanjang. Setiap koloni merupakan biakan murni satu macam mikroorganisme (Pelczar dan Chan, 2007). Perhitungan secara tidak langsung ada beberapa cara yaitu : perhitungan pada cawan petri (total plate count) TPC, perhitungan melalui pengenceran, perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (MPN metode), dan kalorimeter (cara kekeruhan atau turbidimetri). Metode MPN terdiri dari tiga tahap, yaitu uji pendugaan (presumtive test), uji konfirmasi (confirmed test), dan uji kelengkapan (completed test). Dalam uji tahap pertama, keberadaan coliform masih dalam tingkat probabilitas rendah; masih dalam dugaan. Uji
ini mendeteksi sifat fermentatif coliform dalam sampel (Dwidjoseputro, 1994). Teknik Pour Plate
adalah suatu teknik dalam menumbuhkan
mikroorganisme dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar cair dengan stok kultur. Teknik ini umumnya digunakan pada metode Total Plate Count (TPC). Sedangkan teknik streak plate adalah suatu teknik dalam menumbuhkan mikroorganisme dalam media agar dengan cara menggores ( streak ) permukaan agar dengan jarum yang telah diinokulasi dengan kultur mikroba. Teknik ini menjadikan mikroorganisme tumbuh dan tampak pada goresan-goresan inokulasi bekas jarum (Radchie, 2008). Produk pangan mempunyai batas
waktu tertentu untuk dapat
dikonsumsi secara aman. Hal ini dikarenakan bahan pangan mengalami penurunan mutu mikrobiologis ditandai dengan nilai TPC dan MPN melebihi batas maksimal yang disebabkan oleh aktivitas pertumbuhan mikroorganisme meningkat
selama
penyimpanan.
Factor-faktor
yang
menyebabkan
meningkatnya aktivitas petumbuahan mikroba antara lain : nutrient, aktivitas air, waktu, suhu, nilai pH (Suardana, 2009).
B. Tujuan
1. Mampu melakukan metode hitungan cawan (PCA) dan MPN. 2. Menerapkan cara pelaporan menggunakan standart plate count dan MPN.
II. METODOLOGI A. Waktu dan Tempat
Praktikum analisa kuantitatif metose TPC dan MPN ini dilaksanakan pada hari Rabu, 6 Februari 2013. Dimulai pukul 13.00 sampai 16.00 WIB, bertempat di Laboratorium THP, Politeknik Negeri Lampung.
B. Alat dan Bahan
1. Alat a. Jarum ose
g. Tabung berulir
b. Bunsen
h. bulb
c. Cawan petri
i. Pipet
d. Autoklaf
j. Stick L
e. Pinset
k. Tabung Durham
f. Tabung reaksi 2. Bahan a. Suspensi bakteri, khamir dan kapang b. Kapas c. Aquadest d. Nutrien Broth e. Plate Count Agar f. Potato Dextrose Agar
g. NaCl h. Alkohol
C. Cara Kerja 1. Pembuatan Media
a. Siapkan alat (pinset, jarum ose, pipet volumetrik, cawan petri) dan bahan (media, aquades) yang akan disterilisasi. b. Timbang 8,75 g PCA, 4,85 g PDA, 6,5 g LB dan 1,75 g NaCl,
Penimbangan harus dalam keadaan steril c. Masukkan masing-masing bahan dalam erlenmeyer
d. Tambahkan aquades dingin masing-masing 50 ml ke dalam bahan panaskan air, kemudian tambahkan ke dalam erlenmyer yang sudah berisi bahan e. Masing-masing ke dalam Erlenmeyer tambahkan aquades panas untuk
PCA sampai 500 ml, PDA sampai 150 ml, LB masing-masing (double sampai 250 ml, dan single sampai 500 ml), NaCl sampai 200 ml. f. Cek pH, homogenkan larutan yang sudah dibuat g. Masukkan ke dalam tabung berulir masing-masing media dan
masukkan tabung durham dalam posisi terbalik h. LB 75 tabung @ 9 ml, larutan pengencer 35 tabung @ 9 ml, PDA ke
dalam Erlenmeyer (ditutup dengan aluminium foil). i.
Sterilisasi dalam autoklaf selama 15 menit dengan suhu 1210C Angkat masing-masing alat dan media yang sudah disterilisasi
2. TPC a. Cuci tangan dengan sabun antibakteri dan bilas dengan alkohol. b. Siapkan sampel yang akan diuji (susu kedelai). Nyalakan bunsen, dan
siapkan pipet untuk masing-masing pengenceran beda pipet. c. Ambil 1 ml sampel kemudian masukkan kedalam larutan pengencer d. Homogenkan larutan dan tandai dengan label pengenceran 10 -1. e. Ambil 1 ml dari pengenceran 10 -1, kemudian masukkan ke dalam
larutan pengencer. Lakukan prosedur yang sama sampai pengenceran 10-5. f. Ambil 1 ml dari pengenceran 10-4 dan 10-5, kemudian masukkan ke
dalam cawan petri yang berbeda. Tuang media PCA dan ratakan. g. Inkubasi selama 2 hari dalam posisi cawan dibalik. h. Amati dan hitung nilai SPC.
3. MPN a. Cuci tangan dengan sabun antibakteri dan bilas dengan alkohol. b. Siapkan 15 tabung berulir yang berisi LB dan tabung durham c. Beri label 10, 1, dan 0,1 masing-masing sebanyak 5 tabung
d. Ambil masing-masing 10 ml masukkan dalam masing-masing 5
tabung LB label 10. e. Ambil masing-masing 1ml masukkan dalam masing-masing 5 tabung
LB label 1. f. Ambil masing-masing 0,1 ml masukkan dalam masing-masing 5
tabung LB label 0. g. Inkubasi selama 2 hari. Amati dan hitung nilai MPNnya h. Jika hasil positif lanjutkan dengan uji penguat dalam media BGLBB. i.
Ambil 1 ose dari tabung yang positif kemudian masukkan dalam media BGLBB. Inkubasi selama 2 hari
j.
Amati perubahannya dan catat hasil pengamatan.
III. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN A. Hasil Pengamatan
Tabel. 1 Hasil Pengamatan Nilai SPC Susu Kedelai NO Gambar Pengenceran 1.
Perhitungan
TBUD 10-3
2.
10-4
TBUD
3.
240 10-5
202
B. Pembahasan
Pengukuran kuantitatif populasi mikroorganisme sangat diperlukan untuk berbagai macam penelaahan mikrobiologis. Terdapat berbagai macam cara untuk menghitung jumlah mikroorganisme, akan tetapi secara mendasar, ada dua cara yaitu secara langsung dan secara tidak langsung. Salah satu metode perhitungan adalah TPC dan MPN (Hastowo, 1992). Metode total plate count (TPC) merupakan analisis untuk menguji cemaran mikroba dengan menggunakan metode pengenceran dan metode cawan tuang. Metode cawan tuang adalah metode per plate. Metode ini dilakukan
dengan mengencerkan sumber isolate yang telah diketahui beratnya ke dalam larutan garam fisiologis, kemudian dimasukkan ke dalam cawan petri steril, dilanjutkan dengan menuangkan media penyubur untuk makanan mikroba (dwidjoseputro, 2005). Prosedur pengenceran populasi mikroba meliputi : ambil 1 ml sampel dimasukkan dalam 9 ml larutan garam fisiologis yang dibuat dari larutan NaCl untuk memperoleh pengenceran 1/10 bagian. Sampel yang diamati pada praktikum kali ini adalah the basi. Dari pengenceran 1/10, selanjutnya diambil 1 ml dimasukkan ke dalam 9 ml garam fisiologis untuk memperoleh dilusi 1/100 bagian dan seterusnya hingga diperoleh pengenceran yang diinginkan. Tujuan pengenceran media adalah apabila tiap media pengenceran ditumbuhkan ke dalam suatu media, maka koloni yang tumbuh dapat dihitung sehingga jumlah sel mikroba dapat diketahui dengan persamaan :
Pengenceran media sampai diperoleh pengenceran 1/105 bagian. Dan inokulasi media pengenceran dalam cawan petri menggunakan metode pour plate
diambil
3 pengenceran
tertinggi.
Dari
pengenceran
yang akan
diinokulasikan diambil 1 ml dan dituangkan dalam cawan petri kemudian ditambahkan PCA dan diaduk dengan membentuk angkan delapan atau sampai merata. Setelah itu media inokulasi diinkubasi selama 24 jam pada suhu 36 oC. Dari tabel pengamatan didapatkan pengenceran 1/10 3 dan 1/104 bagian terlalu banyak untuk dihitung (TBUD). Pada cawan petri tampak koloni yang menyebar merata hamper pada semua bagian cawan. Pada pengenceran 1/10 5 koloni mikroba dapat dihitung. Perhitungan mikroba sebenarnya dapat dilakukan secara 4 kuadran, 2 kuadran atau dihitung semua. Koloni yang besar atau kecil tetap dibaca sebagai 1 koloni. Hasilnya pada cawan pertama terhitung 240 koloni dan pada cawan kedua terhitung 202 koloni. Sehingga perhitungan TPC diperoleh dari rata-rata pengenceran 1/10 5 bagian.
Metode MPN didasarkan pada metode statistik (teori kemungkinan). Metode MPN ini umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air minum. Sampel ditumbuhkan pada seri tabung sebanyak 3 atau 5 buah tabung reaksi untuk setiap kelompok. Apabila dipakai 3 tabung maka disebut seri 3, dan jika dipakai 5 tabung maka disebut 5 seri (Lay, 1992). Untuk pengamatan dan perhitungan mikroba dengan metode MPN Perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu tabung yang ditumbuhi oleh mikroba setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau terbentukya gas dalam tabung durham untuk mikroba pembentuk gas. Pada umumnya, untuk setiap tingkat pengenceran digunakan 3,5 atau 7 seri tabung. Semakin banyak seri pengenceran yang digunakan akan diperoleh hasil yang lebih akurat. Perhitungan
mikroba dengan metode MPN
dilakukan
dengan
menggunakan Lactose Brooth double strength dan LB single strength. Lactose brooth double strength diisi dengan media the basi sebanyak 10 ml pada masing-masing tabung. LB Single Strength diisi dengan 1 ml the basi dan LB single strength tabung kecil diisi dengan the basi 0,1 ml. tiap tabung telah dilengkapi dengan tabung durham dengan posisi terbalik. Masing-masing Lactose Brooth ada 5 tabung, jadi jumlah keseluruhan adalah 15 tabung. Kemudian diinkubasi dalam incubator suhu 36 0C selama 1 hari. Hari berikutnya dilakukan pengamatan apakah larutan sudah berubah jadi keruh atau sudah menghasilkan gas hingga ¾ bagian dalam tabung durham. Hasil yang diperoleh pada LB DS 10 ml larutan menjadi keruh dan gas yang terbentuk sampai ¾ bagian hanya ada 1 tabung. Pada LB SS 1 ml larutan menjadi keruh tapi tidak ada tabung yang terbentuk gas sampai ¾ bagian. LB
SS 0,1 ml larutan juga menjadi keruh dan gas yang terbentuk tidak ada yang mencapai ¾ bagian. Jadi data yang terbaca pada tabel MPN adalah 1-0-0 dengan nilai MPN 2.0, sehingga perhitungan MPN adalah :
koloni per ml Selanjutnya dari tabung LB DS 10 ml yang positif atau tabung durhamnya terisi lebih dari ¾ bagian gas diambil sedikit saja dengan jarum ose. Jarum ose yang telah dimasukkan dalam LB DS 10 ml positif kemudian dimasukkan dalam BGLBB dan diinkubasi selama 24 jam untuk diketahui apakah ada perbahan warna. Hasilnya pada BGLBB berubah warna dari hijau pekat menjadi sedikit kekuningan. Itu berarti pada teh basi positif terinfeksi dengan E. Coli atau Coliform.
IV. KESIMPULAN
1. Salah satu metode perhitungan jumlah mikrobiologi adalah TPC dan
MPN. 2. Metode total plate count (TPC) merupakan analisis untuk menguji
cemaran mikroba dengan menggunakan metode pengenceran dan metode cawan tuang. 3. Jumlah perhitungan mikroba pada sampel teh basi dengan menggunakan
metode TPC adalah sebesar 2,2 x 10 7 koloni per mili. 4. Jumlah perhitungan mikroba pada sampel teh basi dengan metode MPN
adalah sebesar 2 x 101 koloni per mili
DAFTAR PUSTAKA
Burrows, W., J.M. Moulder, and R.M. Lewert. 2004. Texbook of Microbiology. W.B. Saunders Company, Philadelphia. Dwijoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan. Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi pangan I. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta. Hastowo, Sugyo. 1992 .Mikrobiologi. Jakarta: Rajawali. Lay, Bibiana W. 1992. Analisis Mikroba Di Laboratrium. Jakarta: Rajawali. Pelczar, M. J., Chan, E.C.S. 2007. Elements of Microbiology. Mc Graw Hill Book Company. New York. Rachdie.
2008.
Faktor
http://rachdie
yang
Mempengaruhi
Pertumbuhan
Mikroba.
.blogsome.com/2006/10/14/faktor-yang
mempengaruhipertumbuhan- mikroba/. Suardana, IW. Swacita, IBN. 2009. Higiene Food . Udayana University Press:Denpasar
