Acción De Los Microorganismos Microorganismos Sobre Sobre Diversos Diversos Sustratos Sustratos INTRODUCCION Saber el comportamiento de los microorganismos sobre diversos sustratos desde un aislamiento bacteriano puede realizarse utilizando diferentes combinaciones de características y diferentes criterios en la evaluación de similitudes. Los ensayos bioquímicos tradicionalmente utilizados llamadas pruebas bioquímicas convencionales, generalmente determinan la actividad de una vía metabólica (conjunto de reacciones químicas) a partir de un sustrato que se incorpora en un medio de cultivo y que la bacteria al crecer transforma o no. Existen diferentes sistemas que facilitan la realización de tales ensayos, porque proponen el mejor conjunto de pruebas bioquímicas para la identificación de un grupo bacteriano, porque simplifican la interpretación de un resultado utilizando un valor numérico, porque proveen los reactivos prontos para su uso o porque son totalmente automatizables. Las pruebas o ensayos bioquímicos, son pruebas simples que se han desarrollado para demostrar en forma clara una determinada característica bioquímica como presencia o ausencia de una determinada actividad enzimática, grupo de enzimas o determinada vía metabólica, crecimiento a una determinada temperatura, crecimiento en presencia de inhibidores, etc. No significan de ninguna manera un estudio profundo del metabolismo bacteriano. Para realizar las pruebas bioquímicas se dispone de múltiples medios, los cuales se deben aplicar de acuerdo a las exigencias del microorganismo en estudio. Entre las pruebas que utilizamos en esta práctica fueron: Hidrólisis del almidón, fermentación de azucares, reacción de Vogues Proskauer, Formación del indol, Producción del hidrogeno sulfurado, Hidrólisis de la urea, asimilación del citrato. I. DEGRADACION DE CARBOHIDRATOS Las pruebas de hidrólisis y fermentación de carbohidratos son muy importantes para la identificación de las bacterias. Los medios, para estudiar la degradación de estos compuestos, se preparan por lo general añadiendo 0.5% del carbohidrato a un medio básico sin carbohidrato. Algunas bacterias bacterias son son capaces capaces de usar usar moléculas moléculas complejas como fuentes fuentes de carbono, carbono, utilizan hidrolasas, que fragmentan sus moléculas y liberan otras más pequeñas, que pueden ser transportadas al interior de la célula bacteriana. En términos generales, las hidrolasas son enzimas inducidas. Po lo tanto para estudiar la capacidad hidrolitica de determinada bacteria, es deseable cultivarla previamente en un medio cuya fuente de carbono sea únicamente la sustancia cuya hidrolasa se desea detectar, para que la bacteria induzca su síntesis. a) HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN El almidón es un homopolisacarido de la glucosa, cuyos componentes son la amilosa lineal y la amilopectina ramificada. Para utilizarlo, algunas bacterias sintetizan una exoenzima llamada amilasa que hidroliza los enlaces glucosidicos alfa1-4, liberan maltosa
y isomaltosa, que ingresan a la célula y pueden metabolizarse. Para evidenciar la presencia de amilasa, se recurre a que el almidón, forma un complejo de color azul intenso con el yodo. Las bacterias de la amilopectina dan solo un color café rojizo y el almidón hidrolizado no dan ninguna coloración. Por lo tanto, la ausencia de color azul indica que el almidón ha sido hidrolizado. La producción de amilasa es útil para diferenciar especies de bacillus, de streptococcus, y de lactobacillus. De igual forma se aplica a esquemas de diferenciación de algunas bacterias aerobias y anaerobias como Actinomyces bacteroides, clostridium y fusobacterium. MATERIALES Primer periodo * Cultivos de 18 a 24 horas de escherichia coli y de aeromonas hydrophila, cultivados en agar nutritivo con 0.2% de almidón. * 1 placa petri con agar nutritivo con 0.2% de almidón. Segundo periodo * Botella gotero con solución de yodo al 1% en alcohol al 50%( también puede utilizarse yoduro acuoso de gran o solución de lugol). METODOS Primer periodo Con lápiz de cera marcar una línea que divida el fondo del plato de agar nutritivo con almidón en dos sectores. Con el asa, inocular el microorganismo en cada sector, hacer una estría que no toque las paredes de la placa; así quedara una zona central sin inocular entre las 2 estrías, que servirá de control. Incubar a 35ºC durante 48 horas. Segundo periodo Después de la incubación. Levantar con el asa parte del crecimiento de ambas bacterias e inundar el plato con la solución de yodo. Observar la apariencia que toma el agar. CUIDADOS * El reactivo (yodo) debe guardarse en botella ámbar en refrigeración. * El reactivo debe probarse semanalmente con una cepa positiva y otra negativa para esta prueba, pues durante el almacenamiento la solución pierde color. La solución debe descartarse cuando una cepa positiva conocida de una reacción negativa o débilmente positiva. * La prueba debe interpretarse inmediatamente luego de añadir el reactivo, debido a que el color azul tiende a desvanecerse con el tiempo. * El medio de cultivo no debe sobrecalentarse debido a que el almidón puede hidrolizarse y dar resultados positivos falsos. * b) REACCIÓN DE VOGES-PROSKAUER (VP) Determina la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, la
acetil-metil carbonil a partir de la fermentación de glucosa. La reacción de VP se basa en la detección de acetil-metil carbonil como producto final neutro derivado del metabolismo de la glucosa. Ésta es metabolizada en ácido pirúvico, intermediario clave en la glucólisis. A partir del ácido pirúvico, una bacteria puede seguir muchas vías. La producción de acetil-metil carbonil (precursor de la producción de 2,3butanediol) que es uno de los ciclos para la degradación de la glucosa en las bacterias. La formación de acetil-metil carbonil y butilenglicol es una vía alternativa del metabolismo del ácido pirúvico. Las bacterias que utilizan esta vía producen solo pequeñas cantidades de ácidos mixtos que son insuficientes para disminuir el pH del medio de rojo de metilo, lo bastante como para producir un cambio de color. Por este motivo muchas de las especies de Enterobacterias son VP positivas, con pocas excepciones son RM negativas y viceversa. El primer reactivo agregado a una alícuota incubada es el catalizador alfa-naftol porque éste actúa como intensificador del color, lo que aumenta la sensibilidad de la reacción sin pérdida de su especificidad. El segundo reactivo es el KOH que cuando se agrega al medio de VP contribuye a la absorción de CO. No debe excederse de un volumen exacto. El KOH reaccionará con la peptona dando un color rosado salmón y con el agregado posterior de alfa-naftol no habrá alteración del color. REACTIVOS ADICIONALES a) Alfa naftol al 5%, intensificador del color b) Hidróxido de potasio 40%, agente oxidante Agregar directamente los reactivos al tubo después de la incubación en el siguiente orden: 1) 0.6ml de alfa naftol 2) 0.2ml de KOH 3) Agitar el tubo suavemente, dejar reposar de 10 a 15 minutos antes de la interpretación. PRECAUCIONES El orden de adición de los reactivos es importante, ya que la inversión de incorporación dará como resultado un débil positivo o falso negativo. No debe excederse un volumen exacto de KOH ya que el exceso puede ocultar una reacción VP débilmente positiva. INTERPRETACIÓN * Positivo: Rojo rosado en la superficie del medio (presencia de acetil-metil carbonil). * Negativo: Amarillo. Puede formarse un color cobrizo pero aún así la reacción es negativa. ACCION SOBRE LAS PROTEINAS Y OTRAS SUSTANCIAS NITROGENADAS
Para la demostración del metabolismo bacteriano sobre las proteínas, se realizaran las siguientes pruebas producción de indol y producción de H2S. Otras sustancias nitrogenadas susceptibles a ser descompuestas por los microorganismos son la urea y los nitratos. a) FORMACION DE INDOL El triptófano es un aminoácido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos principales: indol, escatol e indol acético. Diversas enzimas intracelulares que intervienen en éste proceso reciben el nombre de triptofanasa, lo que implica el sistema completo de enzimas vinculadas con la producción del indol. El principal intermediario en la degradación del triptófano es el ácido indol pirúvico. La degradación del triptófano libera indol, ácido pirúvico, amoniaco y energía. El ácido pirúvico puede ser nuevamente metabolizado por medio del ciclo glucolítico o entrar en el ciclo de Krebs para liberar CO de energía. El NH y H2O y una gran producción Puede ser utilizado para sintetizar nuevos aminoácidos empleando la energía que se encuentra para la reacción anabólica. La prueba de indol se basó en la formación de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído de p-dimetilaminobenzaldehído (sustancia activa del reactivo de Kovacs). La formación de indol se produce solamente en aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono. La elevada acidez producida por la fermentación de la glucosa puede impedir el crecimiento del organismo o inhibir la enzima. El agregado de triptófano estimula la producción de indol mientras que la glucosa la inhibe. PRUEBA DE INDOL Reactivo de Kovacs * Adicionar 5 gotas y agitar suavemente el tubo Interpretar inmediatamente. Conservación: Los reactivos deberán guardarse en el refrigerador (4° C) mientras no se usan, su estabilidad es variable, por lo tanto se hará todas las semanas un control de calidad, desechándolos si muestran una reacción débil o negativa con un organismo positivo conocido.
b) PRUEBA DE ÁCIDO SULFHÍDRICO La proteolisis de las proteínas en aminoácidos (aa.) individuales, algunas especies
bacterianas son capaces de liberar azufre enzimáticamente de los diferentes aa. Que as contienen, produciendo el gas ácido sulfhídrico (SH). La peptona, cisteína y tiosulfato, todos son fuentes de azufre, pero las diferentes especies utilizan distintos compuestos o aa. Que contienen azufre para producir S2H. La enzima responsable de ésta actividad es la cisteinasa. TSI Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto con la determinación de posible ácido sulfhídrico. El agar AHK es un medio diferencial que determina tanto la fermentación de los hidratos de carbono y la producción de ácido sulfhídrico. Las bacterias pueden utilizar cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados, características que son utilizadas para la diferenciación de éstas, principalmente para las Enterobacterias. Este medio contiene lactosa con una concentración de 1% y glucosa 0.1%, lo cual permite la observación de la fermentación de uno o de ambos carbohidratos por parte de Las bacterias, además de la producción de gas y de ácido sulfhídrico. Primera etapa: La bacteria reacciona con el tiosulfato de sodio por medio de una reacción de reducción que da un sulfito y un sulfato. Este es un proceso de respiración anaeróbica donde el átomo de azufre sirve como aceptor de electrones para la oxidación de los sustratos orgánicos. El tiosulfato reemplaza al sulfato como aceptor de electrones y es una fuente de azufre para el organismo. Segunda etapa: El gas incoloro S2H reacciona con una sal pesada, citrato férrico de amonio para producir un precipitado negro insoluble, sulfuro ferroso. Bacteria (medio ácido) + tiosulfato de sodio gas S2H S2H + iones férricos sulfuro ferroso (pp. negro) INTERPRETACIÓN 1. Ácido sulfhídrico * Positivo: Ennegrecimiento del medio * Negativo: Sin ennegrecimiento 2. Indol
* Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio. * Negativa: No se produce color * Negativa: Color naranja en la superficie del medio. Indica desarrollo de escatol, un compuesto metilado que puede ser el precursor de la formación de indol. * La reacción positiva después de 24 horas indica una prueba completa. * Si el cultivo de 24 horas es negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba. ACCION SOBRE LOS LIPIDOS Los lípidos como las grasas, son hidrolizadas por lipasas microbianas a glicerol y ácidos grasos. El glicerol es metabolizado por los microorganismos por la vía conectada con el metabolismo de los carbohidratos.los ácidos grasos son oxidados por la remoción sucesiva de acetil-CoA (B oxidación). Esta molécula de dos carbonos puede entrar al ciclo de Krebs para su oxidación. a) ASIMILACION DEL CITRATO Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento, provocando alcalinidad. El medio incluye citrato de sodio, un anión como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de nitrógeno. Normalmente el metabolismo del citrato comprende una condensación de acetilo con la coenzima A y oxalacetato para entrar en el ciclo de Krebs. El desdoblamiento del citrato comprende un sistema enzimático sin la intervención de la coenzima A. Esta enzima se denomina citritasa o citrato desmolasa. Citrato Oxalacetato + acetato
Piruvato + CO Los productos obtenidos del metabolismo del citrato dependen del pH del medio: pH básico: Citrato CO2 + ácido fórmico + 2 ácido acético
pH ácido: 2 Piruvato acetato + CO2 + lactato 2 Piruvato acetoína + 2CO2 PRECAUCIONES
El inoculo debe ser liviano. Sí éste es demasiado grande, compuestos orgánicos preformados dentro de la pared celular de las bacterias que están muriendo pueden liberar suficiente carbono y nitrógeno como para dar un resultado falso – positivo. Cuando se inocula una serie de tubos de medios de cultivo diferenciales con un microorganismo desconocido, es importante sembrar primero el medio citratado para prevenir el arrastre de proteínas o carbohidratos de los otros medios, aunque se supone se esteriliza el asa en cada inoculación. INTERPRETACIÓN * Positivo: Crecimiento aunque no exista cambio de color. Crecimiento y el medio de color azul intenso en Pico de flauta. * Negativo: No se observa crecimiento y medio de color verde. Si se utiliza carbono a partir de citrato de sodio, también se extrae nitrógeno del fosfato de amonio contenido en el medio, liberándose amoniaco. En ocasiones se detecta un crecimiento visible a lo largo de la línea de siembra antes de la aparición de color. Este crecimiento visible también indica resultado positivo. Reporte de resultados * Negativo (-) * Positivo (+) POSITIVO NEGATIVO a) AGAR LISINA HIERRO: LIA Mide la capacidad enzimática de un organismo para descarboxilar un aminoácido (lisina y arginina) para formar una amina, con la consiguiente alcalinidad. La descarboxilación es el proceso mediante el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas específicas son capaces de atacar a los aminoácidos en su grupo carboxilo dando una amina o una diamina y anhídrido carbónico. La descomposición de los aminoácidos se produce anaeróbicamente. El proceso de descarboxilación es irreversible, no oxidativo y requiere una coenzima común, el fosfato de piridoxal. El aminoácido L-lisina sufre la descarboxilación para dar cadaverina y CO2 Por acción de la enzima específica lisinadescarboxilasa.
REPORTE DE RESULTADOS
A = Ácido K = Alcalino N = Neutra R = Rojo (desanimación oxidativa) INTERPRETACIÓN K/K = azul de Prusia /azul de Prusia Desaminación oxidativa / descarboxilación K/A= azul de Prusia / lila No desanimación Producción de H2S = Ennegrecimiento del medio Producción de gas = Burbujas o levantamiento del medio de cultivo de las paredes del tubo. Conclusión Mediante diferentes pruebas bioquímicas se puede ver que no todo los microorganismos reacción igual en cada una de las pruebas, algunos no presentaran cambios en el medio mientras que otros sí. Otros necesitan de otros aditivos para poder ver como actúa con el medio como es el caso de la prueba del rojo de metilo y otras pruebas ,mientras que otras solo basta el tiempo de incubación para poder ver como se han comportado con el medio donde se encuentran.
