PRACTICA No. 3 HIDRÓLISIS DEL ALMIDÓN POR AMILASA VEGETAL OBJETIVO: Determinar la presencia de enzimas hidrológicas durante la germinación por el método colorimétrico tomado como factor el tiempo de actividad enzimática. MATERIAL: -tubos de ensayo de (16 x 150) -gradillas -pipetas graduadas de 1ml (plástico) -pipeta de 5 o 10 ml -vaso de precipitado de 250 ml -mechero -soporte universal con anillo -embudo de plástico -mortero de porcelana con pistilo -vaso de precipitado -pipeta de 1 ml -balanza granataria -espectrofotómetros -Celdas -Semillas de maíz, frijol o lenteja de 7-8 días de d e germinación -plumón indeleble. -jabón y franela para limpiar -hielo -sobres de gasa -Masking tape -ligas REACTIVOS: -solución de glucosa al 0.1 % -agua destilada -acido 3,5- Dinitrosalicilico Dinitrosalicilico (DNS) en frasco frasco ámbar -solución de yodo (I2KL en una solución de HCL 0.05 N) en frasco ámbar. -Solución de CaCl2 20 mM – NaCl 200 mM -solución de almidón al 0.2% -solución Buffer pH 5 En esta parte de la práctica habrá 5 equipos en los cuales dos trabajaron con amilasa extraída, dos con amilasa pura y el último equipo hará la curva de calibración de glucosa.
METODO: 1. Se le quito la parte más blanca de la semilla que sería la raíz y parte del tallo, de todo tipo de semillas y lavarlas para quitar las impurezas, se pusieron todo dentro de un recipiente y se peso en la balanza granataria... 2.-Se molió todo dentro del mortero usando como solvente 3 mililitros de agua destilada por cada gramo de tejido. 3.-Se filtro la molienda con ayuda del embudo y de dos capas de gasa. 4.-Se paso lo filtrado en un tubo de ensaye. Y se dejo sedimentar, manteniéndolo a una temperatura más baja que la ambiente, con ayuda de hielo. 5.-Se diluyo lo obtenido en una solución 1: 10 con solución amortiguadora de acetato pH 5, pero se siguió manteniendo frio. 6.-Se preparo en dos tubos de ensaye (13 x 150 mm) de la siguiente manera: Tubo AyB
Almidón 0.2% en buffer pH 5 4ml
Solución CaCl-NaCl 4ml
ENSAYO A 1.-Se prepararon diez tubos de ensaye (13 x 150 mm) agregando a cada uno 1 ml de la solución de yodo. 2.-A un tubo se le agrego 3 ml de agua destilada, a este se le llamara tubo blanco este servirá para calibrar al espectrómetro al 100% de trasmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica). 3.-El primer tubo (tiempo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; a cada tubo se le agrego un mililitro de la enzima diluida (extraída) a cada tubo que tiene la solución de yodo, en otras palabras por cada 5 minutos después del primero que era en tiempo 0, se fue agregando a cada tubo 1 ml de la enzima, con mucho cuidado para no afectar el rango de tiempo. 4.-Agitar 5.-Se le agrego a cada tubo 2 ml de agua destilada y se agito con cuidado de no romper el tubo. 6.-Se coloco en una celda los 11 tubos de ensaye para leerlos en el espectrofotómetro a una absorbencia de 620mm. En el cual el tubo blanco (paso 2) se utilizo primero para calibrar a una absorvancia óptica de 0. Y a continuación se leyeron cada uno y se anotaron los resultados. 7.-Se grafico la absorvancia a 620mm contra tiempo de reacción, y se correlaciono con el cambio de color de la serie B. RESULTADOS: TUBO 0 APARICIÓN 0 DE GLUCOSA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.452 0.483 0.552 0.563 0.664 0.526 0.452 0.419 0.201
ENSAYO B 1.-Se prepararon 10 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno 1ml de la solución de DNS (ácido 3,5 - Dinitrosalicilico) 2.-Adicione 2 ml de agua destilada a un tubo que servirá para calibrar 575 nm en el espectrofotómetro a 100% de transmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica) 3.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; se tomo 1 ml del tubo que contiene la enzima diluida y se agrego a cada uno de los tubos que contienen solución de DNS. 4.-En un recipiente de precipitación se puso agua del grifo, a calentar hasta hervir (que salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se cayeran. Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a baño maría. 5.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito, incluyendo al tubo para calibrar ya que se sedimenta. 6.-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podría romperse el tubo si se cambia bruscamente la temperatura. 7.-Se tomo lectura en el espectrofotómetro a una absorvancia de 575nm cada uno, calibrando la densidad óptica con el tubo blanco. 8.-A continuación se graficaron los datos, absorvancia contra tiempo de reacción. 9.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con la solución de yodo.
RESULTADOS: TUBO 0 APARICIÓN 0 DE AMILASA EXTRAÍDA
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.015 0.024 0.022 0.027 0.032 0.041 0.043 0.045 0.068
POR OTRA PARTE………… Se está trabajando con la amilasa pura, esta se puso en un tubo de ensaye (13 x 150 mm), el tubo de ensaye se coloco en un recipiente con hielo. A continuación se diluyo (a la tercera vez) en una solución 1:100 con una solución amortiguadora de acetato pH 5, pero aun manteniéndolo al frio. Se preparo en dos tubos de ensaye (13 x 150 mm) de la siguiente manera: Tubo Almidón 0.2% en buffer pH Solución CaCl-NaCl 5 CyD 4ml 4ml ENSAYO C 1.-Se prepararon diez tubos de ensaye (13 x 150 mm) agregando a cada uno 1 ml de la solución de yodo. 2.-A un tubo se le agrego 3 ml de agua destilada, a este se le llamara tubo blanco este servirá para calibrar al espectrómetro al 100% de trasmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica). 3.-El primer tubo (tiempo 0) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; a cada tubo se le agrego un mililitro de la enzima pura a cada tubo que tiene la solución de yodo. 4.-Agitar 5.-Se le agrego a cada tubo 2 ml de agua destilada y se agito con cuidado de no romper el tubo. 6.-Se coloco en una celda los 11 tubos de ensaye para leerlos en el espectrofotómetro a una absorbencia de 620mm. En el cual el tubo blanco (paso 2) se utilizo primero para calibrar a una absorvancia óptica de 0. Y a continuación se leyeron cada uno y se anotaron los resultados. 7.-Se grafico la absorvancia a 620mm contra tiempo de reacción, y se correlaciono con el cambio de color de la serie D. RESULTADO: TUBO 0 APARICIÓN 0 DE GLUCOSA
ENSAYO D
1 2 3 4 5 6 7 8 9 0.454 0.494 0.504 0.466 0.502 0.520 0.576 0.488 0.528
1.-Se prepararon 10 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno 1ml de la solución de DNS (ácido 3,5 - Dinitrosalicilico) 2.-Adicione 2 ml de agua destilada a un tubo que servirá para calibrar 575 nm en el espectrofotómetro a 100% de transmitancia o cero de absorvancia (densidad óptica) 3.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; se tomo 1 ml del tubo que contiene la enzima pura y se agrego a cada uno de los tubos que contienen solución de DNS. 4.-En un recipiente de precipitación se puso agua del grifo, a calentar hasta hervir (que salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se cayeran. Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a baño maría. 5.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito, incluyendo al tubo para calibrar ya que se sedimenta. 6.-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podría romperse el tubo si se cambia bruscamente la temperatura. 7.-Se tomo lectura en el espectrofotómetro a una absorvancia de 575nm cada uno, calibrando la densidad óptica con el tubo blanco. 8.-A continuación se graficaron los datos, absorvancia contra tiempo de reacción. 9.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con la solución de yodo. RESULTADO: TUBO 0 1 DESAPARICIÓ 0 0.98 N DE 1 AMILASA
2 0.81 2
3 0.51 8
4 0.32 0
5 0.16 4
6 0. 1
7 0.07 3
8 0.2 9
9 0.01 6
10 0.00 3
Y por ultimo. METODO PARA ELABORAR LA CURVA DE CALIBRACIÓN CON GLUCOSA QUE SERVIRA COMÓ PATRÓN PARA HACER EL ANÁLISIS DE REGRESIÓN LINEAL, INCLUYENDO EL COEFICIENTE DE COORELACIÓN (r) Solución Glucosa 0.1% Agua Destilada Reactivo DNS
1 0ml
2 0.1ml
3 0.2ml
4 0.4ml
5 0.6ml
6 0.8ml
7 1ml
1ml
0.9ml
0.8ml
0.6ml
0.4ml
0.2ml
0ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1ml
1.-Se prepararon 7 tubos de ensaye (13 x 150mm) agregando a cada uno, de menor a mayor, en el tubo uno se adiciona 0ml de glucosa, en el tubo 2 se le agrega 0.1ml de glucosa, el tubo tres 0.2ml de glucosa, al tubo cuatro 0.4ml de glucosa, al tubo cinco 0.6ml de glucosa, el tubo seis 0.8ml de glucosa y al tubo siete 1ml de glucosa, la glucosa es al 0.1%. 2.-Se agrego agua destilada, de igual manera de menor a mayor, en el tubo uno se le agrego 1ml, en el tubo dos 0.9ml, al tubo tres 0.8ml, al tubo cuatro 0.6ml, al tubo cinco 0.4ml, al tubo seis 0.2ml y en el tubo siete 0ml. 3.-Al primer tubo (tiempo O) y a intervalos de 5 minutos durante 40 minutos; se le agrega 1ml de solución de DNS. 4.-En un recipiente de precipitación se puso agua del grifo, a calentar hasta hervir (que salgan burbujitas) y con los tubos se unieron con ligas para evitar que se fueran de lado y se cayeran. Se pusieron a calentar los tubos durante 10 minutos a baño maría. 5.-Se le agrego a cada tubo 8ml de agua destilada y se agito, incluyendo al tubo para calibrar ya que se sedimenta. 6.-Se dejaron enfriar los tubos a temperatura ambiente ya que podría romperse el tubo si se cambia bruscamente la temperatura. 7.-Se tomo lectura en el espectrofotómetro a una absorvancia de 575nm cada uno, calibrando la densidad óptica con el tubo blanco. 8.-A continuación se graficaron los datos, absorvancia contra tiempo de reacción. 9.-Correlacione los datos obtenidos con el cambio de color con las graficas de desaparición de glucosa. RESULTADO: TUBO 0 CURVA 0 PATRO N DE GLUCO SA
1 0.018
2 0.088
3 0.160
4 0.243
5 0.324
6 0.380
ANEXOS:
CUESTIONARIO: 1.- ¿A qué grupo pertenece la enzima amilasa vegetal?
De tipo exohidrolasa especifica 2.- ¿Qué diferencia bioquímica existe entre glucosa
y almidón, y cuál relación hay entre
ellas?
la glucosa es una hexosa, es decir, que contiene 6 átomos de carbono, y es una aldosa, esto
es, el grupo carbonilo está en el extremo de la molécula. El almidón es un polímero hecho de glucosa que se utiliza como sustancia de reserva en las plantas, tiene dos tipos de polímeros de glucosa los que constituyen el almidón ya que se trata de una mezcla de dos compuestos: •la amilosa (30 %) es una molécula lineal de glucosa con elaces glucosidicos (1-4) sin ramificar. •la amilopectina (70 %) también adopta una posición helicoidal similar a la amilosa pero posee ramificaciones laterales originadas mediante enlaces a (1-6) cada 12 moléculas de glucosa. 3.- ¿Por qué aparece la enzima en el germinado de maíz?
La actividad enzimática, es necesaria para la síntesis de glucosa para que pueda obtener energía la misma semilla apartir de sus reservas energéticas, usando estas reservas mientras desarrolla sus órganos (hoja, raíz y tallo). 4.- ¿Cuáles son las condiciones que alteran las funciones de las enzimas? Concentración del sustrato .- A mayor concentración del sustrato, a una concentración fija
de la enzima se obtiene la velocidad máxima. Después de que se alcanza esta velocidad, un aumento en la concentración del sustrato no tiene efecto en la velocidad de la reacción. Concentración de la enzima .- Siempre y cuando haya sustrato disponible, un aumento en la concentración de la enzima aumenta la velocidad enzimática hacia cierto límite. Temperatura .- Un incremento de 10°C duplica la velocidad de reacción, hasta ciertos límites. El calor es un factor que desnaturaliza las proteínas por lo tanto si la temperatura se eleva demasiada, la enzima pierde su actividad. pH.- El pH óptimo de la actividad enzimática optima es de 7 una variación de este pH varia la velocidad de reacción o la desnaturalización de la enzima. Presencia de cofactores .- Muchas enzimas dependen de los cofactores, sean activadores o coenzimas para funcionar adecuadamente. Para las enzimas que tienen cofactores, la concentración del cofactor debe ser igual o mayor que la concentración de la enzima para obtener una actividad catalítica máxima. 5.- ¿Cómo se distingue bioquímicamente la degradación del almidón por amilasa y por
Fosforilasa? Por amilasa lo que hace con el almidon es romperlo en azucares mas simples, mientras que la fosforilasa va quitando de uno en uno la glucosa de las cadenas.
