PERCOBAAN 7 “UJI POTENSI ANTIBIOTIK (5+1)”
I.
Tujuan percobaan
1. Menentukan kesetaraan antibiotika uji dibandingkan antibiotika standar terhadap mikroba uji tertentu. 2. Dapat melakukan penetapan potensi antibiotika
II.
Teori Dasar
2.1
Pengertian Antibiotika
Antibiotika adalah zat-zat kimia yang dihasilkan mikroorganisme hidup terutama fungi dan bakteri tanah, yang memiliki khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan banyak bakteri dan beberapa virus besar, sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil (Tjay, 2008).
2.2
Prinsip Penetapan Potensi Antibiotik
Prinsip penetapan potensi antibiotik dalam sediaan obat adalah membandingkan dosis larutan sediaan uji terhadap dosis larutan bakupembanding yang menghasilkan derajat hambatan yang sama padamikroorganisme uji (Radji, 2010).
2.3
Metode Pengujian Potensi Antibiotik
Pada umumnya, pengujian potensi antibiotik secara mikrobiologi menggunakan dua metode, yaitu metode turbidimetri dan metode lempeng silinder atau difusi agar. Prinsip metode turbidimetri adalah berdasarkan hambatan pertumbuhan biakan mikroorganisme dalam media cair yang mengandung larutan antibiotik sedangkan prinsip metode lempeng silinder adalah membandingkan zona hambatan pertumbuhan mikroorganisme uji
oleh dosis senyawa antibiotik yang diuji terhadap zona hambatan oleh dosis antibiotik baku pembanding pada media lempeng agar (Radji, 2010).
2.4
Kegunaan Antibiotik
Antibiotik digunakan untuk membasmi mikroba penyebab terjadinya infeksi. Gejala infeksi terjadi akibat gangguan langsung oleh mikroba dan berbagai zat toksik yang dihasilkan mikroba. Pada dasarnya suatu infeksi dapat ditangani oleh sistem pertahanan tubuh, namun adakalanya sistem ini perlu ditunjang oleh penggunaan antibiotik. Antibiotik yang digunakan untuk membasmi mikroba penyebab infeksi pada manusia harus memiliki sifat toksisitas selektif. Artinya antibiotik harus bersifat toksik untuk mikroba, tetapi relatif tidak toksik untuk hospes. Toksisitas selektif tergantung kepada struktur yang dimiliki sel bakteri dan manusia misalnya dinding sel bakteri yang tidak dimiliki oleh sel manusia, sehingga antibiotic dengan mekanisme kegiatan pada dinding sel bakteri mempunyai toksisitas selektif relatif tinggi (Ganiswarna, 1995).
2.5
Pembagian Secara Umum Antibiotika
Secara umum antibiotika terbagi atas (Rahardja, 2002) :
Penisilin Penisilin-G dan turunannya bersifat bakterisid terhadap terutama kuman Gram-positif (khususnya Cocci) dan hanya beberapa kuman Gramnegatif. Contohnya : Benzilpenisilin, Fenoksimetilpenisilin Kloksasilin, Asam Klavulanat, Ampisilin.
Sefalosporin Spektrum kerjanya luas dan meliputi banyak kuman Gram-positif dan Gram-negatif termasuk Escherichia coli. Berkhasiat bakterisid dalam fase
pembunuhan
kuman,
berdasarkan
penghambatan
sintesa
peptidoglikan yang diperlukan kuman untuk ketangguhan dindingnya. Contohnya
:
Sefaleksin,
Seftazidim, Aztreonam.
Sefamandol,
Sefouroksin,
Sefotaksim,
Aminoglikosida Aktivitasnya bakterisid, berdasarkan dayanya untuk mempenetrasi dinding bakteri dan mengikat diri pada ribosom di dalam sel. Proses translasi (RNA dan DNA) diganggu sehingga biosintesa proteinnya dikacaukan. Efek ini tidak saja terjadi pada fase pertumbuhan juga bila kuman tidak membelah diri. Contohnya : Streptomisin, Gentamisin, Amiksin, Neomisin Paromomisin.
Tetrasiklin Mekanisme kerja berdasarkan diganggunya sintesa protein kuman. Spectrum kerjanya luas dan meliputi banyak cocci Gram-positif dan Gram-negatif serta kebanyakan bacilli, kecuali pseudomonas dan proteus. Contohnya : Tetrasiklin, Doksisiklin,
Makrolida dan linkomisin Eritromisin bekerja bakteriostatis terhadap terutama bakteri Gram positif, dan spectrum kerjanya mirip penisilin-G. Mekanisme kerjanya melalui pengikatan reversible pada ribosom kuman, sehingga sintesis proteinnya
dirintangi.
Contohnya
:
Eritromisin,
Azitromisin,
Spiramisin, Linkomisin.
Polipeptida Khasiatnya adalah bakterisid berdasarkan aktivitas permukaannya dan kemampuannya untuk melekatkan diri pada membran sel bakteri, sehingga permeabilitas sel meningkat dan akhirnya sel meletus. Contohnya : Polimiksin B, Basitrasin, Gramsidin.
Antibiotika lainnya Khasiatnya
bersifat
enterobacter dan Staphylococcus
bakteriostatis aureus berdasarkan
terhadap perintangan
sintesa polipeptida kuman. Contohnya : Kloramfenikol, Vankomisin, Asam fusidat, Mupirosin, Spektinomisin.
2.6
Pembagian Berdasarkan Mekanisme Kerja Antibiotika
Berdasarkan mekanisme kerjanya antimikroba dibagi dalam lima kelompok (Ganiswarna, 1995) :
Antimikroba yang menghambat metabolisme sel mikroba Antimikroba yang termasuk dalam kelompok ini adalah sulfonamid, trimetoprim, asam p-aminosalisilat dan sulfon.
Antimikroba yang menghambat sintesis dinding sel mikroba Obat yang termasuk dalam kelompok ini adalah penisilin, sfalosforin, basitrasin, vankomisin, dan sikloserin.
Antimikroba yang mengganggu keutuhan membran sel Obat yang termasuk dalam golongan ini adalah polimiksin, golongan polien serta berbagai antimikroba kemoteraupetik, seperti antiseptik surface active agents.
Antimikroba yang menghambat sintesis protein sel mikroba Obat yang termasuk dalam kelompok ini adalah golonbgangna aminoglikosid, makrolid, linkimisin, tetrasiklin dan kloramfenikol.
Antimikroba yang menghambat sintesis asam nukleat sel mikroba Antimikroba yang termasuk kelompok ini ialah rimpisin dan golongan kuinolon.
2.7
Klasifikasi dan Morfologi E scherichia coli
2.7.1
Klasifikasi
Escherichia coli menurut Songer dan Post (2005) adalah sebagai berikut: Kingdom : Bacteria Filum : Proteobacteria Kelas : Gamma Proteobacteria Ordo : Enterobacteriales Famili : Enterobacteriaceae Genus : Escherichia Spesies : Escherichia coli
2.7.2
Karakteristik Morfologi
Bakteri Escherichia coli merupakan spesies dengan habitat alami dalam saluran pencernaan manusia maupun hewan. Escherichia coli pertama kali diisolasi oleh Theodor Escherich dari tinja seorang anak kecil pada tahun 1885. Bakteri ini berbentuk batang, berukuran 0,4-0,7 x 1,0-3,0 μm, termasuk gram negatif, dapat hidup soliter maupun berkelompok, umumnya motil, tidak membentuk spora, serta fakultatif anaerob (Carter & Wise 2004). Struktur sel Escherichia coli dikelilingi oleh membran sel, terdiri dari
sitoplasma
yang
mengandung
nukleoprotein.
Membran
sel
Escherichia coli ditutupi oleh dinding sel berlapis kapsul. Flagela dan pili Escherichia coli menjulur dari permukaan sel (Tizard 2004). Bakteri Escherichia coli dapat membentuk koloni pada saluran pencernaan manusia maupunhewan dalam beberapa jam setelah kelahiran. Faktor predisposisi pembentukan koloni ini adalahmikroflora dalam tubuh masih sedikit, rendahnya kekebalan tubuh, faktor stres, pakan, daninfeksi agen patogen lain. Kebanyakan Escherichia coli memiliki virulensi yang rendah dan bersifat oportunis (Songer & Post 2005). Escherichia coli keluar dari tubuh bersama tinja dalam jumlah besar serta mampu bertahan sampai beberapa minggu. Kelangsungan hidup dan replikasi Escherichia coli di lingkungan membentuk koliform. Escherichia coli tidak tahan terhadap keadaan kering atau desinfektan biasa. Bakteri ini akan mati pada suhu 60ºC selama 30 menit. Escherichia coli bersifat patogen karena dapat menyebabkan infeksi pada manusia dan hewan. Seorang bakteriolog yaitu Theodor Escherich, mengidentifikasi Escherichia coli dari babi yang menderita enteritis. Enteritis merupakan peradangan usus yang bisa menyebabkan sakit perut, mual, muntah, dan diare baik manusia maupun hewan. Escherichia coli merupakan bakteri yang bisa hidup pada lingkungan yang berbeda. Bakteri ini dapat ditemukan di tanah, air, tanaman, hewan, dan manusia (Berg 2004; Bhunia 2008; Manning 2010). Genus Eschericia merupakan bakteri berbentuk
batang (1x4 μm), motil, dan mesofilik. Bakteri ini sering ditemukan di dalam pencernaan manusia, hewan berdarah panas, dan burung (Ray 2004; Duffy 2006; Bhunia 2008). Spesies terpenting dari genus Eschericia ialah Escherichia coli (Ray 2004; Adams dan Moss 2008).
III.
Alat dan Bahan Alat
IV.
Bahan
Bunsen
Cawan petri
Erlenmeyer
Aquades steril
Gelas ukur 5 mL
Bakteri Escherichia coli
Incubator 370C
Media Nutrient agar
Labu ukur 25 mL dan 10 mL
Sampel ampisilin uji
Mikropipet
Ose bundar
Penangas
Perforator
Pipet volume 1 mL dan 10 mL
Rak tabung reaksi
Tabung reaksi
Vortex
Ampisilin standar dengan konsentrasi 1 mg/mL
Prosedur
Pada 5 buah cawan petri steril yang akan digunakan diberi tanda dengan label sesuai dengan pola. Kemudian dibuat suspensi bakteri Escherichia coli dengan aquades steril sebanyak 5 mL. Setelah itu dibuat agar inokula 0,4%, setelah tercampur homogen dituang dalam cawan petri sebanyak 30 mL dan dibiarkan memadat.
Ampisilin trihidrat standar dilarutkan dalam aquadest steril hingga didapatkan konsentrasi 1000 mg/mL kemudian dilakukan pengenceran dengan aquadest steril hingga diperoleh dosis S1-S5 (perbandingan konsentrasi pada tingkat dosis berurutan 4:5). Setelah agar inokula memadat, dibuat lubang/sumur agar dalam cawan petri menggunakan perforator (lubang dibuat pada masing-masing bagian dengan tanda label). Setelah itu Ampisilin trihidrat standar yang telah dilakukan pengenceran dipipet sebanyak 20 ɥL menggunakan mikropipet pada masing-masing lubang/sumur. Kemudian diinkubasikan pada suhu 370C selama 18-24 jam.
V.
Data Pengamatan dan Perhitungan
5.1
Pembuatan Nutrient Agar
NA = 20 gr/ 1 L Air = 175 mL + 10 % = 192,5 mL 20 1000
=
192,5
= 3,85 gram
5.2
Konsentrasi S1: S2: S3: S4: S5
S3= 100 μg/mL
S2 : S3 S2 =
5
x 100
= 80 μg/mL
S1: S2 S1 =
5
x 80
= 64μg/mL
S3 : S4 5
S4 = x 100
= 125 μg/mL
S4: S5 5
S5= x 125
= 156,25 μg/mL Konsentrasi
S1: S2: S3: S4: S5 64μg/mL:80μg/mL:100μg/mL:125μg/mL:156,25μg/mL
5.3
Pengenceran Larutan Induk
500 μg/mL
=V1.N1= V2: N2 = V1. 500= 100. 156,25 V1= 31,25 mL
156,25 μg/mL = V1.N1= V2.N2 = V1. 156,25= 100.125 V1= 80 mL 125 μg/mL
= V1.N1= V2.N2 = V1. 125= 100.100 V1= 80 mL
100 μg/mL
= V1. N1= V2.N2 = V1. 100= 80. 100 V1= 80 mL
80 μg/mL
= V1. N1= V2.N2 = V1. 80= 64. 100 V1= 80 mL
64μg/mL
Waktu Inokulasi
: Rabu, 20 Desember 2017
Waktu Pengamatan
: Kamis, 21 Desember 2017
Gambar 6.1. S1 dan S3 pada
Gambar 6.2. S2 dan S3 pada media
media nutrient Agar sebelum di
nutrient Agar sebelum di inkubasi
inkubasi
Gambar 6.3. S4 dan S3 pada
Gambar 6.4. S1 dan S3 pada media
media nutrient Agar sebelum di
nutrient Agar sebelum di inkubasi
inkubasi
Gambar 6.5. U dan S3 pada media
nutrient Agar sebelum di inkubasi
Gambar 6.6. S1 dan S3 pada
Gambar 6.7. S2 dan S3 pada media
media nutrient Agar sesudah di
nutrient Agar sesudah di inkubasi
inkubasi
Gambar 6.8. S4 dan S3 pada
Gambar 6.9. S5 dan S3 pada media
media nutrient Agar sesudah di
nutrient Agar sesudah di inkubasi
inkubasi
Gambar 6.10. U dan S3 pada
media nutrient Agar sesudah di inkubasi
5.4
Tabel Pengamatan
Standa
Konsentrasi
Diameter zona hambat (cm)
r (i)
(μg/mL)
Standar-i
S1
64
0,8
0,6
1,2
0,9
0,8
1,2
S2
80
0,5
0,15
0,6
0,9
0,8
0,4
S3
100
S4
125
0,9
0,9
1,1
1,1
1,0
0,6
S5
156,25
0,9
0,9
1,2
0,8
0,8
0,7
Uji
?
0,7
1,1
1,3
1,1
0,7
1,2
Standar- 3
5.5
Perhitungan potensi (konsentrasi) antibiotik
5.5.1
Rata- rata diameter S3 disemua cawan (Y 3T)
Y3T= 0,9 ; 0,8 ; 1,2 ; 0,9; 0,8 ; 0,4 ; 1,1 ; 1,0 ; 0,6 ; 0,8 ; 0,8 ; 0,7 Y3T =
10
= 0,83 cm
12
5.5.2
Rata- rata diameter S3 tiap cawan
Y31= 0,9 ; 0,8 ; 1,2 2,9
Y31=
3
Y32= 0,9; 0,8; 0,4 2,1
Y32=
3
3
3
=1 cm
2,
= 0,867 cm
3
Y2= 0,5; 0,15; 0,6 1,25
= 0,4167 cm
3
Y4= 0,9; 0,9; 1,1 2,9 3
= 0,967 cm
Y5= 0,9; 0,9; 1,2 =
3
Y1= 0,8 ; 0,6 ; 1,2
=
= 0,767 cm
Rata- rata diameter S1, S2, S4 dan S5 ( Y1, Y2, Y4, Y5)
=
= 0,9 cm
Y3u= 1,1; 0,7;1,2
=
3
2,3
=
5.5.3
2,7
Y35= 0,8; 0,8; 0,7 Y35=
= 0,7 cm
Y34= 1,1; 1,0; 0,6 Y34 =
= 0,967 cm
3 3
= 1 cm
Yu = 0,7; 1,1;1,3 = 1,03 cm
5.5.4
Diameter koreksi untuk setiap cawan
S1= Y1+ (Y3T- Y31) = 0,867+( 0,83-0,967) = 0,73 cm
S2= Y2+ (Y3T-Y32) = 0,4167+ (0,83- 0,7) = 0,5467 cm
S3= Y3T = 0,83 cm
S4= Y4+ (Y3T-Y34) = 0,967+ (0,83-0,9) = 0,897 cm
S5= Y5+ (Y3T- Y35) = 1 +(0,83-0,767) =1,063 cm
5.5.5
Kurva kalibrasi
Log potensi (X)
Diameter rata-rata (Y)
Log 64
= 1,8
0,73
Log 80
= 1,9
0,5467 cm
Log 100
=2
0,83
cm
Log 125
= 2,1
0,897
cm
Log 156,25 = 2,2
1,063
cm
cm
Persamaan regresi
a = -1,22 b= 1,02 r = 0,84 Y=bx+a
= 1,02x-1,2 Yuk= Yu + (Ys-Y3u)
Ys = 1,2x-1,22
= 1,03 + (0,82- 1)
= 1,2 (2)- 1,22
=0,85
= 0,82
Yuk= 1,02x -1,22 0,85= 1,02x-1,22 2,07= 1,02x 2,07
X
=
X
= 2,03
1,02
Anti log 2,03 = 107,152 Jadi, konsentrasi antibiotik 107,152 μg/mL
VI.
Pembahasan
Antibiotik
adalah
suatu
senyawa
yang
dihasilkan
oleh
mikroorganisme yang pada konsentrasi rendah dapat memusnahkan atau menghambat pertumbuhan mikroorganisme lain. Pengujian potensi antibiotik dilakukan untuk memberikan jaminan bahwa kualitas dan mutu antibiotik yang digunakan dalam pengobatan memenuhi persyaratan yang telah ditentukan. Antibiotik memiliki spektrum aktivitas antibiosis yang beragam. Sensitivitas suatu bakteri terhadap antibiotik ditentukan oleh diameter zona hambat yang terbentuk. Semakin besar diameternya maka semakin terhambat pertumbuhannya, sehingga diperlukan standar acuan untuk menentukan apakah bakteri itu resisten atau peka terhadap suatu antibiotik. Pada praktikum ini digunakan medium Nutrien Agar (NA). pertama-tama dibuat agar inokula 0,4%, fungsi dibuat agar inokula 0,4% adalah agar media yang digunakan tidak bersifat antagonis dan dapat mempengaruhi antimikroba. Setelah itu agar inokula dimasukan kedalam masing-masing cawan petri. Dibuat pengenceran ampisilin trihidrat dengan 5 variasi dosis (S1-S5) yang berfungsi sebagai pembanding pada setiap konsentrasi.
Setelah
agar
inokula
memadat,
dimasukan
larutan
pengenceran ampisilin trihidrat sesuai konsentrasi yang diperlukan kedalam lubang tersebut sebanyak 20 mikro gram sebagai pembanding. Diinkubasi selama 18-24 jam pada suhu 37°C sebagai waktu dan suhu optimal bagi pertumbuhan bakteri Escherichia coli. Pada pengujian yang telah dilakukan terbentuk zona bening di sekeliling lubang. Ini menunjukkan bahwa antibiotik yang digunakan berpotensi
menghambat
pertumbuhan Escherichia
coli pengaruh
konsentrasi antibiotika terhadap pertumbuhan bakteri adalah semakin besar konsentrasi dari antibiotika maka kemampuan antibiotika untuk menghambat atau membunuh bakteri akan semakin besar.
Dari hasil percobaan uji potensi antibiotik yang dilakukan, didapatkan hasil berupa konsentrasi antibiotik sebesar 107,152 μg/mL dan hasil ini menunjukkan bahwa konsentrasi antibiotik ampisillin trihidrat tersebut masuk ke rentang yang aman, karena rentang yang aman sesuai literatur adalah berkisar antara 64-156,25 μg/mL.
VII.
Kesimpulan
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan serta berdasarkan hasil pengamatan yang didapat, dapat kami simpulkan bahwa: 1. Antibiotik yang diuji berpotensi menghambat pertumbuhan E.coli yang ditandai dengan terbentuknya zona bening atau zona hambat 2. Konsentrasi antibiotik uji yang berupa Ampisilin trihidrat adalah sebesar 107,152 μg/mL yang menandakan antibiotik tersebut aman untuk digunakan
DAFTAR PUSTAKA
Adams MR, Moss MO. 2008. “ Food Microbiology” 3rd Edition. Cambridge: RSC Pub Berg HC. 2004. “ Eschericia coli in Motion”. New York: Springer Bhunia A. 2008. “ Foodborne Microbial Pathogens”. New York: Springer Carter GR, Wise DJ. 2004. “ Essential of Veterinary Bacteriology and Mycology”. 6 th Ed. Iowa: Blackwell Publishing Duffy G. 2006. “ Emerging Pathogenic E. coli.. Dalam Motarjemi Y, Adams M, editor. Emerging Foodborne Pathogens”. New York: CRC Pr Elsevier Saunders. Tizard IR. 2004. “Veterinary Immunology: an Introduction Sixth Edition”. Pennsylvania: WB Saunders Ganiswarna, S.G, 1995. “Farmakologi dan Terapi Edisi IV”. Jakarta: Bagian Farmakologi Fakultas Kedokteran Universitas Indonesia Manning SD. 2010. “ Escherichia Coli Infections”. New York: Infobase Publishing Post KW. 2005. “Veterinary Microbiology Bacterial and Fungal Agents of Animal Disease”. New York: CRC Pr Radji, DR. Maksum. 2010. “Buku Ajar Mikrobiologi Panduan Mahasiswa Farmasi & Kedokteran”. Makassar. Ray B. 2004. “ Fundamental Food Microbiology”, Ed. ke-3. Washington, DC: CRC PrSonger JG Tjay, Tann Hoan., Rahardja, Kirana. 2002. “Obat -Obat Penting”. Jakarta: Penerbit Elexmedia Komputindo Tjay, Tann Hoan., Rahardja, Kirana. 2008. “Obat -Obat Penting”. Jakarta: Penerbit Elexmedia Komputindo
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI PERCOBAAN VII UJI POTENSI ANTIBIOTIK (5+1)
Disusunoleh : Kelompok7 Shift E DiniWahidah MarwaSafira R.A. Farah YumnaAmbaro DillaNurulAisyah IndartiUlfayani
10060316211 10060316213 10060316215 10060316216 10060316217
Asisten : Dina Rosdiana, S.Farm. Tanggal Praktikum Tanggal Pengumpulan
: 20 Desember 2017 : 27 Desember 2017
LABORATORIUM FARMASI TERPADU UNIT D PROGRAM STUDI FARMASI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS ISLAM BANDUNG 1439 H/2017 M
