Metode Pengenceran/Dilusi (Dilution Methods) (+)Metode pengenceran/dilusi dapat digunakan untuk menguji beberapa zat antimikroba secara simultan, (+)Metode ini memungkinkan dilakukannya uji kedua untuk menilai dayaantimikroba suatu zat (-)memakan waktu dan mahal. (-)terdapat senyawa yang tidak dapat berdifusi
1. Tube dilution test (Broth Dilution Test) Tube dilution test (Broth (Broth Dilution Test) disebut juga juga dengan pengenceran tabung. Zat yang akan diuji berbentuk cair diencerkan sebagaimana mestinya dan dimasukkan ke dalam tabung-tabung steril. Ke dalam tabung-tabung itu ditambahkan sejumlah o rganisme uji yang sudah diketahui jumlahnya. Pada interval tertentu, dilakukan pemindahan dari tabung ke dalam tabung-tabung yang berisi media steril kemudian diinkubasikan dan diamati nampak ada tidaknya pertumbuhan. (+) Kelebihan dari metode ini adalah dapat dap at menguji daya bakteriostatik, dan bakterisidal dari antimikroba sekaligus. (-) Kelemahannya adalah memerlukan banyak tenaga dan waktu serta perlu biaya mahal sebab hanya dapat menguji satu bahan antimikroba dalam satu kegiatan.
2. Agar Plate Dilution Test Pada dasarnya metode ini sama dengan metode Dilution Broth, hanya saja media yang digunakan dalam metode ini adalah metode padat. Zat yang akan diuji dicampurkan ke dalam media agar, diinokulasikan dengan organisme uji kemudian diinkubasikan dan diamati nampak ada tidaknya pertumbuhan koloni organisme uji tersebut.(+) Kelebihan metode ini adalah pelaksanaannya lebih mudah dan dalam satu media dapat digunakan lebih dari satu organisme uji. (-) Kelemahannya adalah hanya dapat diketahui daya bakteiostatiknya saja sedang daya bakterisidal tidak dapat ditemukan.
3. Disk Agar Diffusin Test Metode ini menggunakan metode cakram kertas yang pada dasarnya pada pengamatan zona hambatan yang dihasilkan oleh difusi dari bahan-bahan antimikroorganisme. Organisme uji diinokulasikan pada medium agar dalam cawan petri kemudian menempatkan suatu cakram kertas yang mengandung antimikroba pada permukaan media tersebut. Setelah masa inkubasi tertentu, diamati untuk melihat adanya zona hambatan di sekeliling cakram kertas. (+) Kelebihan metode ini adalah dapat dilakukan pengujian secara lebih banyak dalam satu kali kegiatan dan memerlukan tenaga yang tidak terlalu banyak. (-) Kekurangannya tidak diketahui secara pasti aksi penghambatan yaitu bakterisidal ataukah bakteriostatik karena banyak faktor yang mempengaruhi antara lain, ketebalan media, macam media, inokulum dan laju difusi bahan antimikroba.
1. Metode difusi
Metode disc diffusion (tes Kirby dan Bauer) untuk menentukan aktivitas agen
antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba permukaan media agar. (lihat gambar)
E-test
Metode E-test digunakan untuk mengestimasi MIC (minimum inhibitory concentration) atau KHM (kadar hambat minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba u ntuk dapat menghabat pertumbuhan mikroorganisme.
Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antimikroba yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.(lihat gambar)
Ditch-plate technique
Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji ( maksimum 6 macam ) digoreskan kearah parit yang berisi agen antimikroba.
Cup-plate technique
metode ini serupa dengan mitode disc diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang akan diuji.
Gradient-plate technique
Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar secara teoretis bervariasi dari 0 hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang kedalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya dihitung diatasnya. Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan permukaan media mengering. Mikroba uji (maksimal 6 macam) digoreskan pad a arah mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total pertumbuhan mikroorganisme maksimum yang mungkin dibandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan. Bila: X = panjang total pertumbuhan mikroorganisme yang mungkin Y = panjang pertumbuhan aktual
C = konsentrasi final agen antimikroba pada total volume media mg/mL atau μ/mL, Maka konsentrasi hambatan adalah: [(X.Y)]: C mg/mL atau μg/mL. Yang perlu diperhatikan adalah dari hasil perbandingan yang didapat dari lingkungan padat dan cair faktor difusi agen antimikroba dapat mempengaruhi keseluruhan hasil pada media padat. 1. Metode dilusi
Metode dilusi dibedankan menjadi dua yaitu dilusi cair (broth dilution) dan dilusi padat ( solit dilution).
Metode dilusi cair /broth dilution tes (serial dilution)
Metode ini mengukur MIC dan MBC (minimum inhibitory concentration atau kadar bunuh minimum,KBM). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antimikroba pada medium cair yang ditambahkan dengan mikroba uji. Larutan uji agen antimikroba pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan mikroba uji ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan mikroba uji ataupun agen antimikroba, dan diunkubasi selama 18-24 jam . media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan sebagai KBM.
Metode dilusi padat
Metode ini serupa dengan metode dilusi cair namun menggunakan media padat (solid). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antimikroba yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa mikroba uji.
Uji bioautografi
Uji bioautografi merupakan metode spesifik untuk mendeteksi bercak pada kromatogram hasil KLT ( kromatografi lapis tipis ) yang memiliki aktifitas antibakteri, antifungi dan antivirus, sehingga mendekatkan metode separasi dengan uji biologis. Keuntungan metode ini adalah sifatnya yang efesien untuk mendeteksi adanya senyawa antimikroba karna letak bercak dapat ditentukan walaupun berada dalam campuran yang kompleks sehingga memungkinkan untuk mengisolasi senyaw aktif tersebut. Kerugiannya adalah metode ini tidak dapat digunakan untuk menetukan KHM dan KBM. Ada dua macam metode bioautografi, yaitu:
Bioautografi langsung : Dengan menyemprot plat KLTdengan suspensi mikroorganisme
ataupun dengan menyentuhkan plat KLT pada mermukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme. Setelah inkubasi pada waktu tertentu, letak sen yawa aktif tampak sebagai area jernih dengan latar belakang keruh.
Bioautografi overlay : dengan menuangkan media agar yang telah dicampur dengan
mikrioorganisme diatas permukaan plat KLT, media ditunggu hingga padat, kemudian diinkubasi. Area hambatan dilihat dengan penyemprotan menggunakan tetrazolium klorida. Senyawa yang aktif sebagai antimikroba akan tampak sebagai area jernih dengan latar belakang ungu.
Metode cakram kertas merupakan metode yang biasa digunakan untuk menguji aktivitas antimikroba suatu antibiotik terhadap mikroorganisme patogen penyebab penyakit. Metode ini lebih dikenal dengan metode Kirby-Bauer (Cappucino and Sherman, 2001; Tortora et al ., 2002). Metode cakram kertas dapat juga dilakukan menggunakan suatu silinder tidak beralas atau sumuran dan diisi dengan antibiotik dalam jumlah tertentu, disebut agar well difussion. Kepekaan mikroorganisme patogen terhadap antibiotik terlihat dari ukuran zona bening yang terbentuk (Cappucino & Sherman, 2001). Mengenai metode yang digunakan, disebutkan bahwa metode cakram kertas memiliki kelebihan dan kelemahan. Kelebihannya adalah mudah dilakukan, tidak memerlukan peralatan khusus dan relatif murah. Sedangkan kelemahannya adalah ukuran zona bening yang terbentuk tergantung oleh kondisi inkubasi, inokulum, predifusi dan preinkubasi serta ketebalan medium. Apabila keempat faktor tersebut tidak sesuai maka hasil dari metode cakram kertas relatif sulit untuk. Selain itu, metode cakram kertas ini tidak dapat diaplikasikan pada mikroorganisme yang pertumbuhannya lambat dan mikroorganisme yang bersifat anaerob obligat (Jawetz et al ., 2005).
bermacam-macam metode uji antibakteri seperti yang dijelaskan berikut ini: 1.
Metode Disc Diffusion (Tes Kirby & Bauer) Metode ini untuk menentukan aktivitas agen antibakteri. Piringan yang berisi agen antibakteri diletakkan pada media agar yang telah ditanami bakteri yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan bakteri oleh agen antibakteri pada permukaan media agar.
2.
Metode E-Test Metode E-Test digunakan untuk mengestimasi MIC ( Minimum Inhibitory Concentration) atau KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) yaitu konsentrasi minimal suatu agen antibakteri untuk dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme. Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen antibakteri dari kadar terendah hingga tertinggi dan diletakkan pada permukaan media agar yang telah ditanami bakteri. Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen antibakteri yang menghambat pertumbuhan bakteri pada media agar.
3. Ditch Plate Technique
Pada metode ini sampel uji berupa agen antibakteri yang diletakkan pada parit yang dibuat dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan mikroba uji (maksimum 6 macam) digoreskan ke arah parit yang berisi agen antibakteri. 4.
Cup Plate Tehnique Metode ini serupa dengan metode Disc Diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang telah ditanami dengan bakteri dan pada sumur tersebut diberi agen antibakteri yang akan diuji.
5.
Gradient Plate Tehnique Pada metode ini konsentrasi agen antibakteri pada media agar secara teoritis bervariasi dari nol hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian dituang ke dalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antibakteri berdifusi dan permukaan media mengering. Bakteri uji (maksimum 6 macam) digoreskan p ada arah mulai dari konsentrasi tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total pertumbuhan bakteri maksimum yang mungkin dibandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan. Jika: X= panjang total pertumbuhan bakteri yang mungkin Y= panjang pertumbuhan aktual C= konsentrasi agen antibakteri pada total volume media
mg/ml atau µg/ml maka konsentrasi hambatan adalah [(X.Y)]:C mg/ml atau µg/ml. Yang perlu diperhatikan adalah dari hasil perbandingan yang didapat dari lingkungan padat dan cair, faktor difusi agen antibakteri dapat mempengaruhi keseluruhan hasil pada media padat. 6.
Metode Dilusi Cair / Broth Dilution Test Metode ini mengukur MIC ( Minimum Inhibitory Concentration) atau KHM (Konsentrasi Hambat Minimum) dan MBC ( Minimum Bactericidal Concentration) atau KBM (Kadar Bunuh Minimum). Cara yang dilakukan adalah dengan membuat seri pengenceran agen antibakteri pada medium cair yang ditambahkan dengan bakteri uji. Larutan uji agen antibakteri pada kadar terkecil yang terlihat jernih tanpa adanya pertumbuhan bakteri uji ditetapkan sebagai KHM. Larutan yang ditetapkan sebagai KHM tersebut selanjutnya dikultur ulang pada media cair tanpa penambahan bakteri uji ataupun agen antibakteri dan diinkubasi selama 18-24 jam. Media cair yang tetap terlihat jernih setelah inkubasi ditetapkan seba gai KBM.
7.
Metode Dilusi Padat / Solid Dilution Test Metode ini serupa dengan metode difusi cair namun menggunakan media padat (solid ). Keuntungan metode ini adalah satu konsentrasi agen antibakteri yang diuji dapat digunakan untuk menguji beberapa bakteri uji (Pratiwi, 2008 : 188).
