Turbidimetri merupakan analisis kuantitatif yang didasarkan pada pengukuran kekeruhan atau turbidan dari suatu larutan akibat adanya adan ya suspensi partikel padat dalam larutan. Artinya turbidimetri adalah analisa yang berdasarkan hamburan cahaya. Hamburan cahaya terjadi akibat adanya partikel yang terdapat dalam larutan. Partikel ini menghamburkan cahaya ke segala arah yang mengenainya. Turbidimetri adalah pengukuran spesies hamburan cahaya dalam larutan dengan memanfaatkan intensitas cahaya berkas masuk setelah dilewatkan melalui larutan. Nefelometri merupakan me rupakan metode yang digunakan untuk pengukuran kadar zat dengan mengukur pendaran cahaya (scattered) yang mengenaipartikel dalam larutan sedangkan alat yang dipakai adalah nefelometri.Dasar dari pemeriksaan ini adalah reaksi presipitasi antigen-antibodiklasik yang digambarkan oleh Heidelberger dan Kendall.Alat ini digunakan untuk mengetahui kuantitas protein spesifik secaraLebih akurat dan precise, selain itu mudah digunakan dan otomatis.Sensitivitas dan spesifisitas yang baik menjadikan nefelometri dipakaisebagai metode standar.SampeI dengan jumlah minimal dapat diukur dengan alat kadar zat dengan mengukur pendaran cahaya (scattered) yang mengenaipartikel dalam larutan sedangkan alat yang dipakai adalah nefelometri.ini.Penggunaan nefelometri umumnya untuk mengukur protein plasmaseperti imunoglobulin, komponen komplemen, dan protein spesifik yanglain seperti free light chain Ketika sejumlah partikel disuspensikan ke dalam sebuah cairan (solution) dalam sebuah kuvet, suspense tersebut akan membentuk cairan yang tidak jernih (turbid). Dan jika cahaya ditembakkan melewati kuvet tersebut maka akan terjadi tiga reaksi, yakni : Sejumlah cahaya akan diabsorbsi (diblok) oleh partikel Sejumlah cahaya akan ditransmisikan (diteruskan) melewati kuvet Sejumlah cahaya akan disebarkan ke beberapa arah Turbidimetri Prinsip kerja : menghitung jumlah cahaya yang diteruskan (dan mengkalkulasi jumlah cahaya yang diabsorbsi) oleh partikel dalam suspense untuk menentukan konsentrasi substansi yang ingin dicari. Karena menggunakan jumlah cahaya yang diabsorbsi untuk pengukuran konsentrasi, maka jumlah cahaya yang diabsorbsi akan bergantung pada : Jumlah partikel Ukuran partikel. Semakin besar dan banyak jumlah partikel, maka jumlah cahaya yang diabsorbsi akan semakin besar. Dan untuk penentuan kadarnya (detector) digunakan spektrofotometer cahaya.
Ilustrasi : Keterangan : Sejumlah cahaya ditembakkan dari sebuah sumber cahaya menuju monokromator Monokromator akan menguraikan cahaya dan meneruskannya menuju cuvet yang berisikan suspensi sel Ketika cahaya melewati cuvet, maka terjadi tiga kemungkinan Cahaya akan diserap sebagian oleh partikel tersuspensi Sebagian cahaya diteruskan dan sebagian lagi menyebar ke segala arah Jumlah cahaya yang diserap akan sebanding dengan jumlah partikel tersuspensi (konsentrasi sampel). Pengukuran dilakukan dengan spektrofotometr (detektor) Kegunaan : Penentuan konsentrasi total protein dalam cairan biologis seperti urin dan CSF yang mengandung sedikit protein (mg/L kuantitas) menggunakan Asam Trikoloroasetat. Penentuan aktivitas amilase menggunakan pati sebagai substrat. Penurunan kekeruhan berbanding lurus dengan aktivitas amilase. Penentuan aktivitas enzim lipase menggunakan trigliserida sebagai substrat. Penurunan kekeruhan berbanding lurus dengan aktivitas enzim lipase. Nefelometri Prinsip kerja : Nephelometry menitik beratkan pengukuran pada jumlah cahaya yang disebarkan (scaterred) dari kuvet yang mengandung suspense partikel dalam suatu cairan (solution) Komponen-komponen dari nefelometer itu sama dengan komponen yang terdapat pada spectrometer cahaya kecuali pada detector yang ditempatkan pada sudut yangkhusus dari sumber cahaya. Detector merupakan sabuah tube fotomultiplier yang ditempatkan pada suatu posisi untuk mendeteksi cahaya yang tersebar. Detektor bisa ditempatkan pada sudut 90o, 70o or 37o tergantung pada sudut mana paling banyak ditemukan cahaya yang disebarkan
Karena jumlah cahaya yang disebarkan jauh lebih besar daripada yang diteruskandalam suspensi turbid, maka nefelometri memiliki tingkat sensitifitas yang lebih tinggi daripada turbidimetri Jumlah cahaya yang disebarkan, bergantung pada jumlah dan ukuran partikel yang tersuspensi Ilustrasi :
Sebagian besar aplikasi klinis, sumber cahayayang digunakan adalah lampu tungsten, dimana tungsten memberikan cahaya dalam daerah visible Untuk snsitivitas yang lebih tinggi dan untuk aplikasi penentuan ukuran dan jumlah partikel dalam suspense, digunakan laser light nephelometer Digunakan secara luas untuk menentukan konsentrasi zat yang tidak diketahui dimana terdapat reaksi antigen-antibody seperti : Penetuan immunoglobulin (total, IgG, IgE, IgM, IgA) di dalam serum dan cairan bilogi lainnya Penentuan konsntrasi serum protein individu; Hb, Haptoglobin, Transferring, c-reaktif protein, -antitrypsin, albumin (dengan menggunakan antibody spesifik untuk setiap protein) -
Penetuan ukuran dan jumlah partikel (dengan laser – nephelometer)
Pertimbangan antara turbidimetri dan nefelometri Reaksi dalam turbidimetri dan nefelometri tidak mengikuti hukum Beer (Beer’s Law) sehingga, kurva standard harus diplot dan konsentrasi dari zat yang akan dicari (sample) ditentukan dari kurva standard Karena absorbansi bergantung pada jumlah dan ukuran partikel, larutan standard yang digunakan untuk kurva standard harus memiliki ukuran yang sama sesperti dalam suspensi yang terdapat sampel. Karena sejumlah precsipitasi dan settlement partikel bisa terjadi seiring berjalannya waktu, makauntuk mendapatkan hasil dengan tingkat akurasi yang bagus, hal2 yang penting untuk dipertimbangkan meliputi -
Campurkan sample dengan baik sebelum menempatkan kuvet dalam instrument
-
Buatlah lama pengukuran setiap sample dalam waktu yang sama
Pemilihan panjang gelombang
Jika larutan dan partikel tersuspensi tidak berwarna, maka gunakan panjang gelombang dalam range visible Jika larutannya berwarna tetapi partikel tersuspensinya tidak berwarna, maka gunakanlah panjang gelombang yang memberikan absorbansi minimum untuk larutan Jika partikelnya berwarna dan larutannya tidak berwarna maka gunakanlah panjang gelombang yang memberikan absorbansi maksimum terhadap partikel Jika larutan dan partikelnya berwarna maka gunakan dua panjang gelombang, yang satu panjang gelombang yang memberikan absorbansi minimum untuk larutan dan yang satu lagi absorbansi maximum untuk partikel Fluorimetri adalah metode analisa yang erat hubungannya dengan spektrofotometri. Energi yang diserap oleh molekul untuk transisi elektronik ke level energi yang lebih tinggi (first excited singlet) harus dilepaskan kembali pada waktu kembali ke level energi terendah (ground singlet). Energi yang dilepaskan ini dapat berupa panas dan untuk beberapa molekul tertentu sebagian dari energi yang diserap dipancarkan kembali berupa cahaya (fluoresensi). Apabila terjadi transisi dari ”first excited singlet” ke ”lowest triplet state” (intersystem crossing), maka elektronik state disebut fosforesensi. Umur dari fosforesensi (triplet state) lebih lama (10-4 detik sampai beberapa hari). Jika dibandingkan dengan fluoresensi (singlet excited state) yaitu sekitar 10-8 detik. Transisi energi yang terjadi pada waktu eksitasi (absorbsi), fluoresensi dan fosforesensi dapat dilihat pada diagram berikut.
