CROMATOGRAFIA DE REPARTO La cromatografía de reparto ha llegado llegado a ser el tipo de cromatografía más utilizado de las cuatro modalidades de cromatografía de líquidos. En el pasado la mayoria de a las aplicaciones se han referido a compuestos polares, polares, no iónicos, de baja a moderada masa molecular (habitualmente < 3000). Sin embargo, recientemente se han desarrollado algunos metodos( derivitalización y formación de pares iónicos) que han extendido las separaciones de reparto a los compuestos iónicos. La cromatografía de reparto se puede subdividir en cromatografía cromatografía liquido liquido y cromatografía de fase unida químicamente.la diferencia entre estas tecnicas radica en la forma que se retiene la fase estacionaria sobre las particula soporte del relleno. En liquido -liquido, la fase estacionaria líquida se retiene sobre la la superficie del soporte por adsorci ón física. En fase unida químicamente, la fase estacionaria se une quimicamente quimicamente a la la superficie del soporte.En la actualidad los métodos de fase unida químicamente son los que predominan debido a las desventaja de los sistemas líquido -líquido.una de esas desventajas es la perdida de la fae estacionaria por disolución en fase movil, lo que hace necesario un peiódico recubrimiento de las particulas del soporte. Por otra parte el problema de la solubilidad, de la fase estacionaria impide el uso de los rellenos relleno s de la fase líquida en la elución con gradiente. La cromatografía de reparto es hoy en día el método más utilizado. La cromatografía de reparto se divide en ³fase normal´, y ³fase reversa´, cuyas principales diferencias radican en las distintas polaridade s de sus fases estacionarias y móviles. COLUMNAS PARA LA CROMATOGRAFÍA DE FASE UNIDA QUIMICAMENTE Los soportes para casi todos los rellenos de fases unidas químicamente se separan con sílice rígida o composiciones constituidas básicamente por sílice. Estos sólidos están formados
por partículas mecánicamente resistentes,
porosos y uniformes, con diámetros de 3.5 o 10 µm. La superficie de la sílice totalmente hidrolizada (hidrolizada por calentamiento con HCl 0.1m durante uno o dos días) días) está constituida por grupos silanol químicamente reactivos. Es decir:
Las superficies de sílice características contienen cerca de 8µmol/m2 de grupos OH. Los recubrientos de fase unida químicamente más utilizados son los siloxanos, que se forman por reacción de la superficie hidrolizada con un organoclorosilano. Por ejemplo:
Donde R es un grupo alquilo o un grupo alquilo sustituido. El recubrimiento de la superficie por sililación se limita a 4µmol/m2 o menos a causa de los efectos esféricos. Los grupos SiOH que no han re accionado, desafortunadamente proporcionan una polaridad indeseable a la superficie, lo que origina picos cromatograficos con cola en especial con los solutos básicos. Para reducir este efecto, los rellenos de siloxano muchas veces desactivan por un proceso de bloqueo mediante reacción de clorotrimetilsilano, el cual, debido a su peuqño tamaño, puede unirse químicamente a muchos de los grupos silanol que no habían reaccionado. CROMATOGRAFÍA EN FASE NORMAL Inicialmente, la cromatografía de líquidos utilizaba fases estacionarias de elevada polaridad tales como el agua o el trietilenglicol soportadas sobre
paraticulas de sílice o alúmina; y como fase móvil se emplea un disolvente relativamente apolar con el hexano o el iso -propileter. Por razones históricas, a este tipo de cromatografía se le conoce ahora como cromatografía de fase normal. En esta cromatografía a diferencia de en fase reversa, la fase estacionaria es polar y la móvil apolar. Las fases estacionarias se obtienen haciendo reaccionar químicamente los centros silanoles activos de la sílice con un trialquilclorosilano. La retención también (como la de fase reversa) tiene lugar en esa especie de capa líquida depositada químicamente, como consecuencia de la distinta solubilidad relativa en la fase esta cionaria (polar) y la fase móvil (apolar). Donde el analito menos polar será el primero que se eluye y el más polar el último en eluir.
Se deduce que los analitos A, B, C tardan más tiempo en eluirse si se usa una fase móvil poco polar. Es decir, cuanto más polar sea el analito, más tardará en eluir.
CROMATOGRAFÍA EN FASE INVERSA En la cromatografía de fase inversa su fase estacionaria en apolar (con frecuencia un hidrocarburo), y la fase móvil polar (como el agua, el metanol o el acetonitrilo). Las fases estacionarias han sido obtenidas haciendo reaccionar químicamente
los
centros
silanoles
activos
de
la
sílice
con
un
trialquilclorosilano. La retención se produce en esta especie de capa líquida depositada químicamente como consecuencia de la distinta solubilidad relativa entre la fase estacionaria (apolar) y la fase móvil (polar). Los compuestos más retenidos son los más apolares. La retención y selectividad
se controlan fundamentalmente con la composición de la fase
móvil. Para obtener una fase móvil de fuerza de elución óptima, se ensayan mezclas de metanol, acetonitrilo o tetrahidrofurano en agua.
Las polaridades de los solutos son A> B > C Actualmente, el 75% de los análisis con HPLC se realizan en fase inversa. Permite un análisis directo de muestras acuosas y de compuestos solubles en
agua o en disolventes relativamente polares (metanol) y con peso molecular no superior a 2000 o 3000 ua. Si se compara con la de adsorción, su comportamiento cromatográfico es excelente.
SELECCIÓN
DE LA
COLUMNA
EN LAS ESPARACIONES
POR
CROMATOGRAFIA DE REPARTO Una cromatografía exitosa con fases móviles interactivas requiere un equilibrio adecuado entre la fuerzas intermoleculares existentes entre los tres participantes activos en el proceso de la separación ( el soluto, la fase móvil y la fase estacionaria). Estas fuerzas intermoleculares se describen cualitativamente en términos de polaridad relativa. Las polaridades en orden creciente para varios grupos funcionales
del
analito
son:
hidrocarburos<éteres<ésteres
APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFÍA DE REPARTO Como aplicaciones de la cromatografía de reparto en productos de alimentación: edulcarantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos en bebidas refrescantes, colorantes, aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos.
CROMATOGRAFIA DE ADSORCION La cromatografía de adsorción, o líquido - sólido, es la forma clásica de cromatografía de líquidos que introdujo Tswett por primera vez a principios del siglo XX. Más recientemente, se ha adaptado para llegar a convertirse e un método importante de HPLC. Las unicas fases que se utilizan en HPLC líquido- solido son la sílice y la alúmina, siendo la primera la que se prefiere para la mayoría, cuando no todas, las aplicaciones debido a su mayor capacidad de carga y a su mayor diversidad de presentaciones. Con pocas excepciones, las carateristicas de adsorción de los dos adsorbentes son similares. Con ambas, el orden de los tiempos de retencion es : olefinas< hidrocarburos aromáticos< haluros, sulfuros< éteres
SELECCIÓN DEL DISOLVENTE EN CROMATOGRAFIA DE ADSORCION Afortunadamente en la cromatografía de adsorción, las modificaciones del disolvente provocan una gran variación en la resolución y en el tiempo de retención, y solo en raras ocasiones no se puede encontrar la fase movil adecuada.
ELECCION DE LOS DISOLVENTES El procedimiento para la elección del disolvente en cromatografía de adsorción es esmejante al descrito para las separaciones de reparto. Es decir, se eligen dos disolventes compatibles, uno de los cuales es demasido fuerte y el otro que es demasiado debil. APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA DE ADSORCION La figura 28-1 ilustra como la cromatografía de adsorción e s la más adecuada para compuestos no polares probablemente con masa moleculares inferiores a 5000. Los métodos de cromatografía de adsorción y los de reparto tienden a ser complementarios, aunque en algún caso se superponen. En general, la cromatografía líquido-sólido es más adecuada para muestras que son solubles en disolventes no polares, y por tanto tienen una solubilidad limitada en los disolventes acuosos que son los que utilizan en los procedimientos de reparto en fase inversa. Como en cromatografía de reparto, los compuestos que tienen distintos grupos funcionales por lo general se pueden separar. Una característica particular de la cromatografía de adsorción, que no es compartida con otros métodos, es su capacidad para diferenciar compuestos isómeros.
