PRACTICA 5. CROMATOGRAFÍA Objetivo. Conocer la técnica como de cromatografía y los factores experimentales que la afectan Comparar la cromatografía con los procesos unitarios utilizados anteriormente en cuanto a la eficiencia como métodos de separación y purificación.
Introducción.
La cromatografía es una técnica de separación de solutos de una mezcla, que se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de un medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. A este disolvente se le llama fase móvil y el medio poroso puede ser la fase estacionaria, o bien servir de soporte a esta fase. Se habla de cromatografía en columna cuando la fase estacionaria o su soporte están contenidos en una columna. La separación cromatográfica constituye un proceso dinámico que permite un intercambio continuo por desplazamiento de una fase con respecto a la otra. El diferente reparto de solutos entre las fases móvil y estacionaria es la causa de la separación de los solutos. El soluto que tiene mayor afinidad por la fase estacionaria se moverá con mayor lentitud. La fase móvil se llama eluyente. Cuando emerge por la salida de la columna se llama eluato. El proceso que consiste en hacer pasar un líquido o un gas a lo
largo de la columna de cromatografía se llama elución. El volumen de elución (ve) es el volumen de fase móvil que se requiere para eluir un soluto dado de la columna cromatográfica. Se puede clasificar las cromatografías en 5 grandes grupos:
Cromatografía Cromatografía Cromatografía Cromatografía Cromatografía
de Reparto. de Adsorción. de Intercambio Iónico. de Exclusión. de Afinidad.
Cromatografía de Reparto: Está basada en la separación o reparto de una mezcla de solutos entre la fase móvil (disolvente) y la fase estacionaria soportada sobre un sólido adecuado, de acuerdo a las distintas solubilidades de estos solutos en ambas fases. Si el disolvente es un líquido se denomina cromatografía líquida. Son cromatografía de reparto la cromatografía en papel y la cromatografía en capa fina (TLC).
La cromatografía en papel se utiliza para la separación de cantidades mínimas de soluto y también como un criterio de pureza. Se basa en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a través de una fase estacionaria que es el agua retenida sobre un soporte sólido e inerte (celulosa), arrastrado por un disolvente en movimiento . Una vez realizada la cromatografía, la posición de los componentes se determina mediante una técnica que permita “visualizarlos”. Es común revelar el cromatograma mediante reacciones que originen productos coloreados. Los componentes de una mezcla se pueden identificar por su migración con respecto al solvente móvil en condiciones definidas en relación con el comportamiento de patrones. El cromatograma no es alterado por la presencia de otros solutos. Se calcula la razón de migración del soluto con respecto a la fase móvil ( R f ) que se compara con la de los patrones (Ec. 2.1).
R f
distancia recorrida por el soluto
distancia recorrida por la fase móvil
Ecuación 1
El R f debe calcularse de acuerdo a la distancia recorrida por el soluto, desde su punto de partida hasta el punto medio de la posición de éste una vez corrida la cromatografía, y la distancia recorrida por la fase móvil, también medida desde el punto de partida del soluto hasta el frente del solvente en el papel.
Como los R f son constantes en condiciones definidas y controladas permiten identificar los componentes de una mezcla de solutos, en la medida que los R f de muestras y patrones se obtengan en un mismo experimento.
b.
Cromatografía de Adsorción:
Está basada en la diferente adsorción y posterior desorción de sustancias contenidas en un disolvente móvil (líquido o gas) sobre un sólido estacionario. No se debe confundir la adsorción que es un fenómeno de superficie que se manifiesta por el aumento de concentración de la interfase que rodea al medio estacionario, con la absorción que consiste en la penetración de una sustancia en el seno de otra. Ejemplos de cromatografía de adsorción son la cromatografía en columna de alúmina y de carbón activado, la placa de sílica gel. c.
Cromatografía de Intercambio Iónico:
La fase estacionaria es una matriz polimérica porosa que posee grupos iónicos unidos covalentemente y contraiones móviles que pueden ser intercambiados por iones arrastrados por la fase móvil (líquido). d.
Cromatografía de Exclusión Molecular:
Las moléculas pueden ser separadas también sobre la base de sus diferentes tamaños al pasar a través de una columna que contiene partículas hidratadas de geles porosos. Se encuentra en el mercado un buen número de materiales para estos fines, cuya composición y porosidad son controladas cuidadosamente, de modo que moléculas de tamaño relativamente parecido puedan ser separadas mediante la adecuada selección del tamaño del poro gel (tabla 1). El Sephadex consta de partículas pequeñas de dextrano formadas por una red tridimensional de cadenas de polisacáridos ramificados. Es altamente polar debido a su alto contenido de grupos hidroxilos, por ello se hincha considerablemente cuando se coloca en agua. La mezcla de moléculas grandes y pequeñas se colocan sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la muestra desciende por la columna, las moléculas pequeñas difunden dentro del gel teniendo que recorrer un
camino más largo, mientras que las moléculas grandes pueden ser completamente excluidas de los poros del gel. Eventualmente se obtiene una separación completa en la que las moléculas grandes salen primero de la columna y por último las más pequeñas.
El resultado de la columna cromatográfica se expresa en la forma de un diagrama de elución que muestra la variación de la concentración del soluto en el eluyente versus el volumen del eluyente que ha pasado por la columna. De este diagrama se obtiene el volumen de elución.
El volumen de elución ( Ve) no es un criterio para definir el comportamiento de un compuesto, ya que varía con el volumen total de la columna ( Vt) y la forma como la columna ha sido empaquetada. Para ello se utiliza la constante Kav (Ec. 2.2).
K av
v v
e
t
v v
Ecuación 1.1
En cromatografía de exclusión el volumen de la fase móvil se llama volumen intersticial ( V0). El valor de V 0 se determina haciendo pasar por la columna una molécula grande e inerte de peso molecular superior al límite de exclusión del gel. El azul de dextrano 2000, un colorante con peso molecular de 2*10 6, se utiliza generalmente con este propósito. Cuando no se dispone de la información adecuada para este cálculo, el V o se puede estimar como el 35% del volumen total de la columna ( V t) . El volumen total de la columna se calcula a partir de las dimensiones de la columna (V t = · r 2 · h ).
Nota: Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente: Hidrocarburos < olefinas < flúor < cloro < nitro < aldehído Aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas
Cromatografía de gases
La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna. Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido (GSC) y la cromatografía gas- líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza más ampliamente, y que se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC). En la GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorción. Precisamente este proceso de adsorción, que no es lineal, es el que ha provocado que este tipo de cromatografía tenga aplicación limitada, ya que la retención del analito sobre la superficie es semipermanente y se obtienen picos de elución con colas. Su única aplicación es la separación de especies gaseosas de bajo peso molecular. La GLC utiliza como fase estacionaria moléculas de líquido inmovilizadas sobre la superficie de un sólido inerte. Cromatografía líquida
La Cromatografía líquida, también conocida como Cromatografía de líquidos, es una técnica de separación y no debe confundirse con una técnica cuantitativa o cualitativa de análisis. Es una de las técnicas analíticas ampliamente utilizada, la cual permite separar físicamente los distintos componentes de una solución por la absorción selectiva de los constituyentes de una mezcla. En toda cromatografía existe un contacto entre dos fases, una fija que suele llamarse fase estacionaria, y una móvil (fase móvil) que fluye permanente durante el análisis, y que en este caso es un líquido o mezcla de varios líquidos. La fase estacionaria por su parte puede ser alúmina, sílice o resinas de intercambio iónico que se encuentran disponibles en el mercado. Los intercambiadores iónicos son matrices sólidas que contienen sitios activos (también llamados grupos ionogénicos) con carga electrostática (positiva o negativa). De esta forma, la muestra queda retenida sobre el soporte sólido por afinidad electrostática. Dependiendo de la relación carga/tamaño unos constituyentes de la mezcla serán retenidos con mayor fuerza sobre el soporte sólido que otros, lo que provocará su separación. Las sustancias que permanecen más tiempo libre en la fase móvil, avanzan más rápidamente con el fluir de la misma y las que quedan más unidas a la fase estacionaria o retenidas avanzan menos y por tanto tardarán más en salir o fluir. Éste es el principio fundamental de la cromatografía. Un ejemplo notable es la cromatografía de intercambio iónico. Las columnas más utilizadas son las de sílice. Cromatografía de intercambio iónico
La cromatografía de intercambio iónico (o cromatografía iónica) es un proceso que permite la separación de iones y moléculas polares basadas en las propiedades de carga de las moléculas. Puede ser usada en casi cualquier tipo de molécula cargada, incluyendo grandes proteínas, pequeños nucleótidos y aminoácidos. La solución que debe inyectarse es usualmente llamada "muestra" y los componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a menudo en purificación de proteínas, análisis de agua o control de calidad.
Propiedades de los Reactivos Reactivos que usamos en esta práctica: Sílica-gel para la columna El gel de sílice o ácido silícico es uno de los más utilizados, es débilmente ácido, su pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deberá utilizar con sustancias que se corrompan con los ácidos. Los geles de sílice normales suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este factor también se debe tener en cuentas respecto al uso de componentes. El tamaño del grano suele ser de 10 a 40 micras ( µ) y el tamaño de poro varía de 20 a 150Å. Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato de cálcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente. También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o por separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de sílice. Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga apto para separar componentes lipófilos (esteroides, ácidos grasos, ceras, vitaminas liposolubles, etc.). A este proceso se le denomina cromatografía de fase reversa.
Reactivo Metanol Acetato de etilo Hexano
Propiedades de los Reactivos Punto de Ebullición Punto de Congelación Fórmula (°C)
(°C)
CH3OH 65 CH3COOCH2CH3 77.2 C6H14 68
-198 -84 -195
Inflamabilidad ++++ ++++ ++++
Nota: La polaridad de los reactivos está indicada en orden descendente.
Resultados
R f
distancia recorrida por el soluto
distancia recorrida por la fase móvil
Rf= AcOEt: CH 3CH2OH 7:3 Rf= O.4? Rf= 1.4/3.8 = 0.37
Discusión de resultados En nuestra cromatoplaca obtuvimos una mancha grande, esto se debió a que no dejamos secar entre una aplicación con el capilar y otra.
Comprobamos la importancia del cuidado al inyectar la columna, pues si se derrama por las paredes de la columna la técnica no se desarrolla adecuadamente, no se observa la separación de las distintas fases, recordemos que esta separación es importante para identificar la posición de las fases y colectarlas. Es importante tener cuidado al trazar nuestras marcas guía en la cromatoplaca, hay que usar un lápiz con punta muy suave, pues de lo contrario una punta afilada podría cortar la cromatoplaca. En la separación por cromatografía en placa fina de una mezcla de colorantes, no se observa la separación, consideramos necesario su revelación por medio de UV. En nuestra columna cromatográfica se apreció muy claramente la separación de las fases, los primeros tubos que colectamos eran muy coloridos, y gradualmente fueron perdiendo esta característica, lo que nos indica la separación por volúmenes.
Análisis La primera mezcla que usamos, la de hexano: Acetato de etilo 1:1 es poco polar por lo que al hacerla pasar por la columna, eluyeron las sustancias no polares, mientras que las polares quedan adheridas a la matriz de la columna, es decir al sílica-gel; al cambiar la mezcla a acetato de etilo: metanol 1:1 de mayor polaridad, las moléculas polares van moviéndose al reemplazarse su interacción con la sílica-gel por interacción con la mezcla acetato de etilo: metanol 1:1. Así observamos una mayor separación.
Cuestionario 1. Indicar qué precauciones se deben tener al empacar una columna de cromatografía.
Al agregar la suspensión de sílica-gel es una mezcla de hexano:acetato de etilo 1:1 hay que golpear ligeramente con los dedos para que el empacado sea uniforme.
Mantener un goteo uniforme en la llave de salida del disolvente, pero hay que tener cuidado de no dejar la sílica-gel sin disolvente . Mantener siempre el nivel del eluyente 0.5cm por arriba del nivel del adsorbente. La columna se llena hasta tres cuartas partes de su capacidad. Es importante conocer la polaridad del adsorbente para así elegir la polaridad del disolvente. 2. Indicar qué fracciones se separaron por cromatografía en columna, de los extractos de espinaca, jitomate y cómo se identificaron.
De los jitomates obtuvimos licopenos, y de las espinacas: pigmentos, caroteno, clorofila a y clorofila b.; y mediante cromatografía en capa fina, obtuvimos la separación de sus componentes al pasar el disolvente por el punto aplicado, y por cromatografía en columna obtuvimos fracciones coloridas, las cuales indicaban el grado de separación. 3. Escriba ¿qué conclusiones se obtienen de la cromatografía en capa fina y de la cromatografía en columna?
En la cromatografía plana la separación se realiza por distancias mientras que e n columna se hace por volúmenes (de las fracciones separadas) En la cromatografía en columna la separación de varias muestras, se realiza de forma secuencial, por lo que si tenemos p. ej. dos muestras cada una de ellas deberá someterse individualmente al mismo proceso de introducción en la columna; en la cromatografía de placa fina por el contrario, la separación de varias muestras se puede realizar de forma simultánea, y todas ellas sometidas al mismo tiempo al proceso separativo esto supone un ahorro de tiempo considerable. 4. Definir los siguientes términos: Adsorción: Se llama adsorción al fenómeno de acumulación de partículas sobre una
superficie. La sustancia que se adsorbe es el adsorbato y el material sobre el cual lo hace es el adsorbente. La adsorción se utiliza para eliminar de forma individual los componentes de una mezcla gaseosa o líquida. El componente a separar se liga de forma física o química a una superficie sólida. El componente eliminado por adsorción de una mezcla gaseosa o líquida puede ser el producto deseado, pero también una impureza. Este último es el caso, por ejemplo, de la depuración de gases residuales. El sólido recibe el nombre de adsorbente, y el componente que se adsorbe en él se denomina adsorbato. El adsorbente se debería ligar, en lo posible, sólo a un
adsorbato, y no los demás componentes de la mezcla a separar. Otros requisitos que debe cumplir el adsorbente son: una gran superficie específica (gran porosidad) y tener una buena capacidad de regeneración. Un adsorbente muy utilizado es el carbón activo. La adsorción se favorece por temperaturas bajas y presiones altas. Cromatografía de adsorción: El sólido adsorbe al componente que inicialmente estaba
en fase móvil (liquida o gaseosa) (Fuerzas de Van der Waals).
Partición: Fenómeno de reparto entre las dos fases debido a su solubilidad. La
solubilidad es una medida de la polaridad y de otro tipo de interacciones moleculares.
Eluyente: Se trata de un disolvente que se usa para llevar los componentes de una
mezcla a través de una fase estacionaria.
Eluato: solución o sustancia obtenida por un proceso de elución. [Elución: extracción
de una sustancia absorbida desde un lecho poroso o columna de cromatografía con un disolvente adecuado]
Disolvente: Un disolvente es una sustancia que permite la dispersión de otra en su
seno. Es el medio dispersante de la disolución. Normalmente, el disolvente establece el estado físico de la disolución, por lo que se dice que el disolvente es el componente de una disolución que está en el mismo estado físico que la disolución. También es el componente de la mezcla que se encuentra en mayor proporción. Las moléculas de disolvente ejercen su acción al interaccionar con las de soluto y rodearlas. Se conoce como solvatación. Solutos polares serán disueltos por disolventes polares al establecerse interacciones electrostáticas entre los dipolos. Los solutos no polares disuelven las sustancias no polares por interacciones entre dipolos inducidos. El agua es habitualmente denominada el disolvente universal por la gran cantidad de substancias sobre las que puede actuar como disolvente.
Fase móvil: La fase móvil puede ser un líquido o un gas, y su función es transportar a
los componentes de la mezcla a través del sistema cromatográfico.
Fase estacionaria: Esta fase permanece fija y consiste en partículas, generalmente
sólidas, pequeñas y con una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma de capa. En ocasiones es necesario un tratamiento químico de la fase estacionaria para conseguir unas partículas de tamaño y poro adecuados.
R f .: Relación de frentes. Es el cociente de la división f s/ f d (distancia recorrida por el
soluto entre distancia recorrida por el disolvente. Se utiliza con fines de identificación de compuestos cando se tienen patrones de referencia. 5.- Hacer una comparación entre la cristalización, extracción, destilaciones y cromatografía, en cuanto a la eficiencia como métodos de separación y purificación.
La cristalización es un método de purificación de sólidos el cual es muy buen método solo para sólidos y con un buen rendimiento. El método de extracción se utilizo para la separación liquido-liquido, en base a la elección de un buen disolvente, la extracción resulta muy eficiente para este tipo de separación. Las destilaciones requieren de mucho cuidado y tiempo, ya que como vimos en prácticas anteriores una destilación lenta y con un número de mayor de platos teóricos, en comparación a una destilación simple y muy rápida, muestra la destilación fraccionada mayor eficacia. Cada método tiene buena eficiencia según se utilice en el proceso correcto, es decir, depende del estado de agregación de la sustancia a separar y purificar, así como del estado en el que se encuentren los contaminantes y los disolventes utilizados.
6.-Establecer una distinción clara entre cromatografía en columna y capa fina e indicar en que casos es preferible alguno de los métodos
Un proceso cromatografico en columna tiene ventaja de ser separación a capa preparativa, y no es de aplicación analítica como la cromatografía en capa fina, es decir la cromatografía en capa fina sirve solo para verificar la pureza de un compuesto, de hecho, si es una sustancia que se separo por columna cromatografía, se puede llevar a cromatografía de capa fina verificar la pureza de cada fracción obtenida de la columna.
Conclusiones La cromatografía es la técnica más eficiente al compararla con destilaciones, cristalización, o extracciones, esto porque es aplicable a la gran mayoría de las sustancias. La cromatografía en columna, nos permite usar una gran cantidad de la sustancia a separar, y la cromatografía en capa fina, nos permite realizar separaciones múltiples, al mismo tiempo, y sometidas al mismo proceso separativo.
Bibliografía Técnicas de bioquímica y biología molecular. David Freifelder. Editorial Reverté, 1991. ISBN: 8429118195. Cap. 8: Cromatografía. Pág. 179 Skoog, Douglas A. y Leary, James J. (1994), Análisis Instrumental, Madrid: McGraw-Hill.