Fase normal Gas de inversa Iones arrastre
Grupo electronegativo
Fase Disminución de la corriente de la celda
Sup. apolar OH CH3 Sup. polar CH3 OH de la fase CH3 de la fase OH estacionaria CH3 CorrienteOH deCfondo estable a través de los electrodos estacionaria OH
OH OH OH OH
CH3
de la celda
CH3
ROMATOGRAFIA Eluyente apolar
Polaridad ¿Qué es?media
Polar
Cromatografía
CH3 CH3
Eluyente polar
Apolar
¿Para qué sirve?
La cromatografía es una técnica en donde se lleva a cabo la separación de compuestos con el propósito de identificar, cuantificar o purificar cada uno de los componentes de una mezcla de solutos, basándose en las velocidades con las que se mueve cada soluto a través de un medio poroso arrastrado por un solvente, una mezcla de solventes o por gas(13). ¿Cómo se divide la Cromatografía? Existen diferentes divisiones en la práctica para la cromatografía como la de adsorción, reparto, intercambio iónico, exclusión molecular, y por afinidad (8, 10). La cromatografía de adsorción es la forma más antigua de la cromatografía en la cual se utiliza una fase estacionaría sólida y una fase móvil líquida o gaseosa. El soluto puede adsorberse en la superficie de las partículas sólidas. El equilibrio entre el estrado adsorbido y la solución es la causa de la separación de las moléculas del soluto. La cromatografía de reparto es una técnica en donde una fase estacionaría forma una película delgada de la superficie de un soporte sólido. El soluto se equilibra entre este líquido estacionario y una fase móvil líquida o gaseosa. La cromatografía de intercambio iónico se basa en el equilibrio de los iones de soluto entre el solvente y los sitios fijos cargados de la fase estacionaría esta cuenta con intercambiadores aniónicos (grupos con carga positiva unidos covalentemente) los cuales retienen a los aniones del soluto y con intercambiadores catiónicos (grupos con carga negativa) retienen a los cationes del soluto. La cromatografía de exclusión molecular se denomina también cromatografía de filtración en gel, en esta técnica las moléculas se separan por su tamaño se utiliza mucho en la bioquímica para separar moléculas grandes como proteínas, carbohidratos e incluso para separar polímeros y caracterizarlos.
1
Cromatografía La cromatografía por afinidad es una técnica muy selectiva se utilizan interacciones altamente específicas entre un tipo de moléculas de soluto y otras moléculas que se unen (inmovilizan) covalentemente a la fase estacionaría. La cromatografía de líquidos de alta resolución se utiliza para separación de compuestos que no son lo suficientemente volátiles o no tienen bastante estabilidad térmica para la cromatografía de gases. Se utilizan columnas empacadas grandes con fase móvil suministrada por gravedad o por bombeo a baja y alta presión en esta ultima se utilizan columnas pequeñas que contienen un menor tamaño de partícula de empaque gel de sílice o alúmina. La cromatografía de gases se basa en que un líquido volátil o un soluto gaseoso son arrastrados por una fase móvil gaseosa que circula sobre un líquido estacionario que recubre un soporte sólido o sobre una superficie sólida absortiva. Se describen a continuación los principios de la cromatografía de gases y al finalizar se explicaran los mismos para la cromatografía de líquidos.
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Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE GASES
La cromatografía de gases se utiliza para separar, identificar y cuantificar cualquier material que contenga una presión de vapor apreciable (1 a 1000 mm Hg) a una temperatura de operación de la columna (medio de separación) desde –70° C a 400° C(12). Se basa en la diferencia de velocidades de migración de los componentes de una mezcla entre dos fases; una estacionaria y una móvil (gas), de tal manera que cada componente es selectivamente retenido por la fase estacionaria. En esta cromatografía un soluto gaseoso (vapor de un líquido volátil) es transportado por una fase móvil gaseosa. De acuerdo al tipo de fases estacionaria se clasifica en dos: La fase estacionaría suele ser un líquido no volátil que recubre el interior de la columna o un soporte sólido de grano fino. Esta forma más común de cromatografía de gases se llama cromatografía de reparto o de partición gas – líquido. En ocasiones se utilizan como fase estacionaria partículas sólidas sobre las que el soluto puede adsorberse. En este caso la técnica se denomina cromatografía de adsorción gas – sólido. ¿Qué pasa dentro de un cromatógrafo de Gases? 1. Una muestra de líquido volátil es inyectada a través de un septo de goma (un disco delgado) en un puerto de inyección caliente, recubierto de vidrio o metal, donde se vaporiza la muestra. La muestra gaseosa puede inyectarse con una jeringa de cierre hermético o a través de una válvula de muestreo de gas. 2. La muestra es arrastrada rápidamente hacia la columna del gas portador inerte (que suele ser He, N2 o H2), que actúa como fase móvil. Después de pasar por la columna que contiene la fase estacionaría, los solutos son separados y fluyen por un detector, cuya respuesta se visualiza en un registrador o una computadora. 3. No es necesario que la temperatura de la columna sea mayor que el punto de ebullición de todos los solutos. Sólo debe ser lo bastante elevada para que cada soluto tenga suficiente presión de vapor a fin de ser eluido en un tiempo razonable. 4. El detector se mantiene a mayor temperatura que la columna, de modo que en esta todos los solutos están en fase gaseosa. Los solutos que salen del cromatógrafo de
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Cromatografía gases pueden colectarse para su identificación o enviarse directamente a un espectrómetro de infrarrojo o de masas para el análisis inmediato de cada pico cromatográfico. 5. Para colectar cantidades de soluto del orden de los microlitros, en el puerto de salida del cromatógrafo se inserta en un tubo de vidrio en U, el fondo de ese tubo se enfría con hielo seco o nitrógeno líquido para condensar el soluto.
Figura 1. Esquema de un Cromatógrafo de Gases.
¿Cuáles son las partes de un cromatógrafo de Gases? En general las partes básicas de un cromatógrafo de gases son: 1.- Gas de arrastre (Cilindro). 2. - Regulador de presión y válvulas de control de flujo. 3.- Inyector ( Sistema de muestreo) 4. –Horno de la Columna 5. - Columna. 6. - Detector 7. - Registrador
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Cromatografía
GAS DE ARRASTRE El Cromatógrafo de Gases emplea gas como fase móvil para este tipo de cromatografía, las características que este gas debe reunir básicamente son las siguientes:
•Inerte con respecto a la muestra y a la fase estacionaria •Capaz de minimizar la difusión gaseosa. •De fácil disponibilidad y con un alto grado de pureza •Adecuado al tipo de detector que se emplea. Sobre la base de esto los gases más usados en cromatografía de Gases son el Helio, Nitrógeno e Hidrógeno, ya que son inertes, tienen baja difusión gaseosa y se encuentran fácilmente con altos grados de pureza como 99.999%, aunque también se usa la mezcla Argón-metano (95-5%). La velocidad para un flujo óptimo se puede determinar experimentalmente empleando la ecuación de Van Deempter(6, 14). La velocidad de flujo más eficiente, es el mínimo de la altura equivalente de un plato teórico, o bien, al máximo del número de platos (2, 12).
AEPT
Velocidad de flujo Figura 2. Plano de Van Deempter para la selección de la velocidad de flujo óptimo del gas de arrastre (10)
REGULADOR Un regulador de presión se emplea para uniformar la entrada del gas en la columna. Es importante que el regulador sea el adecuado para cada tipo de gas y además que sea apropiado para gases de alta pureza.
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Cromatografía
SISTEMAS DE MUESTREO Es el lugar donde se introduce la muestra al cromatógrafo de gases y en el cual la muestra debe evaporarse de inmediato y combinarse con el gas de arrastre. Debido a la composición o estado de las muestras, estas pueden caracterizarse como: Muestras líquidas. Se emplea una jeringa con punta, se perfora con ella un septum. Muestras gaseosas. Se emplean válvulas muestreadoras especiales con el empleo de circuitos muestreadores de volúmenes específicos, o bien con jeringas especiales de precisión. Muestras sólidas. Se recurre a solventes o se emplean jeringas especiales en forma de espátulas.
SOLVENTES Las características básicas que un solvente debe tener para ser empleado en cromatografía de gases son: •Un buen solvente absoluto para los componentes de la muestra, si la solubilidad es baja, los componentes eluyen rápidamente y la separación es pobre. •Ser un buen solvente diferencial para los componentes de la muestra. •No volátil, la presión de vapor 0.01 a 0.1 mide Hg a la temperatura de operación razonable para la vida de la columna. •Térmicamente estable, la inestabilidad puede ser promovida por el soporte con la influencia de la temperatura. •Químicamente inerte con respecto a la muestra.
(12)
COLUMNAS Las columnas empacadas de acero inoxidable o vidrio tienen diámetros de 3 a 6 mm y de 1 a 5 m de longitud. La columna se llena con un soporte de grano fino recubierto de un líquido no volátil como fase estacionaria, aunque el sólido mismo puede ser la fase estacionaria. Para trabajos preparativos, el espesor de la fase
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Cromatografía estacionaria se incrementa para dar más cabida a la muestra y se prefieren las columnas de mayor diámetro (figura 3). Las columnas tubulares abiertas son mucho más estrechas y pueden ser mucho más largas que las columnas empacadas. El diseño tubular abierto proporciona mayor resolución, menor tiempo de análisis y mayor sensibilidad que las columnas empacadas, pero con el se maneja una cantidad de muestra considerable menor. El aumento en la resolución se debe a que la longitud de la columna es mayor por lo cual aumenta el número de platos teóricos por unidad de longitud. El tiempo de análisis se debe a que la columna contiene mucho menos fase estacionaria que en el caso de la columna empacada, de modo que se retiene menos a los solutos. (7, 8, 11)
Columna empacada diámetro interno 1/4 o 1/8 in
Empaque y fase estacionaria Acero inoxidable, vidrio, cobre, teflón.
Columna capilar diámetro interno 1/16 in Fase estacionaria Silica Fundida Capa de poliamida
Figura 3. Diferencia entre columna empacada y capilar.
El menor soluto de la fase estacionaria significa que la columna tubular abierta puede aplicarse mucho menos muestra que a una columna empacada(14). La sensibilidad es una medida de la relación señal-ruido del detector para una concentración dada de analito en la solución inyectada. La sensibilidad que se obtiene con una columna tubular abierta es mayor que la propia de una columna empacada, debido a que 1) un gas óptimo para el funcionamiento del detector se agrega a la corriente de la muestra al entrar al detector; 2) los contaminantes provenientes del septo se reduce por purga continua del sistema de entrada; 3) se reduce el paso de fase estacionaria de la columna hacia el detector, porque hay menos fase estacionaria;
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Cromatografía 4) las fluctuaciones en el flujo del gas portador, que inducen fluctuaciones en la respuesta del detector son amortiguadas por la considerable longitud de la columna capilar. SOPORTE SÓLIDO Las columnas empacadas contienen un líquido no volátil depositado en partículas finas de un soporte sólido “inerte”. El soporte debe ser de un material resistente en partículas pequeñas en forma constante, con gran área superficial. La mayoría de los soportes son de diatomita (tierra de diatomeas), consistente en los esqueletos de sílice de las algas microscópicas denominadas diatomeas. El soporte no debe interactuar con los solutos, pero ningún soporte es del todo inerte. La silanización con hexametildisilazina o diclorometilsilano ((CH3)2SiCl2) es una forma ampliamente utilizada de reducir la interacción de partículas de sílice con solutos polares. Para solutos muy reactivos el teflón puede ser un soporte útil. (8) La uniformidad del tamaño de partículas reduce el término de trayectorias múltiples en la ecuación de Van Deemter*, con lo cual también reduce la altura del plato e incrementa la resolución. El tamaño reducido de la partícula reduce el tiempo requerido para el equilibrio de los solutos, lo que mejora la eficiencia de loa columna. Sin embargo menor tamaño de partícula, más presión se requiere para forzar la fase móvil a través de la columna. (8) El tamaño de partícula de los soportes cromatográficos se expresa como tamaño de malla, el cual se refiere al tamaño de poro de tamices por los cuales las partículas de los soportes cromatográficos pasan o son retenidas. Una partícula con tamaño de malla 100/200 pasará por un tamiz número 100 pero no por otro número 200. El número de tamiz se refiere a la cantidad de dos poros por pulgada lineal de malla. (8) Hay 5 formas de Chromosorb A, G, P, W y T; los cuales son disponibles con o sin tratamiento y en una variedad de rangos de malla. Chromosorb es una marca registrada para soporte sólido por Jhons Manville. (8)
FASE ESTACIONARIA Existe una variedad increíble de fases líquidas disponibles para la cromatografía de reparto gas-líquido. La elección de una fase líquida para un problema dado es esencialmente empírica. Sé presentan a continuación las diferentes clases de solutos que son retenidas con frecuencia por cada fase líquida. Una variedad de fases líquidas puede ser apropiada para resolver un problema dado de separación.
8
Cromatografía
Tabla 1. Fases líquidas comunes para columnas cromatográficas (10) I.- Baja Polaridad Hidrocarburos saturados Hidrocarburos olefínicos Hidrocarburos aromáticos Halogenuros de alquilo Mercaptanos Sulfuros
CS2
II.- Polaridad intermedia Éteres
III.- Polares
IV.- Muy polares
Alcoholes
Polihidroxialcoholes
Cetonas
Ácidos carboxílicos
Aminoalcoholes
Aldehídos
Fenoles
Hidroxiácidos
Ésteres
Aminas primarias
Ácidos polipróticos
Aminas terciarias Compuestos nitro (sin átomos de hidrógeno en ) Nitrilos (sin átomos de H en )
Oximas Compuestos nitro (sin átomos de hidrógeno en ) Nitrilos (sin átomos de H en )
Polifenoles
Tabla 2. Fases líquidas comunes usadas en Cromatografía de Gases(10) (silicones) CH 3
CH 3 Si
O
CH 3
SE – 30
APIEZON OV – 17
Tetrahidroxietilendiamina
O
CH 3
r
350° C máx.
(Hidrocarburos mezclados) (Metilfenilsilicona) HO
CARBOWAX 20M
Si
CH2
CH 2
O
275 – 300° C máx. 300° C máx.
n
H
250° C máx. EDTA
150° C
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Cromatografía
La cantidad de fase líquida utilizada se expresa como porcentaje en peso del soporte líquido. Las cargas más comunes están en el intervalo de 2 a 10%. Por encima del 30%, la eficiencia de la columna disminuye debido a que se forman algunas de fase líquida. Abajo del 1% la superficie del soporte puede ser no cubierta por completo(8) . En general un gran porcentaje de fase líquida conduce a una mayor capacidad para el soluto, tiempos de retención mayores, y mayor separación entre picos. Un porcentaje más bajo da por resultados análisis más rápidos y valores más pequeños de HETP. En las columnas tubulares abiertas se utilizan fases líquidas similares, con modificaciones que minimizan la descarga de fase líquida de la columna En las columnas empacadas como en las tubulares abiertas se emplean varias fases estacionarias sólidas. La alúmina (Al2O3) es un material común que puede separar hidrocarburos en cromatografía de reparto gas-sólido. Los tamices moleculares son una notable fase sólida ampliamente usada en cromatografía; son materiales inorgánicos o polímeros orgánicos con grandes cavidades en las cuales pueden entrar moléculas pequeñas que son parcialmente retenidas.(8, 10) Es posible separar entre si moléculas pequeñas como H2, O2, N2, CO2, y CH4. También pueden sacarse gases haciéndolos pasar por trampas que contienen tamices moleculares, porque estos retienen fuertemente el agua. Los tamices inorgánicos pueden regenerarse (secarse) calentándolos a 300° C a vacío o a un chorro de N2.
EFICIENCIA DE LA COLUMNA La eficiencia de la columna se mide por el número de platos teóricos; al comparar la eficiencia de las columnas, debemos ser específicos al solvente, soluto, temperatura, velocidad de flujo y tamaño de la muestra. Cuando una sustancia entra a la columna junto con el gas de arrastre, se disolverá en la fase liquida hasta que se establezca un equilibrio, de acuerdo con los valores de la concentración en la fase estacionaria y en la fase m6vil. Durante el paso de la sustancia, a lo largo de la columna, este equilibrio se rompe por efecto de transporte y debe restablecerse consecutivamente. Desde el punto de vista teórico, es conveniente considerar este proceso en varios pasos discontinuos de equilibrio; es como si dividiéramos la columna en un número de secciones iguales entre si; en cada una de estas secciones, el equilibrio vapor-liquido debe restablecerse. Se ha denominado a cada una de estas secciones "Plato Teórico" (2) El valor del número de platos teóricos puede obtenerse de un cromatograma, a partir de la expresión siguiente: N = 16 ( x/y)2
10
Cromatografía donde "x" es el tiempo de retención del componente y "y" es la amplitud de la base, por lo que, se tiene: N =16 ( tr/wb)2 El número efectivo de platos teóricos para una columna equivale a: N ef =16 Ctlr/wb )2 donde: t’r = tr - tm A partir del número de platos y conociendo la longitud de la columna, podemos encontrar el valor de la altura equivalente de un plato teórico (HETP). HETP =L/N donde: "L" es la longitud de la columna cromatográfica, usualmente en cm.(12, 13) EFICIENCIA DEL SOLVENTE La eficiencia del solvente está relacionada con los siguientes cuatro aspectos. 1. Fuerzas de interacción y coeficiente de partición. a) Orientación o fuerzas keesom: Fuerzas resultantes de la interacción entre dos dipolos permanentes. El enlace de hidrógeno es un tipo importante de fuerza de orientación, que particularmente se encuentra en cromatografía de gases. b) Dipolo inducido o fuerzas Debye: Fuerzas resultantes de la interacción entre el dipolo permanente de una molécula y el dipolo inducido de una molécula vecina. Estas fuerzas son generalmente pequeñas. c) Dispersión o Fuerzas no-polares (London): Fuerzas acumuladas de las variaciones sincronizadas en los dipolos instantáneos de l interacción de las especies. d) Fuerzas de interacción específica: resultado de fuerzas de los enlaces químicos, formación de complejos entre el soluto y el solvente.(10) 2. Eficiencia del solvente y temperatura. La eficiencia del solvente se mide por la retención relativa () de 2 componentes x2
x1
x1’ x2’
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Inyección
To
T1
T2
Cromatografía
Figura 4. Retención relativa para 2 compuestos. Retención relativa: = x’2/x’1
si
=1, no hay separación
es la relación de los tiempos de retención corregidos o coeficientes de partición para 2 picos. La retención relativa difiere del factor de separación (F.S), donde SF es relación de los tiempos de retención sin corregir. Ver figura 4. (10) SF
x 2 tr2 x1 tr1
3. Resolución (R).
La separación real de dos picos consecutivos se mide por la resolución, R es una medida de las eficiencias de la columna y el solvente. Ver figura 5. (10)
Figura 5. Medidas para obtener la resolución de dos picos
R
tr2 tr1 2d o bien R 2 w1 w2 w1 w2
El valor de la resolución R dependerá de que tan bien definidos estén los picos. R=1 Significa que los picos están separados al 98% o sea que el 2% de los picos están traslapados, R=1.5 significa que los picos están completamente separados (99.7% separados). 4. Número de platos para una separación requerida J.H. Punell desarrolló una ecuación para determinar el número de platos requeridos, así como la longitud de la columna requerida, la expresión es la siguiente: 12
Cromatografía
N req
16 R 1 2
2
k'2 L k'2
2
donde k’2 es el factor de capacidad para el segundo pico (pico más retenido), el factor de capacidad k, también puede definirse como el tiempo que pasa un compuesto en la fase liquida de la fase estacionaria. k '2
tr ' 2 tm
k'
tr ' to
donde K es el Factor de capacidad L es la longitud Lreq Lorig
N reg N orig
. (10) DETECTORES El detector cromatográfico es un recurso con el cual se identifica y mide la cantidad de componentes separados por el gas portador. Una de las clasificaciones digamos clásica de los detectores se divide en:
integrales diferenciales.
Detector integral. Es aquel que da una respuesta proporcional a la masa total del componente en la zona eluída. Cuando el gas portador pasa a través del detector, el registrador muestra una línea recta (línea base), cuando un componente pasa a través de la zona, la pluma del registrador se mueve a través de la carta por una distancia proporcional a la masa total del componente en la zona. El cromatograma que produce un detector integral consiste en una serie de etapas que corresponden a cada componente (figura 6). (10, 11) R E S P U E S T A
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Cromatografía
T 1 T2
Tiempo
Figura 6. Cromatograma integral. Detector diferencial. Es aquel que da una respuesta proporcional a la concentración o a la masa de velocidad de flujo del componente eluído. El ejemplo de un detector que responde a la concentración es el de conductividad térmica, el detector de ionización de flama (FID) es un ejemplo de un detector que responde a la masa de la velocidad de flujo. El cromatograma que se obtiene con un detector diferencial consiste en una serie de picos, cada uno de los cuales corresponde a un componente diferente (figura 7). El área bajo el pico es proporcional a la masa del componente. . (10, 11)
mV
Figura 7. Cromatograma de un detector diferencial (11) CARACTERISTICAS PARA UN DETECTOR Los detectores cromatográficos difieren uno de otros en su principio de operación, por lo que resulta difícil compararlos; sin embargo, presentan ciertas características que son indicativas para la utilidad del detector, estas características son: 1. Selectividad. La selectividad de un detector depende del principio de operación. Un detector de conductividad térmica responde al cambio en la conductividad térmica entre la muestra y el gas de arrastre, la conductividad térmica es proporcional al peso molecular, para el componente.
14
Cromatografía 2. Sensitividad o detectabilidad. Para los detectores que responden a la concentración, la sensitividad es la respuesta del detector en milivolts por unidad de concentración de la muestra. 3. Respuesta. La respuesta de un detector es la Cantidad de una señal generada para una cantidad de muestra dada. 4. Ruido y mínima cantidad detectable. Es la señal eléctrica de salida de un detector, la cual se puede incrementar a un valor deseado por medio de una amplificación electrónica. De esta forma, el ruido eléctrico y la sensitividad del detector, se pueden agrandar como se desee. La mínima cantidad detectable es la cantidad para una respuesta del detector igual a dos veces el nivel de ruido. 5. Rango lineal. La exactitud de un análisis cuantitativo, depende de la relación lineal entre la concentración y la respuesta del detector; podemos definirla como la relación de concentración grande o pequeña con la cual el detector es lineal. . (10) Los más comunes detectores empleados en cromatografía de Gases.
Conductividad térmica TCD Ionización de Flama FID Captura de electrones ECD Fotométrico de flama FPD Termoiónico específico TSD Det. de Hall de conductividad electrolítica HECD Espectrómetro de masas MS
Detector de Conductividad Térmica (TCD). Este detector consiste en una serie de filamentos montados coaxialmente en uno o dos cilindros metálicos; los filamentos se calientan por medio de una corriente eléctrica, alcanzando una temperatura deseada. Para los detectores de un cilindro metálico, al pasar el gas de arrastre por él, la temperatura del filamento dependerá de la naturaleza del gas de arrastre y de su flujo; al introducir una sustancia diferente al gas de arrastre, la temperatura del alambre variará si la sustancia introducida tiene un valor de conductividad térmica diferente al del gas de arrastre. Para los detectores compuestos de dos cilindros metálicos, se hace pasar gas de arrastre por uno de ellos, en tanto que, por el otro, se hace pasar el gas de arrastre y la muestra, por lo que se tendrán dos temperaturas diferentes para los dos filamentos; como un cambio en la temperatura produce un cambio en la resistencia eléctrica del filamento, tendremos dos resistencias diferentes; por consiguiente, el cambio de resistencia del segundo filamento, con relación al primero, se puede registrar haciendo que los filamentos formen parte de un puente Wheatstone. Como la variación de la 15
Cromatografía resistencia es debida a la presencia de la muestra, el registro será proporcional a la cantidad de sustancia que pasa por el detector. Los detectores de conductividad térmica se denominan a veces detectores universales, ya que tienen respuesta para todas las substancias con excepción del gas de arrastre, los análisis que se realizan son generalmente no destructivos, tienen menor sensibilidad que los detectores de ionizaci6n. Su respuesta es dependiendo de la concentración de la muestra en el gas de arrastre. (13, 14) Los parámetros más importantes en la operación de un detector de conductividad térmica son: a) Corriente del filamento; b) Temperatura del bloque del detector (distinta a la temperatura del filamento en sí); c) muestra; d) Gas de arrastre La tabla 3 nos proporciona los valores de conductividad térmica para algunas moléculas (en unidades c.g.s. y a 0°C), la conductividad térmica disminuye al incrementar el peso molecular. Tabla 3 . Conductividad Térmica(10) Gas Hidrógeno Helio Metano Nitrógeno Argón Pentano Hexano
x 105 a 0°C 41.6 34.8 7.2 5.8 5.1 3.1 3.0
Peso molecular 2 4 16 28 40 72 86
Detector de Ionización de Flama (FID) El detector de ionizaci6n de flama es el detector más importante en cromatografía, su respuesta es para casi todos los compuestos orgánicos, tiene una sensitividad relativamente alta y tiene un amplio rango de respuesta lineal. El FID permite análisis rutinarios de compuestos en el rango de nanogramos (10-9g). El mecanismo de la producción de ionizaci6n en el FID consiste en la combustión de la muestra orgánica a una temperatura alta producto de una flama de H 2/aire. La flama del FID es un ejemplo clásico de una difusión de flama; el efluente de la columna se mezcla con el H2 y se propaga hacia el centro de un quemador, el aire se suministra alrededor de la periferia del quemador. El H2 y el aire se mezclan por un proceso de difusión de tal manera que, por medio de un encendido eléctrico se produce una flama cuya temperatura es del orden de 2000°C. La reacción química ocurre en la flama del FID en la conversión de H 2 y 02 a vapor de agua, cuando un compuesto orgánico se quema en la flama se generan iones positivos y negativos; los iones positivos son colectados sobre un electrodo colector produciendo una corriente eléctrica en proporción a la cantidad de materia quemada.
16
Cromatografía Esta corriente se amplifica por un electrómetro, el cual produce una señal de salida capaz de graficar.(10, 12, 13) Selectividad del FID: El detector responde a la mayoría de los compuestos con la excepción de los que se enlistan en la figura 8.
He
02
SO2
CO
SiHC13
Ar
N2
NO
C02
SiCl4
Kr
CS2
N2O
H20
SiF4
Ne
COS
NO2
HCHO
Xe
H2S
NH3
HCOOH
Figura 8. Compuestos que dan un mínimo o no dan respuesta al FID. (10) Respuesta del FID contra la velocidad de flujo La respuesta del detector depende de la selección apropiada de las velocidades de flujo para los gases que requiere para su operación (gas acarreador, hidrógeno y, aire). En general, una buena sensitividad y estabilidad se pueden obtener con una velocidad de flujo para: 30 ml/min de gas acarreador, 30 ml/min de H2 y 300 ml/min de aire. La Figura 9muestra la afinidad entre la sensitividad del detector y la velocidad de Flujo para el H2, usando un flujo de 30 ml/min de gas portador ), un flujo de 300 ml/min de aire. La mayor respuesta del detector para propano se alcanza con un flujo de 30 ml/min de H2. 0.02 Sensitividad 0.015(Cal/g) 0.01
15
20
25
30
35
40
45
Flujo de H2 (ml/min)
Figura 9. Sensitividad del FID contra el flujo de H2. (10) Como se muestra también en la Figura 10 la velocidad de flujo del aire afecta la sensitividad del detector, por lo general, una velocidad de flujo de 300 ml/min es satisfactoria para obtener una buena respuesta. Sensitividad
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Cromatografía
0
100
200
300
400
500
Flujo de aire (ml/min)
Figura 10. Sensitividad del FID contra el flujo de Aire. (10)
Detector de Captura de electrones (ECD) •Responde a compuestos que contienen grupos funcionales electronegativos •Su aplicación más común es para halógenos. También responde al antraceno, cetoesteroides, nitrobencenos y fenoles; fumaratos, oxalatos, cetonas conjugadas. (12) Una descripción de su funcionamiento se observa en la figura 11.
Figura 11. Diagrama de bloques del funcionamiento de un detector de captura de electrones
Detector Fotométrico de Flama. FPD •Este detector contiene un detector de flama, que realiza su misma función y después pasa a través de un filtro que lleva la muestra a su estado elemental. •La ventaja de este detector es que pueden hacerse análisis rápidos de compuestos de azufre y fósforo atómico. •Se emplea básicamente en la industria petroquímica. (12)
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Cromatografía
Termoiónico específico
TSD
•Trabaja mediante una señal de quimiluminiscencia, es específico para compuestos que contienen nitrógeno y fósforo. •Es ~500 veces más sensible a especies orgánicas que contienen P que el FID. •Es ~50 veces más sensible a especies orgánicas que contiene N que el FID. •Suprime la respuesta a carbón por 3 ó 4 ordenes de magnitud. •Una esfera de cerámica ( Sulfato de Rubidio) calentada 600-1000°C suministra E para la oxidación, cuya superficie actúa como catalizador para formar iones selectivos de N y P, mientras que provee condiciones pobres para la formación de iones de C. (12)
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Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) Tradicionalmente la cromatografía de líquidos (HPLC), se realiza en las técnicas de fase normal y fase reversa o fase inversa, aunque existen también técnicas como la cromatografía de partición de intercambio iónico o de apareamiento iónico y Cromatografía de afinidad. Se explican a continuación brevemente. CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN EN FASE NORMAL En este tipo de técnica, los compuestos son retenidos por la fase estacionaria sobre la cuál éstos son adsorbidos. La fuerza de interacción de la molécula con la superficie activa de la fase estacionaria determina el tiempo que tardará la molécula en atravesar la columna. Las fases estacionarias y móviles más utilizadas en cromatografía de adsorción en fase normal son las siguientes: Fase estacionaria SiO2 SiO2-(CH2)n-NH2 SiO2- (CH2)n-CH2O-CH3O
Fase móvil Hexano Heptano Metanol (10)
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN EN FASE INVERSA En la cromatografía de adsorción en fase inversa (RPC), la retención de los componentes de una mezcla se lleva a cabo, por medio de fenómenos de adsorción de éstos a la superficie de la fase estacionaria. La diferencia con la cromatografía de adsorción en fase normal, radica en las polaridades invertidas de las fases estacionaria y móviles (ver figura 12), es decir el sistema de fase reversa consiste en una fase estacionaria apolar y una fase móvil polar. La fase estacionaria está conformada por silicatos de estructura porosa sobre las cuales se encuentran unidas químicamente cadenas hidrocarbonadas. Las fases más utilizadas son las cadenas de n-octil (RP8) y noctadecil (RP18). Las fases estacionarias y móviles más comunes son: Fase estacionaria
Fase móvil
SiO2- (CH2) 17-CH3 SiO2- (CH2) 17 CH3
Metanol/Agua Acetonitrilo/Agua . (10)
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Cromatografía
En RPC el porcentaje de agua en la fase móvil tiene una enorme influencia, puesto que un aumento del 10% de agua en la fase móvil puede duplicar el factor de retención. De esta manera se puede modificar la retención de los componentes haciendo variar la polaridad de la mezcla eluyente. . (11)
Figura 12. Diferencia entre cromatografía de fase normal y de fase inversa
CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
En la cromatografía de partición líquido – líquido, la fase estacionaria es un fluido, es decir el soporte poroso de sílice se encuentra recubierto de una delgada película de disolvente. En este sistema es requerido que la fase móvil sea inmiscible con la fase estacionaria. La separación de la mezcla se debe a la diferencia de solubilidad de los compuestos a analizar en la fase móvil o estacionaria. Aquí se aplica el coeficiente de partición de NERNST. Si una sustancia se disuelve más fácilmente en la fase estacionaria, tendrá una retención mayor que una sustancia soluble en la fase móvil e insoluble en la fase estacionaria. La cromatografía de partición puede realizarse tanto en fase normal como en fase inversa. (10, 11)
21
Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO O DE APAREAMIENTO IÓNICO Esta se utiliza para separar moléculas cargadas. La separación se debe a diferencias en los equilibrios electrostáticos entre la fase estacionaria cuya carga es inversa a la de la fase móvil. La fase estacionaria consiste en una resina o un sólido generalmente poroso cuya superficie está recubierta de grupos ionizados o ionizables. Los iones que aseguran la electroneutralidad de la estructura son móviles e intercambiables con los de la fase móvil en contacto con el intercambiador. Los intercambiadores más utilizados son resinas poliméricas, las cuales normalmente son geles y sílices intercambiadores de iones. La retención de un compuesto de carga opuesta dependerá de la fuerza de dicha carga. El apareamiento iónico es una asociación entre el ión problema y un contra-ión. (agente de apareamiento de carga opuesta añadido a la fase móvil). Ion y contra-ion forman un complejo neutro hidrófobo, el cual es adsorbido sobre la resina. La retención se efectúa por medio de un mecanismo de intercambio iónico y de adsorción. (10, 11) CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD La cromatografía de afinidad es una variante de la cromatografía de adsorción y se realiza preferentemente para purificar, aislar, concentrar compuestos y para el análisis de moléculas bioquímicamente activas. El sistema de fases está compuesto de una fase estacionaria modificada químicamente y de una fase móvil acuosa. Este fenómeno cromatográfico se apoya en el equilibrio de intercambio entre los ligandos de la fase estacionaria y la biomolécula complementaria. (10, 11)
¿Cuáles son las partes de un cromatógrafo de Líquidos?
Figura 16. Esquema de un cromatógrafo de líquidos.
Figura 13 . esquema de un cromatógrafo de líquidos 22
Cromatografía
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Reservorio de disolventes (fase móvil) Bomba Inyector y Filtros Luv Columna (fase estacionaria) Detector Registrador
Disolventes para cromatografía de líquidos Los disolventes empleados para la cromatografía de líquidos deben reunir ciertas características, la calidad de pureza debe ser grado HPLC, ser transparentes al detector usualmente al UV, la viscosidad debe ser mínima, limpios en el análisis al IR, y la miscibilidad a la fase estacionaria es de considerarse si no queremos tapar la columna. Además deben considerarse los siguientes parámetros ya que todos estos influyen en la separación cromotográfica y en el caso de la toxicidad, es importante considerar la cantidad de disolventes con que se trabaja y la cantidad de residuos que se generaran: (10, 11)
1) Estabilidad (se debe asegurar que el sistema cromatográfico sea lo más estable posible para hacerlo más repetible y reproducible) 2) Polaridad (es uno de los factores que influyen en la separación cromatográfica. 3) Inflamabilidad. (por la seguridad en el trabajo) 4) Efectos de mezcla (que la solubilidad de todos los analitos sea optima en el disolvente y que la mezcla sea estable, no toxica) 5) Compatibilidad con la columna empleada
Columnas para cromatografía de líquidos La Columna Es el espacio físico donde se produce la separación físicamente debe reunir ciertas características básicas: 1) resistente: debe resistir altas presiones 2)Químicamente estable.
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Cromatografía Usualmente las columnas están empacadas con una base de sílica o de un polímero poroso con las características listadas en la Tabla 4: Tabla 4. Características de soportes para columnas de HPLC Empaque Base sílica pH de trabajo De 1 a 7 Característica + comunes, s + económicas, mejor resolución
Base polimérica De 1 a 10 + delicadas, + caras, - resolución mejor estabilidad a pH básicos. (10, 11)
Dado que los análisis en HPLC son más comunes en la industria farmacéutica, química y alimentária, las columnas más usadas son las de tipo analítico. Con dimensiones aproximada a 25cm de longitud por 4.6 cm de diámetro interno, son columnas empacadas con partículas esféricas de 5 a 10 m, en años recientes el diámetro interno ha disminuido,, el empaque de las columnas se elabora más esférico y pequeño, pero deben emplearse precolumnas de para asegurar la vida media de las columnas y eficientar la repetibilidad y reproducibilidad delos resultados. El empaque de las columnas es usualmente un tipo de silica gel, la cual contiene grupos silanol (Si-O-H) estos grupos son muy polares por lo que son sustituidos por ligandos C18 ó C8 típicamente. (11)
Figura 14. Sílica gel muestra el grupo silanol y una sustitución química por un grupo no polar. (11)
Alguna de las fases con las que son sustituidos estos silanoles son listadas en la tabla 5:
24
Cromatografía
Tabla 5. Fases para cromatografía de líquidos. (11) Amino, NH3
Octilo C8
R
R O (CH 2)3 NH 2 Si Si O (CH 2)5CH 3 R R Butilo, C4 R
O
O
(CH 2)7CH 3
Si R
ODS C18 O
(CH 2)3CH 3
Si
R
R Si
(CH 2)17CH 3 R
R
Ciano, CN, Nitrilo R O
Si
Fenilo O
(CH 2)3CN
R Si
(CH 2)3 R
R
Hexilo C6
SAX
CH 3
R O
Si
(CH 2)3
+
N
CH 3CL-
R CH 3
Metilo, C1 O
Si
CH3
SCX O
CH3
R - + (CH 2)3 SO 3H
Si R
CH3
(10)
Elección de la columna. Al analizar una muestra, después de resolver el problema de la extracción de los analitos elegidos de la matriz compleja que representa la muestra como tal, el siguiente problema es la elección de la columna, esto puede resolverse empleando la siguiente tabla además hay métodos desarrollados por químicos analíticos especializados que pueden consultarse en el área de aplicaciones de los catálogos de la EPA, ATSDR, o de los proveedores de los equipos.
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Cromatografía
Tabla 6. Guía para selección de fase y tipo de cromatografía. (10) Peso molecular uma
Solubilidad
Carácter
Tipo de cromatografía
Fase estacionaria de la columna
No iónico
Fase reversa injertada
RP8, RP18, CN, RP8E, RP18E Poliespher CHPB CHCA, CHNA
Soluble en agua Iónico
Soluble en THF PM<2000
Muestra problema
Soluble en disolventes orgánicos
Soluble en Hexano Soluble en metanol y metanol/agua
Intercambio de ligandos, carbohidratos Fase reversa, control RP8, RP18, CN, de iónes RP8E, RP18E Fase reversa, Poliespher C18 polimérica Fase reversa RP selectiva B, RP8, apareamiento iónico RP18 Exclusión iónica Poliespher OAKC, Ácidos orgánicos OAHY, AAAC Cromatografía iónica, ICAN anions mineral, ácidos, ICCA cationes aminas Permeación en gel, Lichrogel PSI, PS4, moléculas pequeñas PS20 Fase normal, adsorción Fase normal injertada
CN, Dioles, NH2
Fase inversa injertada
CN, NH2, C8, C18
Fase inversa injertada Soluble en agua PM>2000
Permeación en gel medio acuoso Intercambio iónico
Soluble en disolventes orgánicos
Interacción hidrofoba Permeación en gel
Si 60, Si 100
RP8, RP18, 60 selectiva B, 100, 300, RP8 y RP8E Lichrospher diol 100ª, 300ª, 1000ª, 4000A Polyspher PEI Polyspher CM2 Polyspher butyl Serie Lichrogel
Detectores más comunes para LC En la cromatografía de líquidos de alta resolución no existe un detector universal como tal, casi siempre es necesario seleccionar un detector con base en el problema que se quiere resolver, eventualmente se requiere de dos o más detectores esto se debe a que la fase móvil es un líquido de tal forma que los detectores están limitados en sensibilidad y selectividad. Los detectores más comunes en HPLC son los siguientes:
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Cromatografía
Detector Sensibilidad Índice de refracción UV/VIS Fluorescencia Infrarrojo Electroquímico Masas (acoplado)
Tipo Universal Selectivo Selectivo Selectivo Selectivo Universal
Selectividad
Ninguna 10g/mL Dobles enlaces y aromáticos 1ng Poliaromáticos 10pg/mL Moléculas con 0 5 a 10ng/mL Especies oxidables Iónes característicos ppb (10, 11)
Detectores Fotométricos El detector más usado para HPLC es el ultravioleta, su costo de operación es relativamente bajo, tiene alta sensibilidad e insensibilidad a cambios de temperatura, velocidad de flujo y composición de la fase móvil. Entre los compuesto que absorben en la región de ultravioleta, se incluyen todas las que tienen dobles enlaces y los compuestos con electrones no enlazados y no compartidos como olefinas, y todos los aromáticos, los que tienen un grupo carbonilo, tiocarbonilo, nitroso y azo. Para emplear este detector el disolvente de la fase móvil debe no interferir con absorbancia en esta región del espectro. Detector de Fluorescencia Básicamente este detector mide la luz emitida, mas que la absorbida, ciertas moléculas reemiten la luz que absorben (luz UV) en forma de baja energía y altas longitudes de onda, mismas que pueden ser utilizadas como una medida de la concentración del analito en cuestión. Es muy usado para determinar pureza ya que muchos Hidrocarburos aromáticos policíclicos (HPA´s) son fluorescentes. La ventaja es que solo se genera una señal cuando un compuesto fluorescente llega al detector. La significativa sensitividad de este detector a fomentado el desarrollo de pre-columnas y pos-columnas que realizan una derivación de compuesto que no son fluorescentes en compuestos que si son fluorescentes para que el llegar al detector genere una señal y aumentar la capacidad de la técnica. Detector infrarrojo Gracias a la presencia de diversos grupos funcionales en los compuestos analizados el detector de infrarrojo es muy útil. Sin embargo solo pocos disolventes son transparentes en la porción más útil de esta región del espectro, algunos de estos son tetracloro metano (CCl4), triclorometano (CHCl3), sulfuro de carbono (CS2), mismos que son infrecuentes en las separaciones cromatográficas.
27
Cromatografía
Detector electroquímico Los electrodos empleados en este tipo de detectores suelen contaminarse frecuentemente, por lo que se desarrollaron sistemas de autolimpieza automáticos. Este tipo de detector es sensible a compuestos que pueden oxidarse o reducirse rápidamente como fenoles, mercaptanos, aminas, compuestos nitro aromáticos, halogenados, aldehídos, cetonas y especialmente benzidinas. La elección correcta del potencial aplicado a los electrodos realza los límites de selectividad y sensibilidad del análisis. Detector de masas ( acoplamiento de cromatografía de líquidos con espectrometría de masas). Con la espectrometría de masas, la química analítica tuvo un nuevo auge, ya que es una de las herramientas más poderosas para la identificación de compuestos, los espectrómetros de masas son relativamente fáciles de acoplar a los cromatógrafos de gases, él acople a un cromatógrafo de líquidos requiere de una interfase especializada. Existen las interfases de rayo particulado muy usadas en análisis estructurales y la interfase de termospray (para análisis cuantitativos). Con un rayo de partículas se pueden generar espectros de masas de compuestos conocidos y desconocidos así como por ionización química. (10, 11)
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Cromatografía TERMINOS Y CONCEPTOS BASICOS DE LA CROMATOGRAFIA.
Figura 15. Cromatograma para un pico resuelto (10) Tiempo de retención tr = Tiempo de retención absoluto (min.) tm = Tiempo muerto o tiempo de retención de un componente retenido (min.) t’r = Tiempo de retención corregido o relativo (min.) t’r = tr – tm wb = Ancho del pico medido desde la base (cm) wh = Ancho del pico medido a la mitad de la altura (cm) h = Altura total del pico (cm) L = Longitud de la columna (cm) N = Número de platos teóricos t N 16 r wb
2
t 5.54 r wh
2
Plato teórico HETP o H = Altura equivalente de plato teórico H HEPT
u
L tm
= Velocidad lineal promedio (cm/s) u
L tm
= Retención relativa de dos picos adyacentes ó selectividad
t r 2
t r1
R = Resolución de dos picos adyacentes
29
Cromatografía t t R 2 r 2 r1 wb1 wb 2
K = Relación ó coeficiente de partición
k
2d w1 w2
t r t r t m tm tm
Ecuación de Purnell N = Número de platos teóricos requeridos N
Lr 1 16 R 2 2 k HEPT 1 k
2
Lr = Longitud requerida (1, 2, 3, 4, 10, 11)
DEFINICIONES Línea base. Es la línea dibujada por el registrador en ausencia de muestra. Punto de inyección. Es el momento en el que se introduce la muestra al sistema cromatográfico. Tiempo muerto (tm). Tiempo que tarda un compuesto que no es retenido por la columna, desde el punto de inyección hasta su paso por el detector. Tiempo de retención (tr). Tiempo que transcurre desde la inyección de la muestra, hasta el punto máximo del pico correspondiente a determinado compuesto de la mezcla. Tiempo de retención corregido (t’r). Equivale al tiempo de retención., menos el tiempo muerto del compuesto que no es retenido por la columna. Altura del pico (h). Es la distancia perpendicular, desde la línea base a la máxima deflecci6n del pico. Amplitud de la base (wb). Es la distancia entre las intersecciones de las tangentes a los puntos de inflexión con la línea base. Amplitud a la mitad de la altura (w h). Distancia entre las tangentes del pico a la mitad de su altura. La resolución de los picos cromatográficos está relacionada con 2 factores: la eficiencia de la columna y la eficiencia del solvente. Adsorbente. Fase estacionaria para cromatografía gas – sólido.
30
Cromatografía Derivación. Reacción química que se hace con la muestra con reactivos específicos, para dar termo estabilización y volatilidad, facilitando la separación y la detección de algunos compuestos. Eficiencia. Grado de ensanchamiento del pico, separación efectiva de picos adyacentes. Se expresa como número de platos teóricos (n) requeridos para tener una separación aceptable y también como altura equivalente de plato teórico (HETP). Integración. Medición del área bajo la curva (pico) en un cromatograma. Relación de Partición (k). - Es la relación existente entre la cantidad de muestra en la fase móvil. Retención relativa de dos picos adyacentes (). Proporcionalidad de las relaciones de particulación de os componentes de una muestra. También conocida como selectividad. Salinalización. En la sustitución de los hidrógenos activos en una molécula orgánica con grupos trimetilsilil (TMS) para incrementar la volatilidad y su estabilidad térmica. Se utiliza también para hacer inertes los sitios activos de algunos solventes Ecuación de Van Deemter*. Se refiere a la eficiencia relacionada con el flujo de fase móvil, expresándola como: H = A + B /u + C·u donde: A. Expresa la contribución de la difusión de Eddy al ancho del pico, esto es independiente del flujo del gas y es proporcional al diámetro promedio de la partícula y a las irregularidades del empaque. B. Expresa la contribución a la difusión molecular en el ancho del pico, la magnitud del termino es inversamente proporcional al flujo y directamente proporcional a las tortuosidades de los canales del sistema. C. Expresa la contribución a la resistencia en la transferencia de masa, en el ancho del pico y es directamente proporcional al flujo y al cuadrado del espesor de la película de la fase líquida e inversamente proporcional a la difusión en la fase líquida. (1, 2, 3, 4, 10, 11)
.
31
Cromatografía
CROMATOGRAFÍA DE GASES Y LÍQUIDOS MÉTODOS DE CUANTIFICACIÓN
Análisis cualitativo Se basa en la diferencia de velocidades de migración de los componentes de una mezcla entre dos fases; una estacionaria y una móvil (gas), de tal manera que cada componente es selectivamente retenido por la fase estacionaria y eluye a un cierto tiempo (tiempo de retención), dependiendo del programa empleado para su análisis. Análisis cuantitativo El auge creciente de la cromatografía durante las últimas cuatro décadas se debe en parte a su rapidez, simplicidad, relativamente bajo costo, y a su gran aplicabilidad como herramienta de separación. Su uso se ha extendido tanto porque puede también proporcionar información cuantitativa acerca de las especies separadas. Por lo tanto debemos tener en cuenta los aspectos cuantitativos aplicados a todos los tipos de cromatografía. La cromatografía en columna cuantitativa se basa en la comparación de la altura, o del área, del pico del analito con la de uno o más estándares. En cromatografía plana, el área cubierta por las especies separadas sirve como parámetro analítico. Si se controlan las condiciones adecuadamente, esos parámetros varían linealmente con la concentración. Existen diversos métodos de cuantificación en cromatografía los cuales se describen brevemente a continuación. Método del % de Área -
Todos los componentes deben ser registrados. El factor respuesta para todos es el mismo. % de área.
32
Cromatografía
%A
El porcentaje de área se obtiene mediante la fórmula
Ai n
A
100
i
1
Donde A representa el área bajo la curva de cada uno de los componentes i *PICO No. 1 2 3 4 TOTAL *Datos de la muestra
Tr (min.) 2.71 3.48 4.23 5.78
AREA 85,000 72,000 43,200 25,305 225,505
% DE AREA 37.6931 31.9283 19.1570 11.2215 100
Método del % de Normalización. -
Todos los componentes deben ser registrados. El factor respuesta para cada componente de la muestra es diferente. Se emplea un estándar de cada uno de los componentes de la muestra para determinar el factor de respuesta.
*PICO No. Tr (min.) AREA % DE AREA 1 2.71 85,000 37.6931 2 3.48 72,000 31.9283 3 4.23 43,200 19.1570 4 5.78 25,305 11.2215 TOTAL 225,505 100 *Datos de la muestra En este caso se conoce la identidad de todos los componentes mediante su tiempo de retención al correr estándares con las mismas condiciones cromatográficas y la misma concentración por lo que se puede obtener una tabla como la siguiente:
Datos de la muestra estándar *PICO No. 1 2 (ref) 3 4
tr (min.) 2.71 3.48 4.23 5.78
AREA 50.000 70.000 80.000 65.000
CONC (mg) 15 15 15 15
Para homogenizar la respuesta de cada uno de los componentes de la mezcla se debe calcular el factor de respuesta de cada uno de los analitos que aparecen en la muestra. Este factor será multiplicado por el área que corresponde a su analito con lo que se puede obtener una respuesta corregida matemáticamente similar en todos los casos.
¿Cómo se calcula el factor de respuesta? . Factor de Respuesta (FR) FRi = Ci x Ai
A ref C ref
33
ref = estándar de referencia. i = Analito C = Concentración A = Area
Cromatografía
FR 1= __15 x 50.000
70.000 = 1.4 15
FR1= 1.4
FR 2= __15 x 70.000
70.000 = 1.0 15
FR2= 1.0
FR 3= __15 x 80.000
70.000 =0.875 15
FR3= 0.875
FR 4= __15 x 65.000
70.000 = 1.076 15
FR4= 1.076
Ya obtenido el factor de respuesta se aplica la siguiente formula para obtener el porciento de normalización (% N). %N =
Ai x FR i ni=1 Ai x FR i
x
100
CALCULOS % N 1 = _______________(85.000) (1.4)_____________ (85.000) (1.4) + (72.000) (1) + (43.200) (0.875) + (23.305) (1.076) % N 1 = _________119.000_______ 119,000+72,000+37,800+ 25,076.18
% N1 = 46.8732
% N2 = (72.000) (1) 253,876.18
%N2 = 28.3602
%N3 = (43,200) (0.875) 253,876.18
x 100
% N 3= 14.8891
x 100
%N4 = 9.8773 %N4 = (23,305) (1.076) 253,876.18
X 100 %N T = 99.9998
Método del Estándar Externo. Se debe inyectar primero la mezcla en el cromatógrafo con cantidades conocidas de cada uno de sus componentes de interés y determinar el factor de respuesta de cada componente. La relación de la cantidad de estándar con la respuesta (usualmente el área del pico) es conocida como factor de calibración para ese componente particular.
34
Cromatografía Cuando se analiza una mezcla de concentración desconocida, la cantidad de cada componente es obtenida multiplicando - El factor de respuesta para todos es calculado. - Se inyecta siempre la misma cantidad. Hacer cromatograma problema y las áreas halladas dividirlas por el factor de respuesta. Calibración y Patrones El método más sencillo para el análisis cromatográfico cuantitativo implica la preparación de una serie de disoluciones de patrón de composición a la de la muestra. A continuación se obtienen los cromatogramas de los patrones y se representan las alturas o áreas de pico en función de la concentración. La representación de los datos debería originar una línea recta que pasara por el origen de coordenadas; los análisis se basan en esta gráfica. Para una mayor exactitud es necesario una estandarización frecuente. Datos de la muestra. i=1 *PICO No. 1 2 3 4 TOTAL *Datos de la muestra
tr (min.) 2.71 3.48 4.23 5.78
AREA 85,000 72,000 43,200 25,305 225,505
% DE AREA 37.6931 31.9283 19.1570 11.2215 100
AREA 50.000 70.000 80.000 65.000
CONC (mg) 15 15 15 15
Datos de la muestra estándar *PICO No. 1 2 (ref) 3 4
tr (min.) 2.71 3.48 4.23 5.78
¿Cómo obtener el factor de calibración?. Factor de Calibración (FC)
FC i
C ci Aci
= 3.000x 10 -4
FC1 = 3.000x 10 –4
FC2 = 15 mg = 2.142 x10 -4 70,000
FC2 = 2.142 x10 -4
FC1 = 15 mg 50,000
35
Cromatografía FC3 = 15mg 80,000
= 1.875 x 10-4
FC4 = 15 mg 65,000
= 2.307 x 10-4
FC3 = 1.875 x 10-4
FC4 = 2.307 x 10-4
Al conocer Fci se puede aplicar la formula siguiente para obtener la cantidad del componente
(cx) Cxi = ( A Ci ) ( F Ci )
CALCULOS C1= (85,000) (3.000x 10 -4) = 25.5 mg
C1= 25.5 mg
C2 = (72,000) (2.142 x10 -4) = 15.4 mg
C2= 15.4 mg
C3 = (43,200) (1.875 x 10-4) = 8.1 mg
C3= 8.1 mg
C4 = ( 25,305) (2.307 x 10-4)= 5.8 mg
C4= 5.8 mg
Al utilizar este método, la fuente más importante de error en los análisis es normalmente la incertidumbre en el volumen de la muestra; ocasionalmente la velocidad de inyección de la muestra es también un factor a considerar. A menudo, las muestras son pequeñas (aproximadamente 1 microlitro) y la incertidumbre asociada con la inyección de un volumen reproducible de ese tamaño con una microjeringa puede significar un cierto porcentaje relativo, tal vez de varias unidades.
EXACTITUD DEL VOLUMEN INYECTADO (FV)
FV
Vim V IS
Vim = Volumen inyectado de muestra Vis = Volumen inyectado de estándar. Entonces: V) Cxi ( ACIFV)( FC I
36
Cromatografía El método del estándar interno. En cromatografía cuantitativa la mayor precisión se consigue por el uso de patrones internos debido a que se evitan las incertidumbres que se introducen en la inyección de la muestra. En este procedimiento, el estándar interno elegido debe reunir las siguientes características: -
Proporcionar un pico bien resuelto Aparecer en el cromatograma en la mitad del mismo. No debe encontrarse en la muestra Su composición debe ser similar a la de los componentes de la mezcla En caso de haber muchos picos en el cromatograma se pueden emplear más de 2 estándares internos.
1-. Se realiza un cromatograma patrón con todas las sustancias y el estándar interno con cantidades conocidas. Se calcula el factor de respuesta de cada uno de los analitos con respecto al estándar interno. 2-. Realizar el cromatograma problema con una cantidad de estándar interno conocida. (hacer 3 inyecciones y promediar) 3.- En caso de que el sistema no sea conocido se elabora una curva de calibración incluyendo al estándar interno, con el fin de evaluar la linearidad del sistema. 4.- Conociendo: área del analito (Ai), l área del estándar interno (Aref), y el factor de repuesta de ambos (FRref =1), así como la concentración del estándar interno realizar el siguiente cálculo para conocer la concentración de i.
Ci
C
ref
Ai Fri Aref
(1, 2, 3, 4, 7, 10, 11, 13, 14)
37
Cromatografía
Referencias
1. Cailleux A., Turcant A., Premel-Cabic, Allain P., Identification and Quantitation of Neutral and Basic Drugs in Blood by Gas Chromatography and Mass Spectrometry. Journal of Chromatographic Science, Vol. 19 pp- 163-176. May 1981. 2. Commission on Analytical Nomenclature. Recommendations on nomenclature for chromatography. Pure Appl. Chem. Vol 37 pp. 445-53 (1974). 3. Eurachem group. The Fitness for Prurpose of Analytical Methods. A Laboratory Gude to Method Validation and Related Topics. First Internet Version December 1998. http://www.eurachem.ul.pt/guides/valid.pdf 4. Citac (The cooperation on International Traceability in Analytical Chemistry) and Eurachem groups (A Focus for Analytical Chemistry in Europe). Guide to Quality un Analytical Chemistry. An Aid to Accreditation. Edition 2002 5. Jenennings Walter, Mehran Mehrzad F. Sample Injection in Gas Chromatography. Journal of Chromatographic Science, Vol. pp. 24 34-39 January 1986. 6. Jordan J.H., Haynes H.I. Hall G.A. A simple Method for Preparing Gas-Liquid Calibration Blends. Technical Note. Journal of Chromatographic Science, Vol. 24 pp. 462-463 January 1986. 7. Smith Roger and Marton Aurél. Classification and characterization of liquid chromatography stationary phases. Part I: Descriptive Terminology. IUPAC Recommendations 1997. Pure Appl. Chem, Vol 69 No. 7 pp. 1475-1480. 1997. 8. Ottenstein Daniel M. The Cromatographic Support in Gas Chromatography. Journal of Chromatographic Science, Vol. 11 pp.136- 144 January 1986. 9. Thomas Q.V., Stork J.R, Lammrrt S.L. The Cromatographic and GC/MS Analysis of Organic Priority Pollulants in Water. Journal of Chromatographic Science, Vol. 18 pp. 583-593 November 1980. 10. Vazquez, Mora, Basterrechea. Diplomado en Instrumentación analítica. Segunda promoción. Facultad de Química. Parte I y II.1998. 11. Waters. Seminario de Selección de columnas. 2002. 12. Wenzel B.E. Gas Chromatographic Equipment –V. Journal of Chromatographic Science, Vol. 28 pp. 133-153. March 1990. 13. Zweig and J. Sherma. CRC Handbook of Chromatography, Vol. 1 y 2 14. Manual Práctico de Cromatografía de Gases. Perkin Elmer.1990.
38
Cromatografía
Índice de Figuras Figura
Pagina
1
Esquema De Un Cromatógrafo De Gases
4
2
Plano de Van Deempter para la selección de la velocidad de flujo óptimo del gas de arrastre (12) Diferencia entre columna empacada y capilar. Retención relativa para 2 compuestos Medidas para obtener la resolución de dos picos Cromatograma integral Cromatograma de un detector diferencial Compuestos que dan un mínimo o no dan respuesta al FID Sensitividad del FID contra el flujo de H2 Sensitividad del FID contra el flujo de Aire Diagrama de bloques del funcionamiento de un detector de captura de electrones Diferencia entre cromatografía de fase normal y de fase inversa Esquema de un cromatógrafo de Líquidos. Sílica gel mestra el grupo silanol y una sustitución química por un grupo no polar Romatograma para un pico resuelto
5
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
7 11 12 13 14 17 17 17 18 21 22 24 29
Índice de tablas Tabla 1 2 3 4 5 6
Fases liquidas comunes para columnas cromatograficas Fases liquidas comunes usadas en cromatografía de gases Conductividad Térmica Características de soportes para columnas de HPLC Fases para cromatografía de liquidos Guia para selección de fase y tipo de cromatografia
39
Pagina 9 9 16 24 25 26