Cromatografia de inalta performanta Introducere în optimizarea metodei HPLC Cromatografia este o metodă fizico-chimică modernă, considerată nu doar o metodă de separare; în majoritatea variantelor ea prezintă o metodă analitică hibridă, care îmbină separarea cu identificarea ulterioară şi dozarea componenţilor depistaţi în amestecurile complexe. Conform aprecierii experţilor, cromatografia se consideră una din cele 20 descoperiri importante ale secolului XX, care au contribuit cel mai mult la reformarea ştiinţei, iar prin prisma ei se determină nivelul de dezvoltare al industriei şi tehnicii, civilizaţiei în întregime. Totodată, prezintă o ramură a analizei instrumentale cu un larg spectru aplicativ în majoritatea domeniilor şi nici o metodă analitică nu concurează cu cea cromatografică, la momentul dat, după aplicarea universală şi eficacitatea separării celor mai compuse amestecuri. Primele descrieri ale procesului de separare sunt întâlnite în lucrările chimistului german Runge de prin anul 1850 şi ale altor savanţi, dar în fine ei n-au reuşit să formeze o disciplină ştiinţifică . Fondatorul metodei cromatografice se consideră Mihail Ţvet, botanic şi chimist rus, dotat cu anul 1903, care a efectuat primele încercări de separare în domeniul coloranţilor vegetali pe o coloană de oxid de aluminiu. În multe surse literare se întâlneşte anul 1906, unde pentru prima dată în articolul autorului M. Ţvet apare termenul “cromatografie”, în care se dezvăluie conceptul “experienţă cromatografică” . Etapă importantă în cercetare, în 1938, a devenit descrierea cromatografiei pe strat subţire de savanţii N. A. Izmailov şi M. S. Shraiber, metodă care astăzi are o răspândire universală, datorită unui cost redus, a vitezei mari de eluare şi a rezoluţiei lejere. Bazându-se pe fenomenul deja cunoscut, descris în lucrările lui M. Ţvet, şi aplicându-l în cazul aminoacizilor, în 1941 savanţii englezi A. D. Martin şi R. Synge au elaborat metoda cromatografică de repartiţie, pentru care în 1952 au fost decernaţi cu premiul Nobel. În timpul cercetărilor, aceiaşi savanţi şi colegii lor Consden, Gordon au depistat că în afară de silicagel, apa este reţinută şi de celuloză. Astfel în 1944 a fost elaborată o nouă metodă cromatografică − pe hârtie, utilizându-se ca sorbent al fazei staţionare hârtia de filtru. Un mare succes al savantului Martin în colaborare cu E. T. James a urmat de asemenea în anul 1952 cu punerea bazelor cromatografiei de gaze (GC), apoi în 1959 savantul Golay a introdus noţiunea cromatografia de gaze pe coloane capilare. Metoda dată este larg răspândită şi până în prezent . În timp cromatografia de lichide s-a dezvoltat datorită perfecţionării detectorilor, pompelor şi ca rezultat s-au construit cromatografe de lichide de performanţă înaltă (HPLC). Cu apariţia metodei HPLC (an. 1968) autorii Giddings şi Kirkland au propus utilizarea unor faze staţionare cu particule foarte mici, cu trecerea fazei mobile sub presiune. Un aport colosal la dezvoltarea cromatografiei au depus şi savanţii A. V. Kiseliov, A. A. Jucovski, C. I. Sacadînscki, destinşi cu medalia internaţională M. Ţvet “Pentru descoperirile distinse în domeniul cromatografiei” şi mulţi alţi specialişti în acest domeniu. Cromatografia ca metodă de separare se încadrează în grupul de procedee bazate pe migrarea diferenţiată a componenţilor din amestecul studiat dintre două faze, adică migrare diferenţiată a diferitor molecule. Ea cercetează starea termodinamică a sistemelor dintre două faze, studiază natura interacţiunii
1
intramoleculare, cinetica proceselor interne şi schimbului de masă între faze, proceselor formatoare de complecşi, asociaţii şi multe altele. Datorită complexităţii proceselor de separare, subînţelegerii deosebit de multilaterale a termenului “cromatografie” este dificilă formularea unei definiţii generale. Însă se poate spune că toate tehnicile cromatografice au ca elemente comune o “fază staţionară” şi o “fază mobilă”, iar componenţii amestecului de analizat sunt antrenaţi în lungul coloanei de un flux de fază mobilă (gazoase sau lichide), cu viteze diferite, ceea ce constituie principiul fundamental al separării. Pe de altă parte, la baza majorităţii metodelor cromatografice de separare stau patru procese fundamentale: adsorbţia pe suporturi solide, repartiţia între faza staţionară şi aceea mobilă, schimbul ionic şi de excluziune. Astfel, principiul separării poate fi diferit, dar etapele analizei cromatografice sunt aceleaşi. Luând în consideraţie cele expuse, totodată şi numeroşii factori implicaţi în separare, în asigurarea selectivităţii şi rezoluţiei, precum şi caracteristicile detectorilor utilizaţi, respectiv de sensibilitatea lor, reproductibilitatea proceselor de separare, detecţie şi dozare, este greu de dat o clasificare atotcuprinzătoare. De aceea cromatografia se poate clasifica: -având în vedere natura fazelor staţionară şi a celei mobile (în fază gazoasă, lichidă şi fază supercritică); -în funcţie de procesele fizico-chimice care stau la baza separării (cromatografie de adsorbţie, de repartiţie, de schimb ionic, de excluziune, cu formare de perechi de ioni, de afinitate); -în funcţie de modalitatea de imobilizare a fazei staţionare (cromatografie pe coloană şi planară); -în funcţie de starea fizică a celor două faze (cromatografie gaz-lichid, gaz-solid, lichid-lichid, lichid-solid) Poziţia privilegiată a cromatografiei se datorează faptului că la baza migrării se găseşte repetarea echilibrului de repartiţie dintre două faze (staţionară şi mobilă), care pentru un singur proces se poate realiza etrem de rapid, de repetate ori într-un interval de timp scurt Cromatografia lichidă de performanţă înaltă cu fază inversă. În anii 70-80 ai secolului XX s-a accelerat dezvoltarea unei noi direcţii a cromatografiei –HPLC cu fază inversă. Sensibilitatea înaltă, precizia şi selectivitatea metodei i-a dat o prioritate considerabilă în studiu farmacocinetic pentru un număr mare de substanţe medicamentoase, iar rapiditatea analizei permite efectuarea în instituţiile medicale atât a investigărilor clinice imense cât şi a analizelor expres şi eficace în cazul diagnosticării urgente sau dozării preparatului. O altă cauză este şi preponderenţa metodei HPLC faţă de alte metode fizicochimice, inclusiv şi faţă de unele metode cromatografice, şi anume: • domeniul de aplicare s-a majorat cu dozarea compuşilor volatili, uşor oxidabili, termolabili fără aplicarea metodelor speciale; • metoda HPLC cu fază inversă permite analiza mostrelor apoase, simplificând prepararea probelor de material biologic şi reducând timpul unei analize; • majoritatea variantelor de detecţie în metoda HPLC nu distrug probele. Astfel, în caz de necesitate, permite cooperarea cromatografiei cu scop analitic (separarea, detecţia, determinarea cantitativă) şi cea cu scop preparativ, totodată este posibilă colectarea fracţiilor separate a substanţelor analizate pentru identificarea ulterioară şi/sau utilizarea altor metode fizico-chimice de analiză;
2
• în majoritatea cazurilor se exclude necesitatea de a efectua derivatizarea; • metoda HPLC poate fi automatizată complet; • solvenţii organici (acetonitrilul, metanolul, parţial tetrahidrofuranul) şi apa utilizaţi în faza mobilă permit detecţia în UV-VIS într-un diapazon larg. Totodată aceşti solvenţi sau amestecurile lor dizolvă practic toate grupele de compuşi aflaţi în organismul uman, în materialul biologic şi utilizaţi ca preparate medicamentoase ş. a.; • sorbenţii utilizaţi în HPLC cu fază inversă se echilibrează foarte repede cu noii solvenţi, ce permit de a realiza uşor cromatografia în gradient şi a trece de la o metodă la alta; • sorbenţii le acordă posibilitatea de a utiliza solvenţi cu proprietăţi într-un interval mai larg, la fel de a adăuga diferite tipuri de modificatori (săruri, acizi, baze, reactivi perechi de ioni, ş. a.). Metoda dată ca şi orice metodă analitică posedă şi unele dezavantaje: • metodele de detecţie existente, uneori, nu posedă o suficientă sensibilitate necesară pentru determinarea concentraţiile joase a analiţilor, îndeosebi în analiza farmacocinetică; • metoda HPLC necesită utilizarea cantităţilor mari de solvenţi organici de o puritate înaltă, care în majoritate sunt destul de costisitori şi toxici, în plus regenerarea acestora este dificilă; • utilajul cromatografic, piesele de schimb, coloanele cromatografice, accesorii, aparatura specifică pentru umplerea coloanelor cu sorbenţi sunt destul de costisitori, totodată complicaţi în deservire; • caracteristica retenţiei şi selectivităţii sorbenţilor cu faze inverse se schimbă nu numai trecând de la o firmă la alta, dar şi de la serie la serie a unui producător Metoda HPLC presupune separarea componenţilor de analizat în fluxul fazei mobile (eluent, ce-i caracterizat de compoziţie, forţa ionică, pH şi alţi parametri) în baza diferitor interacţiuni cu sorbenţii. Complicarea mecanismului de separare şi majorarea numărului de parametri variabili ai procesului în îmbinare cu eficacitatea mai redusă a coloanei cromatografice, decât în GC, duc la ideea că alegerea şi optimizarea condiţiilor de separare în metoda HPLC este mult mai dificilă, iar rolul experienţei şi intuiţiei specialistului, în cazul dat, este mai importantă. Optimizarea - este căutarea condiţiilor optime la efectuarea analizelor. În dependenţă de situaţie, optimizarea poate fi îndreptată la îmbunătăţirea selectivităţii, sensibilităţii şi altor parametri, ce determină veridicitatea rezultatelor, precum şi îmbunătăţirea raportului cost/beneficiu, reducerea timpului de analiză, micşorarea numărului de operaţii manuale, dar fără pierderi de informaţie. Ea se referă la toate etapele de analiză. Optim – este mai bine zis o categorie filozofică. În cromatografie, precum şi în alte domenii persistă un permanent compromis între calitatea rezultatului finit şi cheltuielile la realizarea lor (de materiale, de timp, de resurse umane). În ce priveşte cheltuielile pentru o analiză trebuie adunate neapărat şi cele la elaborare. În procesul optimizării ele cresc monoton, atunci când eficacitatea metodei se apropie asimptotic de o oarecare valoare maximă – limita fizică, determinată printr-un nivel modern de dezvoltare a tehnologiei analitice, şi într-un moment oarecare “datorită” optimizării excesive metoda devine nerentabilă. Astfel, în rezolvarea sarcinii concrete este destul de important determinarea preventivă a cheltuielilor posibile la elaborare şi aprecierea profunzimii în cercetare.
3
Metoda HPLC ca metodă analitică din punct de vedere al optimizării are câteva particularităţi importante: Asupra rezultatului final în cromatografia lichidă influenţează un număr enorm de diverşi factori, făcând metoda, pe de o parte destul de flexibilă, dar pe de alta complicată în căutarea condiţiilor optime. Spaţiul parametric multidimensional al funcţiilor de optimizare face puţin efective aşa metode de planificare a experimentului deja cunoscute ca design-ul factorial, metoda simplex şi altele. În metodele date numărul necesar de experimente creşte brusc cu creşterea numărului de factori. Au perspectivă metodele model, bazate pe aplicarea funcţiilor teoretice sau empirice ale parametrilor de retenţie cromatografică de diverşi factori, dar în prezent elaborarea lor nu este finisată. Sarcina pusă se complică cu dificultatea alegerii unui singur criteriu obiectiv pentru aprecierea calităţii cromatogramelor. De aceea, până în prezent cromatografiştii sunt nevoiţi de cele mai multe ori să conteze în cercetările lor pe intuiţia proprie. Analiza substanţelor medicamentoase în material biologic, la rândul său, are câteva particularităţi specifice: • probele biologice conţin matricea, cu componenţă complicată şi puţin reproductibilă • componenţii de bază ai matricei - proteinele, lipidele, polizaharidele – trebuie excluse din probe până la separarea cromatografică. Ele nu doar că împiedică analizei, ci şi reduc durata de viaţă a coloanelor cromatografice. Totodată, multe substanţe medicamentoase sunt strâns legate cu aceşti componenţi şi pot fi parţial pierdute în procesul de separare a matricei; • după separarea matricei proba mai conţine un număr vast de componenţi de diferită natură chimică, dar, numai unii din ei sunt analitici. De la probă la probă se schimbă atât componenţa cantitativă a compuşilor însoţiţi, cât şi cea calitativă; • concentraţia compuşilor analizaţi poate fi foarte joasă, iar volumul de material biologic limitat, fapt ce cere de la metodă o sensibilitate înaltă, iar de la procesul de preparare a probelor pierderi minime. În studiul farmacocinetic, în special la administrarea unei singure doze de medicament, concentraţia analitului în timpul perioadei de monitorizare poate varia în limitele a două ordine şi mai mult, şi apar cerinţe corespunzător înalte către intervalul de concentraţii determinate ale metodei analitice. 1.2. Etapele analizei cromatografice Analiza HPLC este un proces complicat, cu multe etape, rezultatul cărei depinde de designarea optimă şi scrupulozitatea efectuării fiecărei etape în parte. Se pot evidenţia 3 etape de bază ale acestui proces: Prepararea probelor – toate operaţiile de preparare a mostrelor de analizat, care se finisează cu obţinerea probelor, injectate direct în coloana cromatografică, inclusiv şi derivatizarea precoloană, în caz de utilizare. Analiza cromatografică propriu zisă – din momentul injectării probei până la înregistrarea semnalului electric la ieşirea din detector, inclusiv şi derivatizarea pe coloană sau postcoloană, unde ea-i prezentă. Prelucrarea informaţiei cromatografice primare, rezultatul căreia constă în obţinerea mărimilor ce caracterizează componenţa calitativă şi cantitativă a probelor de analizat. Oricare din etapele enumerate are specificul său de realizare şi cere o tratare individuală de optimizare. În lucrarea dată problemele optimizării fiecărei etape vor fi examinate coerent, însă ne vom abate puţin de la cronologia obişnuită şi vom examina optimizarea separării cromatografice în ultimul rând. Schimbarea este legată de faptul, că pentru a pătrunde în esenţa principiilor optimizării selectivităţii de separare în
4
general şi a metodelor model în particular mai întâi este necesar de a examina parametrii de bază a semnalelor cromatografice şi algoritmii lor de prelucrare. O atenţie aparte trebuie acordată problemei de compatibilitate între etape, care persistă într-o formă vădită sau nevădită permanent. Şi dacă problema compatibilităţii algoritmilor de prelucrare a informaţiei cu parametrii semnalelor cromatografice se rezolvă de obicei de developeri de program şi de aparataj, fapt care există pentru analitic într-o formă nevădită, pe când asigurarea compatibilităţii probelor preparate cu sistemul cromatografic se extinde pe umerii celor ce elaborează metodele analitice. În fond asigurarea acestei compatibilităţi şi este una din sarcinile etapei de preparare a probelor. Aceasta înseamnă că optimizarea preparării probelor şi condiţiilor separării cromatografice să nu se execute separat, dar în contextul unui proces unic. Astfel, utilizarea variantei cromatografie de adsorbţie necesită înlăturarea completă a apei din componenţa mostrelor de analizat, in cazul cromatografiei cu fază inversă, din contra, trebuie înlăturaţi solvenţii organici nepolari; schimbarea tipului detectorului poate să ceară excluderea unor componenţi din faza mobilă şi din probele de injectat. În unele cazuri chiar şi schimbarea componenţei fazei mobile necesită corectarea metodei de preparare a probelor. Analiza lucrărilor publicate denotă faptul că, autorii, în majoritatea cazurilor, rezolvă problemele date satisfăcător, dar, cu regret, ele se discută rar, ce duce la subestimarea semnificaţiei lor nu doar de începători, dar şi de unii cercetători cu experienţă. 1.3. Prepararea probelor. Sarcini şi metode Prepararea probelor este prima etapă cronologică şi inseparabilă a oricărei analize chimice sau instrumentale, printre care şi cromatografice. Numai în unele cazuri de aplicare a metodei HPLC, spre exemplu în cercetarea soluţiilor diluate sau dozarea impurităţilor în solvenţi, etapa preparării probelor poate lipsi. În analiza mostrelor biologice se aplică cele mai complicate metode de preparare a probelor. Compuşii analizaţi în cazul dat sunt componenţi minori ai probelor multicomponente. Etapa de preparare a probelor soluţionează următoarele sarcini de bază, şi anume: • trecerea analitului în solvent, compatibil cu sistemul cromatografic; • înlăturarea impurităţilor mecanice şi componenţilor matricei, care influenţează negativ funcţionării cromatografului şi coloanei; • extragerea preventivă a componenţilor, ce nu prezintă interes sau complică analiza; îmbogăţirea probei cu compuşi analitici; • trecerea componenţilor determinaţi într-o formă ce asigură majorarea selectivităţii separării şi/sau sensibilităţii detecţiei. Diluarea probelor cu apă sau soluţie tampon prezintă o metodă foarte simplă de preparare, dar se aplică exclusiv pentru material biologic cu conţinut mic de proteine şi de alţi polimeri, în alte cazuri componenţii polimeri ai matricei trebuiesc înlăturaţi . Cele mai simple metode şi mai des aplicate în acest scop sunt deproteinizarea şi extracţia lichidă, mai rar sorbţia. În ultimul timp devine tot mai populară metoda extracţie pe fază solidă în diverse variante de realizare. În cazurile când este dificilă detectarea directă a analiţilor, în prepararea probelor adesea se include derivatizarea precoloană. Derivatizarea la fel poate fi un proces complicat şi în mai multe etape, cum ar fi de exemplu studierea profilului aminoacizilor. Uneori se reuşeşte simplificarea schemei de analiză fiind combinate etapele de derivatizare şi deproteinizare a plasmei .
5
În majoritatea cazurilor alegerea metodei de preparare a probelor se determină de tipul materialului biologic investigat. Se consideră că în studiile farmacocinetice se obţin cele mai adecvate rezultate la analiza serului sau plasmei sanguine. La dozarea analiţilor în sânge integru rezultatele pot fi alterate din cauza acumulării lor în elementele celulare, mai ales în eritrocite. Efectul farmacologic depinde de concentraţia preparatului în fracţia liberă a sângelui, care, la rândul său prezintă o mărime derivată de concentraţia totală şi de gradul de legare a preparatului cu proteinele. Majoritatea metodelor de preparare a probelor aplicate în practică permit determinarea doar a concentraţiei totale, care în cazul unei variabilităţi semnificative de legare cu proteinele poate duce la erori clinice serioase. De aceea studierea legării substanţelor medicamentoase cu proteinele plasmatice şi modificării ei sub acţiunea unor factori prezintă o sarcină practică importantă şi pentru soluţionarea ei se folosesc următoarele metode de preparare a probelor, cum sunt: dializa, ultrafiltrarea, mai rar − ultracentrifugarea, gel-filtraţia, unele tipuri de electroforeză şi cromatografie. Concentraţia multor compuşi medicamentoşi în salivă corelează bine cu concentraţia fracţiei libere în plasma sanguină. Aceasta permite de utilizat analiza salivei pentru evaluarea nivelului liber al preparatului, dar pentru compuşii ionizabili rezultatele depind de pH-ul salivei şi de viteza ei de formare. 1.3.1. Metode de precipitare a matricei Esenţa metodelor de deproteinizare constă în denaturarea proteinelor probelor de material biologic cu diferiţi reactivi şi precipitarea lor ulterioară. Metoda este simplă în aplicare şi n-are nevoie de deservire aparat suplimentară, dar este racordată de un şir de probleme printre care posibilitatea coprecipitării sau descompunerii analiţilor, precipitarea incompletă a proteinelor, diluarea esenţială a probelor . Ea se aplică îndeosebi la analiza probelor cu conţinut înalt de analiţi, care nu necesită concentrare suplimentară, în acelaşi timp ea asigură erori neînsemnate a rezultatelor datorită unui număr minim de operaţii la prepararea probelor. Pentru deproteinizare se utilizează mai frecvent 2 grupe de reactivi: acizi puternici (în deosebi acidul tricloracetic şi percloric) şi solvenţi organici polari (metanol, acetonitril), mai rar etanol). Proteinele sunt precipitate şi cu alţi reactivi chimici, dar mai rar: etiluree, sărurile metalelor grele. Autorii multor publicaţii au utilizat amestec de precipitanţi (metanol – acetat de sodiu, metanol – acid fosforic, metanol – acid acetic, soluţie sulfat de zinc – acetonă ), sau se prelucrează succesiv cu diverşi reactivi (acetonitril + metanol, acid acetic + acetonitril , sulfat de aluminiu + hidroxid de bariu, sulfat de cupru + acetonitril , sulfat de zinc + acetonitril, soluţie acid o-fosforic + acetonitril ). Trebuie de menţionat, că necătând la şirul imens de reactivi utilizaţi de autori, lipseşteargumentarea alegerii metodei, a concentraţiilor şi procedurilor metodologice, fapt ce complică analiza sistematică şi generalizarea rezultatelor acumulate doar pe baza datelor din literatură. 1.3.2. Metode de extracţie Extracţia lichidă, reieşind din numărul publicaţiilor, este metoda cea mai des aplicată la prepararea probelor în analiza biofarmaceutică. Esenţa ei constă în distribuirea analiţilor dintre soluţia apoasă şi solventul organic miscibil limitat. Întrucât viteza transferului de masă este proporţională cu aria stratului difuzional de frontieră a fazelor, aria dată poate fi majorată amestecând cu intensitate diferită – de la o scuturare până la agitare energică.
6
În calitate de agent de extracţie cel mai des sunt utilizate hidrocarburile lichide, derivaţii halogeni, esterii, eterii, unele cetone şi alţi solvenţi, la fel şi amestecurile lor. Din variantele existente în practica bioanalitică se aplică cel mai des extracţia simplă, ce constă dintr-o singură etapă. Extracţia repetată prezintă o metodă cu mult mai eficientă, dar fiind laborioasă se utilizează destul de rar. Mult mai efectivă este extracţia în contracurent şi-i mai aplicabilă în separarea preparativă; în scopuri analitice practic nu se utilizează . În genere, numărul fazelor în extracţia lichidă poate fi şi mai mult de două. Sunt elaborate sisteme de extracţie cu trei faze, formate sau dintr-o fază apoasă şi două organice, sau din două faze apoase şi una organică , însă nu şi-au găsit aplicarea în analiza materialului biologic. Întrucât matricea biologică în principiu constă din apă şi compuşi hidrofili, extracţia lichidă se recomandă a fi simplă şi totodată procedură de preparare mult mai selectivă a materialului biologic, în ce şi constă avantajul ei principal. În acelaşi timp metoda dată poate introduce erori semnificative în rezultatele cantitative, legate de extracţia incompletă, pierderea analitului la separarea fazelor ş.a. Selectivitatea extracţiei poate fi reglată alegând natura agentului organic de extracţie, iar pentru compuşii ionogeni de asemenea şi schimbând totodată valoarea pH-ului şi forţa ionică a fazei apoase . Măsura cantitativă ce caracterizează posibilitatea de separare a două substanţe prin extracţie, este coeficientul de separare. Obţinerea unei bune selectivităţi necesită nu numai o valoare înaltă a coeficientului de separare, ci şi produsul coeficienţilor de distribuţie să fie aproape de 1 (unu). Prezenţa proteinelor în cantităţi majore în materialul biologic poate micşora substanţial eficienţa extracţiei, la fel ele duc la formarea emulsiilor stabile. Ultima dificultate se întâlneşte destul de des, dar este puţin oglindită în literatură. Pentru a preveni formarea emulsiei unii autori propun precipitarea proteinelor adăugând în probe acid tricloracetic sau solvent organic miscibil cu apa. Ambele variante pot provoca probleme în formă de descompunere acidă a analiţilor, schimbarea selectivităţii, creşterea volumului extractului de evaporare, şi, corespunzător, cheltuielilor de timp la prepararea probelor . D. Bakes a formulat cerinţe către solventul ideal utilizat în extracţia lichidă: • inofensiv pentru mediul ambiant, sau regenerarea simplă; • intoxic şi inflamabilitate scăzută; • nemiscibili cu apa; • densitate şi volatilitate prielnică; • stabilitate chimică înaltă; • absenţa tendinţei de formare a emulsiilor; • solubilitate bună a formelor neutre, dar nu ionizante de analiţi. Evident, că nici un solvent existent nu satisface în acelaşi timp toate cerinţele enumerate. Necătând la numărul enorm de publicaţii şi diversele variante utilizate ale extracţiei lichide, procesul de optimizare a metodei este descris de autori doar în câteva lucrări, dar şi în cazurile date s-a aplicat abordare empirică de optimizare, şi aceasta în timp ce teoria extracţiei lichide este simplă şi notorie. Analiza surselor bibliografice a arătat, că la extracţia substanţelor medicamentoase şi metaboliţilor din material biologic autorii au utilizat următorii solvenţi: etilacetat , cloroform, clorură de metilen, eter dietilic, eter metil-tret-butilic şi amestecurile lor: hexan – alcool izoamilic(98,5:1,5), hexan – acetat de etil (9:1),
7
hexan– cloroform (7:3) [194], hexan – clorură de metilen (3:2) [102], cloroform – toluen (15:85), cloroform – eter dietilic (4:1), izooctan – izopropanol (95:5). Volumul materialului biologic utilizat pentru analiză constituie între 0,1 şi 2 ml (valoarea medie 0,74 ml), volumul extragentului între 1 şi 40 ml (valoarea medie 7,0 ml), iar raportul volumetric material biologic :-agent de extracţie între 1:5 şi 1:50 (valoarea medie 1:11,3). În legătură cu aceasta veridicitatea afirmării divergente, precum că extracţia lichidă este metodă de concentrare, se prezintă a fi dubioasă, deoarece nici într-o lucrare volumul agentului de extracţie n-a fost mai mic decât volumul probei supuse extracţiei, iar concentrarea analiţilor s-a obţinut prin evaporarea ulterioară a extractelor. De asemenea cheltuielile de solvenţi la extracţia probelor şi de timp pentru evaporarea extractelor nu se consideră raţionale. Majorarea substanţială a selectivităţii de extragere pentru compuşii ionogeni se poate efectua prin reextracţia din stratul organic în cel apos creându-se condiţii pentru a asigura disocierea lor completă. Pe lângă aceasta analiţii pot fi concentraţi într-un volum minim de fază apoasă. Reextractul apos nu trebuie evaporat şi în majoritatea cazurilor poate fi direct injectat în cromatograf. De obicei reextracţia acizilor slabi se efectuează cu soluţii bazice, iar reextracţia bazelor slabe – cu soluţiile acizilor minerali. În alte publicaţii se întâlnesc metode, conform cărora după reextracţia în faza apoasă are loc extracţia repetată cu solvenţi organici şi evaporarea ulterioară a extractului, dar oportunitatea acestei etape în plus nu şi-a găsit argumentare. În ultimii ani se dezvoltă rapid şi cu mare perspectivă metoda de extracţie prin membrană. Analiţii se extrag prin metoda dată în formă de molecule neutre din materialul biologic pe membrana poroasă, îmbibată cu solvent organic şi în acelaşi timp se reextrag din partea opusă a membranei în soluţia apoasă sub formă de ioni. De asemenea metoda există în varianta micro, ce permite prepararea probelor în regim on-line în acelaşi timp cu analiza cromatografică a probei precedente. În prezent implementarea ei pe larg este limitată din cauza necesităţii de utilizare a aparatajului special. Extracţia lichidă se combină uneori cu alte metode de preparare a probelor, în cele mai dese cazuri preventiv se utilizează deproteinizarea cu solvenţi organici polari. În acest caz, solventul organic, utilizat la deproteinizare, poate servi ulterior component polar în amestecul de extracţie. În fine, în unele lucrări, extracţia lichidă s-a utilizat nu pentru extragerea analiţilor, dar pentru înlăturarea surplusului de reactiv după derivatizare, sau a solventului polar, folosit la deproteinizare. 1.3.3. Metode de sorbţie Diversele metode de sorbţie utilizate la prepararea probelor sunt similare celor de extracţie, doar cu excepţia, că componenţii probelor nu se extrag în solvenţi lichizi, dar se adsorb pe suprafaţa solidă. Viteza atingerii stării de echilibru, ca şi în extracţia lichidă, depinde de aria frontierei de separare a fazelor, dar în cazul dat ea se determină de dimensiunile particulelor şi porozitatea sorbentului. Sorbţia din probele lichide se poate efectua prin suspendarea în ele a unei cantităţi de sorbent; pentru mostre solide, printre care şi ţesuturile biologice, se aplică metoda de dispersare a matricei în fază solidă (matrix solid-phase dispersion), în care mostra se triturează cu sorbent solid, ce îndeplineşte în acelaşi timp şi rolul materialului abraziv.
8
În acest scop se folosesc sorbenţi pe bază de silicagel cu dimensiunile particulelor mai mari de 50 μm . Dar cea mai răspândită şi mai evolutivă metodă a devenit extracţia pe fază solidă (solid-hase extraction, SPE), în care proba trece printrun cartuş special sau o coloană de dimensiuni mici cu sorbent. Practic se utilizează aceiaşi sorbenţi, ca şi în coloanele analitice, dar cu dimensiunile particulelor mai mari. Schema de preparare a probelor în varianta tipică SPE include următoarele etape: - condiţionarea sorbentului; -încărcarea probei; -spălarea sorbentului cu eluent slab pentru înlăturarea componenţilor polimeri ai matricei şi impurităţilor slab reţinute; -eluarea selectivă a componenţilor analizaţi cu solvent cu forţa de eluare optimă; -diluarea ulterioară a eluatului sau evaporarea solventului În procesul eluării analiţilor se efectuează un multiplu transfer al substanţei între sorbent şi faza mobilă analogic transferului ce are loc în coloana cromatografică. Astfel metoda SPE potenţial posedă o selectivitate mai bună decât de exemplu extracţia lichidă , dar pentru obţinerea acestei selectivităţi trebuie de optimizat forţa de eluare şi volumele de solvenţi pentru fiecare metodă concretă. În practică sunt utilizaţi mai des eluenţi foarte puternici, cu care se obţine o regăsire înaltă a analiţilor şi reproductibilitate bună a rezultatelor, dar astfel metoda de preparare pierde selectivitatea sa şi avantajul legat de ea. Cartuşul, în extracţia pe fază solidă, de regulă se utilizează de o singură dată, fapt ce exclude impurificarea încrucişată a probelor şi permite sorbţia probei de plasmă sau ser fără preparare preliminară. Totuşi, unii autori, separă preliminar matricea prin deproteinizare, sau prin alte metode aplicabile. Microcoloanele pentru SPE se aplică repetat şi pentru ele este obligatorie separarea preliminară a componenţilor polimeri ai matricei, cu excepţia când se utilizează sorbenţi specifici cu acces resctrictiv, ce exclud sorbţia proteinelor. Adesea la efectuarea SPE sorbenţii se folosesc în regimuri netradiţionale de lucru pentru ei. Spre exemplu, M. Miura şi colab. au utilizat cartuşele Sep-Pak CN în regim cu fază inversă, inhibând interacţiunea polară cu concentraţii înalte de clorură de sodiu, iar sorbţia din soluţii apoase pe silicagel nemodificat permite de a majora selectivitatea la determinarea bazelor de amoniu cuaternar. Principalul avantaj al metodei extracţie pe fază solidă desigur constă în posibilitatea de automatizare maximală a preparării probelor, iar la aplicarea variantelor on-line – automatizarea întregului proces analitic. Extracţia pe fază solidă în regim on-line, numită de asemenea cromatografie cu comutarea coloanelor sau cu injectarea directă a probelor (utilizarea neunivocă a ultimelor două denumiri duc uneori la confuzii ), devine o metodă de preparare a probelor tot mai răspândită datorită, în primul rând, combinării proceselor de preparare a probelor şi analizei cromatografice. Însă, utilizarea ei este racordată cu complicarea aparatajului. În această variantă se folosesc coloane de sorbţie cu lungimea 10-30 mm. Încărcarea probei şi spălarea ei ulterioară se execută cu o pompă auxiliară, ce livrează faza mobilă cu forţa de eluare mică, iar eluarea – cu faza mobilă de bază nemijlocit în coloana analitică. Încărcarea probei şi spălarea coloanei de sorbţie se poate efectua cu diferite faze mobile .
9
Întrucât rezistenţa hidrodinamică a coloanei de sorbţie nu este mare, în calitate de pompă auxiliară poate fi aplicată o pompă tip seringă sau alta cu presiunea joasă , sau se poate injecta proba şi spăla coloana de sorbţie manual cu ajutorul microseringii (ultima variantă se realizează fără complicarea utilajului, dar exclude posibilitatea automatizării procesului). Există variante cu utilizarea a trei coloane – de sorbţie, intermediară şi analitică – şi două sau trei faze mobile, dar se poate de îmbunătăţit selectivitatea semnificativ numai utilizând în coloane sorbenţi cu diverse mecanisme de retenţie 1.3.4. Alte metode de preparare a probelor biologice Există metode de preparare a probelor care sunt mai puţin universale şi de aceea se aplică destul de rar. Unele din ele merită să li se acorde o mai mare atenţie, şi anume: Metode de dializă şi ultrafiltrare, bazate pe difuzia substanţelor cu masa moleculară mică prin membrana semipermeabilă. Din probă se elimină ideal componenţii polimeri ai matricei, particulele coloidale şi impurităţile mecanice şi se asigură compatibilitate completă cu sistemele cromatografice cu fază inversă, dar ele permit determinarea exclusiv a fracţiei libere a substanţei medicamentoase. De aceea ele se utilizează de obicei pentru studierea proceselor de legare cu proteinele, de asemenea pentru determinarea substanţelor cu grad de legare destul de mic. Distilarea se poate utiliza pentru extragerea analiţilor volatili. Metoda este destul de selectivă, dar dozarea compuşilor este problematică, în special la analiza volumelor mici de mostre. Liofilizarea permite eliminarea completă a apei din probă în condiţii, ce exclud descompunerea chiar şi a analiţilor destul de labili, dar necesită utilaj special şi cheltuieli suficiente de timp şi de energie. De obicei se utilizează ca metodă de conservare a probelor biologice pentru depozitarea posterioară de lungă durată. Sorbţia pe răşină schimbătoare de ioni în principiu este analogică metodei SPE, pe schimbători de ioni poroşi, însă procesele de echilibrare sunt mai îndelungate datorită difuziei lente în interiorul granulelor răşinii schimbătoare de ioni. Astfel, această metodă este utilizată mai frecvent în scopuri preparative. În ultimii ani la prepararea probelor solide, inclusiv şi ţesuturilor biologice, capătă o importanţă tot mai mare metoda de extracţie accelerată cu solvenţi (accelerated solvent extraction, ASE). Esenţa metodei constă în utilizarea solvenţilor lichizi la temperatură şi presiune înaltă, totodată şi varietatea ei cu utilizarea radiaţiei de microunde. Un interes deosebit în metoda ACE capătă apa în calitate de agent de extracţie, care la temperatura mai sus de 100°C îi creşte brusc capacitatea de extragere şi se apropie după caracteristici de solvenţii organici. Un neajuns al metodei prezintă necesitatea elaborării aparaturii speciale şi-i posibilă distrugerea probei la temperaturi înalte. 1.3.5. Minimizarea volumului necesar al probei de material biologic Posibilitatea de a lucra cu volume mici de mostre este una din condiţiile de bază pentru orice metodă analitică, iar volumul de probă disponibil la analiza materialului biologic devine adesea factor limitativ. Această sarcină este actuală mai ales la prelevarea probelor de sânge la copii mici, persoanelor în etate şi animalelor de laborator. În cazul studiilor farmacocinetice situaţia se complică cu necesitatea prelevării câtorva probe de la un subiect, de asemenea se urmăresc concentraţii joase a analiţilor, sub nivel terapeutic. Aceste concentraţii, în multe cazuri, se apropie de limita de sensibilitate a detectoarelor aplicate şi atunci volumul materialului biologic disponibil determină
10
parametrii de limită a metodei analitice în general. Astfel, sarcina examinată referitor la procedurile de preparare a probelor poate fi formulată ca sarcină de minimizare a pierderilor de analiţi în acest proces de preparare. În varianta ideală ar trebui ca toată cantitatea analiţilor, ce se află în proba primară, să treacă în coloana cromatografică. Pierderea analiţilor în procesul preparării probelor are loc la toate etapele şi este legată de extracţia incompletă sau coprecipitarea la separarea matricei, cu volatilizarea sau descompunerea substanţelor la evaporarea extractelor, cu antrenarea analiţilor la spălarea sorbenţilor pentru SPE, sau cu ulterioara eluare incompletă a lor, cu prelevarea alicotei materialului primar, extractelor, centrifugatelor şi a probelor preparate. Prima modalitate de a soluţiona sarcina dată constă în micşorarea numărului de operaţii, pe cât e posibil. S-ar părea, ca metodele simple cu o singură stadie de preparare a probelor (de exemplu, deproteinizarea) să aibă un avantaj evident, dar ele, sunt neselective, de regulă, iar sensibilitatea metodei se determină de intensitatea semnalelor interferente. S-au elaborat chiar şi sorbenţi speciali, care permit injectarea lichidelor biologice în coloana cromatografică fără preparare preliminară. Însă, practica arată că reclamaţiile producătorilor sunt departe de realitate şi coloana a cărei preţ majorat de câteva ori decât una obişnuită se îmbâcseşte mecanic destul de repede şi iesă din funcţie. O soluţionare mai raţională a sarcinii de minimizare şi practicată pe larg constă în aplicarea metodei SPE în regim on-line descrisă mai sus. Varianta microextracţie pe fază solidă (SPME) elaborată relativ recent permite de-a lucra cu volume de material biologic de ordinul zecilor şi unităţilor de microlitri. Sorbent în varianta dată se foloseşte fibrele de sticlă, acoperite cu fază staţionară corespunzătoare şi ambalate într-un cartuş special, sau nemijlocit în capilarele de legătură, în canalele comutatoarelor lichide, injectoarelor ş. a.. Are perspectivă o altă metodă de preparare a microprobelor - extracţia prin membrană, tot în regim on-line [45]. De asemenea în literatură este descrisă şi varianta on-line a metodei de microdializă. Merită o atenţie deosebită metodele de dozare a substanţelor medicamentoase, metaboliţilor lor, la fel a metaboliţilor naturali cu semnificaţie diagnostică în spoturi de sânge pe hârtia de filtru. Datorită procedurii simple de prelevare a probelor biologice şi aproape în orice condiţii, a comodităţii şi siguranţei de transportare a mostrelor analiza spoturilor de sânge se aplică tot mai des în diverse cercetări de screening. Principalele dificultăţi în realizarea ei sunt, în primul rând, volumul mic al probei de analizat (de la 3-4 până la 20-30 μl sânge integru în spotul decupat în dependenţă de grosimea hârtiei şi diametrul discului), în al doilea rând, starea de agregare solidă necesită elaborarea metodelor de preparare speciale. De asemenea este posibilă şi micşorarea regăsirii compuşilor bazici, din cauza sorbţiei pe celuloză, care se poate diminua prelucrând hârtia cu compuşi tensioactivi cationici până la prelevarea probelor. Dozarea se mai complică cu repetabilitatea şi reproductibilitatea mai scăzută comparativ rezultatelor obţinute prin metode obişnuite. După o analiză a surselor literare se urmăresc două direcţii în metodologia de prelucrare a spoturilor de sânge: • transformarea întregii probe într-o stare lichidă, dizolvând sângele uscat în apă, în soluţie de solvenţi tensioactivi sau în tampon potrivit, spre exemplu fosfat, formiat de amoniu. Mai apoi probele lichide pot fi prelucrate prin orice metode, valabile pentru plasmă, dar ţinând cont de faptul, că ele sunt mai diluate; • extracţia analiţilor direct din disc fără dizolvarea matricei.
11
Concluzii: Noua metodă de preparare a probelor de material biologic elaborată pentru analiza cromatografică, bazată pe extracţia “omogenă” este simplă, rapidă, eficientă, economică şi universală la analiza compuşilor cu polaritate medie sau joasă în toate tipurile de lichide biologice şi de asemenea în ţesuturi. Bibliografie: BALOESCU C., CUREA E. Controlul medicamentelor. Bucureşti. 1983 BOJIŢĂ M., ROMAN L., SĂNDULESCU R. Cerinţe şi performanţe pentru optimizarea proceselor analitice în analiza şi controlul medicamentului. Congresul al XIIlea Naţional de Farmacie cu participare internaţională. Rezumatele lucrărilor ştiinţifice, vol.1, Bucureşti, 17-19 octombrie 2002. MUNTEAN Daniela L., BOJIŢA Marius. Controlul medicamentelor. Metode spectrale, cromatografice şi electroforetice de analiză. Cluj Napoca, 2004 CASIAN Ana Contributii la optimizarea metodei cromatografice de lichide sub presiune pentru aplicarea in analiza farmacocinetica Chişinău, 2008
12
