CROMATOGRAFIA DE GASES
Generalidades: La cromatografía de gases es, esencialmente un proceso físico de separacion de los componentes de una mezcla, el cual se basa en la diferencia de velocidades de migración de cada componente, lograndose una distribucion diferencial entre do sfases: un lecho lecho o fase estacionaria estacionaria y una fase movil o gas inerte. El metodo fue desarrollado fundamentalmente por los cientificos ingleses A.. !ames y A:".#. $artin hacia %&'% y desde %&() hsata la fecha ha tenido un gran desarrollo. desarrollo. E*isten dos modalidades modalidades de cromatografía cromatografía de gases: la cromatografía cromatografía gas solido +G-, en la cual la fase estacionaria es un solido y el proceso de separacion supone e/uilibrios e/uilibrios de adsorcion adsorcion gaseosa. En la cromatografía cromatografía gas li/uido +GL, la fase estacionaria e sun li/uido /ue recubre un soporte solido inerte y en este caso ocurriran e/uilibrios gas li/uido. Esta ultima modalidad es la mas empleada. El e/uilib e/uilibrio rio durante durante la distrib distribució ución n diferenc diferencial ial entre entre las dos fases, fases, se puede puede describir en forma cuantitativa por medio de una constante dependiente de la temperatura: el coeficiente de partición. 0 1 s 2 m
donde
s 1 concentración total del soluto en la fase estacionaria y m 1 oncentración del soluto en la fase móvil
En el caso ide ideal, esa raz razón es const nstante nte para una ampl mplia gama de concentraciones concentraciones,, es decir /ue s es proporcional proporcional a m, pero en algunos casos la relación no es lineal. El proceso esencialmente consiste en transportar una muestra en fase de vapor, con un gas inerte o fase móvil, a una determinada presión y temperatura, desde el sitio sitio de inyec inyecci ción, ón, hasta hasta la fase fase estaci estacion onari aria a +colu +column mna. a. Allí Allí tiene tiene lugar lugar la separación y luego los componentes separados +eluídos llegan la detector, sitio en el /ue /ue se orig origin ina a una se3a se3all elect lectri rica ca,, la cual cual es regi regist stra rada da como omo un crom cromat atog ogra rama ma,, o lleg llega a a un inte integr grad ador or /ue /ue digi digita tali liza za la se3a se3al, l, graf grafic ica a el cromatograma, detecta e integra las se3ales y entrega un informe +4igura %.
.
Figura 1. omponentes 5asicos de un romatografo de Gases 3. Fase Movil o Gas Portador:
Los gases mas frecuentes empleados como fase movil son: helio, hidrogeno, nitrogeno, argon, y una mezcla importante, argon2metano. #ara su eleccion, fundamentalmente debe tenerse en cuenta la columna y la naturaleza del detector /ue se va a utilizar. #or e!emplo, para una columna capilar, se escogera por lo general helio y para un detector de conductividad termica se eligira helio o hidrogeno6 frente al nitrogeno, este detector muestra ba!a sensibilidad. 7n detector de captura de electrones, re/uiere de una mezcla de argon8metano. El gas debe ser 9E;E, -E< y #7;<. La humedad interactua con los materiales de la columna, produciendo falsos picos, lo cual se evidencia me!or cuando se usa un programa de temperatura6 ademas reduce la vida de la columna. Las impurezas causan problemas seme!antes a la humedad, las mas frecuentes son o*igeno, hidrogeno, nitrogeno e hidrocarburos. -e han establecido limites para estas impurezas, y los gases utilizados deben ser cromatograficamente puros, del &&.&&&= de pureza6 deben ser regulados de manera de obtener un flu!o y una presion constantes. 4. Sitio o u!to de i!"e##io!:
#ermite introducir la muestra sobre el flu!o del gas portador, para ser transportada a la columna. Esta parte de la columna esta construida en acero ino*idable, lo cual puede producir degradación de la muestra. En algunos dise3os, se usan
pe/ue3as tuberías de vidrio +glass8line, con lo cual se garantiza la estabilidad de la muestra. El calentamiento de este sitio, a una temperatura adecuada, permite la vaporización de la muestra, la cual es transportada a la columna en el caso de columnas empacadas, o subdividida antes de llegar a la columna, en el caso de columnas capilares. La muestra puede colocarse con una micro!eringa o colocarse directamente la forma sólida o gaseosa. La micro!eringa, permite colocar la muestra a trav>s del tapón de caucho o septum. El volumen de muestra es de % a ( L para columnas empacadas, y apro*imadamente ).))( l para columnas capilares. $. Colu%!a:
La columna es una de las partes importantes del cromatógrafo6 e*isten dos clases de columnas, las empacadas y las capilares. onsisten de un espacio geom>trico, generalmente un tubo de metal o vidrio, el cual contiene un soporte inerte recubierto con la fase li/uida estacionaria +GL. Allí tiene lugar la separación de la muestra en sus diferentes componentes. -e debe tener un amplio conocimiento sobre los materiales, tamano, fases estacionarias y sobre la eficiencia, Los materiales usados para las columnas deben ser inertes, resistentes a la temperatura de traba!o, impermeable y fle*ibles. Los materiales pueden ser: acero ino*idable, aluminio, cobre, vidrio o teflon6 los mas usados osn vidrio y acero ino*idable, considerandose el vidrio como el me!or, por ser inerte, impermeable, y resistir la temperatura de traba!o6 tiene la desventa!a de ser muy fragil. Es el material de eleccion para el analisis de pesticidas y de esteroides. La forma y las dimensiones de la columna son muy variadas. Las columnas empacadas tienen un diametro interno de %2' a %2? de pulgada y una longitud de @ a ) pies. Las capilares tienen un diametro de ).)% a ).) pulgadas y una longitud hasta de B) metros. (.%. olumnas Empacadas a. romatografia Gas8Li/uido: Fase Estacionaria:
En la cromatografía gas8li/uido, la fase estacionaria esta constituida por una película delgada de un li/uido viscoso o fase li/uida, de naturaleza /uímica definida, similar a la del compuesto en estudio, la cual recubre partículas sólidas inertes de forma y tama3o característicos, denominadas soporte sólido. anto el soporte sólido como la fase li/uida deben tener propiedades y condiciones para ser empleadas como tales.
-oporte -ólido: La finalidad del soporte sólido en el empa/ue de una columna, es proporcionar una gran Crea superficial sobre la cual se fi!a la fase li/uida. Debe reunir las siguientes propiedades: Gran Crea superficial por unidad de volumen, facilidad de mane!o para el llenado de la columna, tama3o y forma de partícula uniformes, preferentemente esf>rico, inerte por naturaleza o por desactivación y buena resistencia mecCnica. El tama3o de partícula, generalmente, se define de acuerdo al diCmetro de la columna, por e!emplo: DiCmetro de la columna %2? de pulgada %2' de pulgada
ama3o de partícula ?) 8%)) m @) ?) m
En general, entre mas pe/ue3a sea la partícula, mayor serC la eficiencia de la columna, sin embargo para un tama3o por encima de %) +partículas muy pe/ue3as, aumenta e*cesivamente la presión para el flu!o de la fase móvil. Los soportes solidos mas ampliamente usados son: la tierra de diatomCceas, las esferas de vidrio y el teflón. La tierra de diatomaceas, se conoce con varios nombres registrados como 0ieselgur, elite o hromosorb. al ves el nombre mas empleado es el de hromosorb, el cual va acompa3ado de varias letras como F, #, G y otras, las cuales indican diferencia en su forma de obtención, diferencias /ue inciden en sus características físicas y /uímicas. Estos soportes, pueden ser tratados con el ob!eto de eliminar grupos polares y obtener así un soporte inerte, para evitar perdidas del compuesto en estudio o las colas o asimetría en el pico cromatogrCfico. Las iniciales AF, significan /ue el hromosorb ha sido sometido a un tratamiento o lavado acido6 AF: no lavado con acido6 $D-: soporte tratado con he*ametildisilazano para blo/uear los grupos hidro*ilo y obtener los silil >teres6 AF D$-: hromosorb F, #, G lavado con acido y luego tratado con dimetilclorosilano. El resultado es un soporte muy inerte # de alta eficiencia. Las esferas de vidrio se usan para compuestos muy polares y se recubren con películas muy delgadas de fase li/uida. El teflón, es uno de los polímeros usados como soporte sólido, es difícil de recubrir y no debe usarse mas del %)= de fase li/uida para su recubrimiento.
4ase Li/uida: Las propiedades de una buena fase li/uida son las siguientes:
-
5a!a Holatilidad. #unto de ebullicion por lo menos de %)) por encima del punto ma*imo de operacion de la columna. 5uena estabilidad termica. Iuimicamente inerte #resentar propiedad solvente frente a los compuestos /ue se van a separar.
E*isten por lo menos )) fases li/uidas conocidas y la eleccion adecuada es dificil de lograr. En terminos generales, debe escogerse una fase li/uida cuyas caracteristicas fisico/uimicas sean seme!antes a la de la muestra /ue se va a analizar y debe ser compatible con el soporte solido. omo e!emplos de fases li/uidas corrientemente empleadas, de las cuales se encuentra informacion en la literatura, se tienen las siguientes: idrocarburos:
8 Escualeno 8 Apiezon L
#olietilenoglicoles: 8 arboJa* ')), @)), %()) -iliconas:
8
Harios:
8 Dimetilsulfonato +D$- y otros.
El porcenta!e de fase li/uida usada para el recubrimeinto del soporte solido, varia entre el B y el %)= para columnas analiticas y puede llegar hasta el (= para columnas preparativas. El porcenta!e esta dado en peso, respecto a la proporcion del soporte solido. -e estan usando bastante los copolimeros porosos del divinilbenceno y del estireno, con otrosn monomeros incluidos en su macromolecula. omercialmente se conocen como #oropa o hromosorb de la serie %)). Estos actuan a la vez como soporte solido y como fase li/uida. #ara lograr columnas eficientes, es neceario /ue esten bien empacadas con un soporte solido uniforme recubierto con una pelicula delgada y uniforme de fase li/uida. #eliculas gruesas, disminuyen la eficiencia y las peliculas delgadas la aumentan, cuando aumenta el flu!o de la fase movil. b. romatografia Gas8-olido +G-
En esta clase de cormatografia se usan columnas empacadas con materiales solidos adsorbentes como fase estacionaria. Los mas comunes son charcoal +carbon activado, silica gel, zeolitas sinteticas, tamices moleculares y los polimeros porosos recientemente desarrollados. Esta clase de cromatografia se usa especilamente para compuuestos muy volatiles. $.&. Colu%!as Cailares:
El desarrollo de estas columnas, se conoce desde %&(@ y estan constituidas por tubos apro*imadamente de B) m. de longitud y de un diametro de ),)% a ),) pulgadas, dobladas en forma apropiada de acuerdo al diseno del cromatografo. El material puede ser metalico o de vidrio tratado. omo e!emplos de las columnas capilares se conocen las columnas de Golay, las de -cott y otras. La de Golay van recubiertas en su interior con una pelicula delgada de fase li/uida y las de -cott llevan una capa fina de soporte solido recubierta de fase li/uida. En estas columnas la fase movil puede fluir libremente, lograndose una caida de presion notoria. -e usan para el analisis de trazas. (.B. uidados y #recauciones con las columnas: Las columnas nuevas, deben ser acondicionadas por lo menos durante '? horas, para lo cual se asegura la columna a la salida del inyector, pero no se asegura la detector. -e hace circular la fase movil a un flu!o apro*imado de %K ml2min. M se calienta la columna a una temperatura () grados por deba!o del valor ma*imo indicado para cada columna. omo norma de seguridad, debe hacerse circular la fase movil antes de empezar el calentamiento de la columna. unca debe suspenderse el paso de la fase movil, antes de enfriar la columna. @.
Detectores:
7n detector usado para un cromatografo de gases no es mas /ue un dispositivo a traves del cual circula la fase movil, a lo cual responde el detector generando una senal leectrica cuando ocurre un cambio en la composicion de la fase movil. -u disenos e fundamenta en la medida de las propiedades fisico/uimicas de los compuestos con estructura /uimica definida. Los detectores mas conocidos son: de conductivida termica, de ionizacion +de llama de hidrogeno N49DO, de nitrogeno y fosforo N#DO, de captura de electrones, de fotometria de llama, el termoionico +llama alcalina y el espectrometro de masas. El detector debe reuinir unas caracteristicas especiales, las cuales se pueden clasificar en primarias y secundarias. Las primarias son: respuesta, sensibilidad, selectividad y linealidad6 las secundarias son: simplicidad, costo, disponibilidad y durabilidad.
Resuesta: es la senal producida por la muestra y teoricamente depende de la concentracion, aun/ue tambien de la naturaleza de la muestra. Se!si'ilidad: corresponde a la pendiente de la recta cuando se grafica la respuesta vs. La concentracion. Generalmente se e*presa en milicoulombios por gramo para detectores de ionizacion, o milivoltios8mililitro por gramo para detectores de conductividad termica. Se!si'ilidad " ruido: todo circuito electrico genera un ruido, es decir, una respuesta debida a cual/uire variacion en el sistema, diferente a la presencia de una muestra. -i el nivel de ruido es muy alto con relacion a la cantidad de muestra presente, no se puede diferenciar la respuesta.
uando la relacion senal8ruido +-2 e igual a % e simposible detectar la respuesta de la muestra. La minima cantidad detectable sera la /ue corresponda a una relacion senal8ruido igual a . (i!ealidad: es la region de la respuesta, en la cual la senal del detector es directamnete proporcional a la concentracion de la muestra. Es muy importante encontrar para cada detector, la zona de linealidad de la respuesta. Sele#tividad: es la propiedad /ue tiene el detector para responder a determinados tipos de compuestos6 por e!emplo, el detector de ionizacion #D solamente responde a compuestos /ue contienen o #, en cambio el detector de conductividad termica es universal.
@.%. lases de Detectores: Detector de onductividad ermica: es uno de los primeros detectores empleados en cromatografia de gases, de facil uso, durable, de aceptable sensibilidad, de tipo universal, no destructivo, especialmente empleado para detectar agua, mono*ido de carbono, anhidrido carbonico, nitrogeno y otros gases. -e conoce con diferentes nombres como: detector de filamento caliente, catatometro y otros. E*isten varios disenos de este detector. onsiste en un filamento metalico, colocado dentro de un cilindro metalico. Al calentar el filamento, este alcanza una temperatura determinada, la cual puede variar al pasar la fase movil, debido al cho/ue de las moleculas de la fase movil con el filamento. La perdida de calor es constante, si se mantiene constante el flu!o de la fase movil y la temperatura del detector. Entre mas liviano sea el gas portador, es me!or conductor de calor +helio, hidrogeno. 7na vez estabilizada la senal llega al detector la fase movil mas las moleculas del compuesto separado por la columna, ocasionando un dese/uilibrio en la senal electrica, por aumento de la temperatura, debido a /ue las moleculas del compuesto separado son mas pesadas /ue las del gas portador, dificultandose
su interaccion con el filamento. La senal generada +aumento de la resistencia es proporcional a la concentracion de la muestra. El detector de conductividad termica es el menos sensible de todos, no es selectivo y muestra una linealidad adecuada. #ara /ue sea eficiente, deben seleccionarse convenientemente las condiciones de funcionamiento como: seleccion del gas portador, la velocidad de flu!o, la temperatura y la corriente, onductividad termica relativa de algunos gases respecto al he*ano:
GAS
CO)D*CTI+IDAD TERMICA RE(ATI+A
etracloruro de arbono 5enceno e*ano Argon itrogeno elio idrogeno
).'' ).?? %.)) %.)' %.() ?.B %).@?
Los detectores de conductivida termica, re/uieren un flu!o minimo de gas portador entre %) y B) ml2min. #ara su buen funcionamiento. La temperatura de traba!o debe estar entre ( y () por encima de la temperatura de la columna. 7n sobrecalentamiento disminuye la vida del detector y puede causar descomposicion de la muestra. -iempre se debe abrir el paso de gas portador antes de calentar el detector, y no se debe suspender el flu!o hsta /ue se halle a la temperatura ambiente. Detector de 9onizacion de Llama: El detector de ionizacion de llama de hidrogeno +49D, es uno de los mas empleados por sus sensibilidad a la gran mayoria de compuestos organicos y el amplio intervalo de respuesta. onsiste en una pe/uena llama de hidrogeno8aire, rodeada de un campo electrostaico. Esta llama alcanza una temperatura determinada y al pasar la fase movil, el gas ioniza, originando una corriente electrica. uando la fse movil transporta el compuesto separado por la columna, si este tiene atomos de carbono facilmente o*idables, ioniza originandose un flu!o de electrones, lo cual es funcion de la concentracion. El cambio en la corriente elctrica generada por la presencia de iones, es amplificado, originandose una respuesta. El detector no es sensible a la presenia de gases como mono*ido de carbono, anhidrido carbonico, nitrogeno ni al agua. ;e/uiere un volumen pe/ueno de muestra, lo cual es una venta!a cuando se traba!a con columnas capilares +).)% a ).) L.
on este detector se usan fases moviles como helio, argon, nitrogeno6 presenta buena sesibilidad y linealidad. Debido a su buena sensibilidad, debe tenerse cuidado con la concentracion de la muestra, con la pureza de la fase movil y con el estado de las columnas para evitar su contaminacion. Es un detector de tipo destructivo. Detector de 9onizacion para fosforo y nitrogeno +#D: Es un detector de ionizacion de llama, muy especifico para compuestos organicos /ue tengan nitrogeno o fosforo. -e iferencia del anterior, en /ue en su diseno incorpora una esfera de rubidio, la cual aumenta la poblacion de iones, haciendolo mas sensible. -u mane!o re/uiere mucho cuidado. Detector de aptura de Electrones +ED: este detector de ionizacion, lleva en su diseno una pe/uena lamina recubierta de material radioactivo, generalmente, i @K, el cual emite particulas 5. Estas particulas ionizan la fase movil /ue esta fluyendo, originando una masa de electrones de mediana energia, presentandose una diferencia de potencial. La fase movil empleada con este detector, es una mezcla de argon8metano de alta pureza:
Ar P 5 ' P 5
Ar P P e8 'P P e8
uando la fase movil transporta el compuesto separado por la columna y este tiene afinidad por los electrones, los captura disminuyendo la senal electrica. -e origina una respuesta negativa, la cual es convertida internamnete para dar lugar al pico cromatografico conocido. Espectrometro de $asas: #uede considerarse como el detector mas universal. #ermite obtener el espectro de masas de cada uno de los compuestos separados por la columna, con lo cual la identificacion se facilita. ,.
Ali#a#io!es:
La senal obtenida despues de realizar el proceso de separacion en las condiciones optimas +columna apropiada, tamano de muestra, flu!o de la fase movil, temperatura constante o programada, y el detector adecuado, puede emplearse para fines cualitativos o cuantitativos. ,.1. A!alisis #ualitativo:
a. El tiempo de retencion se puede usar como una ayuda para identificar un compuesto, siempre /ue se traba!e en las mismas condiciones con patrones conocidos. 7sualmente, la muestra problema y los patrones se traba!an
cambiando condiciones, como la temperatura y las columnas. -i los tiempos de retencion coinciden pueden tratarse de los mismos compuestos. b. 9dentificacion usando grafiacas de series homologas. Estas se obtienen graficando el logaritmo del tiempo de retencion, contra el numero de carbonos de los compuetos de la serie, el numero de grupos metilenos, el punto de ebullicion, etc. c. 9ndice de retencion. Los compuestos pueden ser identificados por el indice de retencion de Fehrli y 0ovats. #or definicion, el indice de retencion para una parafina normal, es igual a %)) veces el numero de atomos de carbono de la muestra independientemente de la naturaleza de la columna y de las condiciones del analisis. 7n indice de retencion de ((), significa /ue para unas condiciones dadas la sustancia aparecera entre el n8pentano y el n8 he*ano. El indice de retencion para una parafina Q es igual a:
9nd. ;et. 1 falta ecuacion Q: compuesto en estudio. n: parafina con n atomos de carbono. n P %: parafina con n P % atomos de carbono. K.. Analisis uantitativo: El area y la altura del pico cromatografico, son proporcionales a la concentracion. E*isten diferentes modaliddes para calcular el area del pico6 si se hace matematicamente, la medicion mas e*acta se logra empleando la e*presion: A 1 h ma* * F b 2 -in embargo, usualmente se calcula mediante la e*presion:
A 1 h * F h Los porcenta!es de e*actitud, encontrados de acuerdo a la e*presion empleada son los siguientes:
h*Fh h*Fb2 h ma* * F b 2
8888888888 8888888888 8888888888
&B.& = K&.& = &@.& =
-i el instrumento dispone de un integrador digital, este recoge toda la informacion a medida /ue va llegando la muestra la detector, en funcion del tiempo, obteniendose asi mayor e*actitud en el valor del area. on el ob!eto de eliminar los errores en al inyeccion de la muestra, no se usan las areas ni las alturas absolutas. -e usan medidas relativas, para lo cual se adiciona a la muestra o al patron, un volumen constante de unc ompuesto conocido como patron interno. -e relaciona el area de la muestra, o de la sustancia patron, con el area del patron interno y este valor es el /ue se usa para la cuantificacion. a. urva de alibracion -e debe disponer de una serie de concentraciones crecientes de la sustancia patron, a las cuales se les adiciona un volumen constante del patron interno, y se relacionan las areas o las alturas. -e grafica la relacion de areas +A patron 2 A patron interno o de alturas +h patron2 h patron interno versus la concentracion. A la muestra problema se le adiciona el mismo volumen del patron interno y se obtiene el valor de la relacion de areas o de alturas, el cual se interpola en la curva de calibracion. <A: omo patron interno se usa un compuesto conocido, el cual debe responder a las mismas condicione de traba!o de la sustancia patron. El tiempo de retencion del patron interno, no debe estar muy distante del tiempo de retencion del compuesto en estudio.
b. La cuantificacion tambien se puede hacer por normalizacion de areas, para lo cual se tiene en cuenta la suma de las areas de todos los picos correspondientes a los compuestos presentes en la muestra. Esta suma se hace igual a %)), y luego se calcula el procenta!e correspondiente a cada area asi: = A 1 Area de A 2 Area total * %)) El metodo es valido si todos los componentes de la muestra responden de la misma manera, en las condiciones a las cuales se traba!a la muestra. E*isten otras modalidades para la cuantificacion, pero talves las mas usadas son las senaladas anteriormente.
