UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
CURSO PROFESOR
: :
Laboratorio de Microbiología Gretty Villena
INFORME DE PRÁCTICAS P RÁCTICAS PRÁCTICA N°
:
03
TÍTULO
:
Tinción diferencial ácido-resistente
ALUMNOS
:
Carrasco, David arfán, !"el #ro$e%a, &oselin &oselin 'ibille, 'tefanía
FACULTAD
:
Ciencias
HORARIO DE PRÁCTICAS (DÍA Y HORA)
:
L(nes)*+00 a *00 .rs
FECHA DEL EXPERIMENTO
:
0/)0)10*3
FECHA DEL REPORTE
:
13)0/)10*3
Tincin Di!"#"nci$% Áci&'R"i*"n*"
In*#'&+ccin: !lg(nos g2neros bacterianos, entre los (e destacan Sporosarcina, Clostridium y Bacillus, $rod(cen en s( interior for4as de resistencia deno4inadas endos$oras5 'e $rod(cen c(ando las condiciones a4bientales son desfavorables 6agota4iento de los n(trientes, te4$erat(ras e"tre4as, radiaciones, co4$(estos tó"icos, etc57 for4ándose (na es$ora $or cada for4a vegetativa5 !l finali%ar el $roceso de es$orog2nesis, la c2l(la vegetativa se lisa y libera la es$ora al e"terior5 C(ando el a4biente es favorable, la es$ora ger4ina generando (na n(eva for4a vegetativa5 La ca$acidad de ger4inar $erd(ra d(rante a8os5 !lg(nas de las bacterias $rod(ctoras de endos$oras son $atógenas $ara el .o4bre, $or lo (e s( est(dio y observación son de enor4e inter2s5 La $ared cel(lar de la endos$ora $resenta distinto co4$orta4iento (e la 4e4brana bacteriana frente a la tinción, $or lo (e se (tili%an t2cnicas es$eciales de coloración Debido a esto el $roceso de tinción si4$le no es 4(y efectivo, se (tili%an otros 4edios $ara $oder te8ir adec(ada4ente estas estr(ct(ras5 9n este caso se (san las conocidas tinciones ácido resistentes, en esta $ráctica se ven las (e sig(en la 4etodología de 'c.aeffer : (lton y Dorner5
M$*"#i$%": T2cnica de D;rner < < < < < <
C(ltivos de + .oras de Bacillus s$5 !ceite de in4ersión !sa de =;lle >a8o de ag(a a *00? C Lá4inas $orta ob@eto 'ol(ciones colorantes Carbof(csina Tinta C.ina < T(bos con ag(a destilada est2ril
T2cnica de 'c.aeffer y (lton < < < < < < < <
C(ltivos de + .oras de Bacillus s$5 !ceite de in4ersión !sa de =;lle Lá4inas $orta ob@eto Mec.ero de alco.ol Ain%a Aa$el secante 'ol(ciones colorantes Carbolf(csina Verde 4ala(ita < 'ol(ción decolorante !lco.ol ácido
La $re$aración del alco.ol ácido es /B $or *00 conteniendo 15B $or *00 de # 6'eeley : Van De4arcEF */175
3
M"*'&'%',-$: T2cnica de D;rner *5 Are$arar (na s(s$ensión de c2l(las Bacillus sp. , (sando el asa de E;lle, en 05B 4l de ag(a est2ril en (n t(bo de $r(eba5 15 !8adir ig(al vol(4en de carbolf(csina y se colocar el t(bo en ba8o 4aría $or die% 4in(tos5 35 Transferir (na gota de la s(s$ensión de c2l(las coloreadas al e"tre4o de (n $ortaob@etos, agregar (na gota de tinta c.ina y con ay(da de (n c(breob@etos e"tender la 4e%cla, varias veces .asta obtener (na delgada $elíc(la5 +5 'ecar la lá4ina con $a$el toalla dando $e(e8os to(es y agregar aceite de in4ersión5 B5 inal4ente $asar a e"a4inar al 4icrosco$io ba@o (n ob@etivo de in4ersión5
T2cnica de 'c.aeffer y (lton *5 i@ación de la 4(estra de Bacillus s$5 9n la lá4ina $ortaob@eto agregar (na gota de ag(a destilada5 L(ego de esterili%ar el asa de =;lle con ay(da del 4ec.ero de alco.ol 6constante4ente $rendido .asta ter4inar con la fi@ación7, e"traer el algodón est2ril (e c(bre al c(ltivo y esterili%ar la bo(illa del t(bo con Bacillus s$5, des$(2s con ay(da de la asa sacar (n $e(e8a cantidad de 4(estra y es$arcirla enci4a de la gota de ag(a en el $ortaob@etos5 'eg(ida4ente, volver a esterili%ar la bo(illa del t(bo con el c(ltivo y cerrar con algodón $ara l(ego esterili%ar el asa de =;lle5 inal4ente secar $a(latina4ente la 4(estra (tili%ando el calor $ro$orcionado $or el 4ec.ero5 15 !$licar el colorante $ri4ario, carbolf(csina, en e"ceso5 35 Con ay(da de la $in%a, calentar el $ortaob@etos con el colorante ya agregado (tili%ando la lla4a del 4ec.ero .asta observar va$ores5 Mantener esta te4$erat(ra $or tres 4in(tos, $(ede ay(darse a(4entando colorante $oco a $oco5 +5 Lave la 4(estra .asta (e vea (e no se des$rende 4ás colorante5 B5 !gregar el decolorante, alco.ol ácido gota a gota entre seis a oc.o gotas .asta notar (e no se des$rende 4ás colorante5 5 9n@(ag(e con ag(a5 5 !gregar el colorante de contraste, verde 4ala(ita, en e"ceso $or dos 4in(tos5 5 9n@(ag(e con ag(a5 /5 'e(e la 4(estra con ay(da de $a$el secante5 *05 !gregar aceite de in4ersión5 **5 #bservar a *000"5
R"+%*$&':
T2cnica de D;rner Bacillus sp
G.A. /000X
ig(ra *5 9s$ora central
T2cnica de 'c.aeffer y (lton
Bacillus sp 9s$oras te8idas con carbolf(csina5 C2l(la Vegetativa te8ida con verde 4ala(ita5
G.A. /000X
Dic+in: Tinción de D;rner Aara te8ir la endos$ora se (tili%ó la t2cnica Hie.l-eelsen, este 42todo consiste en a$licar fenol y calor $ara (e la f(csina básica $enetre en la endos$ora5 La f(csina fenol o carbof(scina caliente es ca$a% de te8ir todo ti$o de c2l(las bacterianas, ade4ás el fenol facilita la $enetración de la f(csina en la $ared cel(lar 6Ga4a%o C5, Ló$e%-Go8i : Día% I5, 100/75 Con el fin de vis(ali%ar la es$ora, se tiene (e decolorar la c2l(la vegetativa5 Aor esta ra%ón la t2cnica de D;rner .ace (so de la tinta c.ina co4o decolorante y a s( ve% co4o ele4ento $rinci$al de tinción negativa5 Las c2l(las vegetativas a$arecen co4o c(er$os brillantes rodeados $or (n fondo a%(lnegro debido a (e las $artíc(las de la tinta no $(eden $enetrar a la bacteria 6Aresscott, arley : =lein, 100175
Tinción de 'c.aeffer y (lton
9l $ri4er tinte (tili%ado es la carbolf(csina, esta será la c(l$able de la tinción de la endos$ora5 La carbolf(csina es (n colorante fenificado, esto e"$lica $or(2 tiene (na alta reactividad ya (e el ácido fenólico tiene (tilidad de 4ordiente, refor%ando la acción de tinción 6García, Aaredes : ernánde%, *//+75 Las endos$oras son estr(ct(ras resistencia y latencia, ante (na tinción si4$le o gra4 estas no son te8idas $(es $oseen c(biertas a base de $roteínas (e le otorgan (na i4$er4eabilidad o la $resencia del ácido di$icolínico (e le daría (na $osible resistencia t2r4ica 6Tortora, (nEe : Case, 100F 'Ja4y, 10075 Aor lo (e $ara s( tinción es necesaria la $resencia de calor l(ego de agregar el tinte de alta reactividad5 9sto 4odificará la $er4eabilidad de las ca$as de la endos$ora ay(dando a la $enetración de la carbolf(csina 6Vás(e%, Martín, 'iloní% : 'errano, 10*075 9n este $rocedi4iento es necesario el (so de (n colorante de contraste, el c(al $er4itirá te8ir a la c2l(la vegetativa5 9n esta $ráctica se .i%o (so del verde 4ala(ita, (n colorante derivado de la anilina, (e $osee tres anillos benc2nicos 6ig5 17F es (n colorante d2bil4ente básico 6tiene (na carga $ositiva d2bil7 y $or tanto, se (ne d2bil4ente a la bacteria 6'ánc.e% et al , 10*375
ig(ra 15 9str(ct(ra de la 4ol2c(la de Verde Mala(ita5
D"*"#1in$cin &" %$ M+"*#$:
Aara la deter4inación de la es$ecie $erteneciente al g2nero Bacillus, (sado en el laboratorio, (tili%a4os 1 criterios *7 Aor la $osición de la es$ora dentro de la c2l(la vegetativa 6Madigan, et. al , 100/7 - Central - Ter4inal
17 !de4ás nos basa4os en otro libro, el Man(al de >ergey de >acteriología deter4inativa, (e nos tiene los sig(ientes criterios K7 9s$orangio no .inc.ado5 9s$oras cilíndricas o eli$soides centrales o ter4inales5 9s$oras no te8idas fácil4ente5 Gra4-$ositivas5 K5*7 Diá4etro 4ayor o ig(al a 05/ 4icras Bacillus cereus, Bacillus anthracis, Bacillus thuringiensis y Bacillus megaterium. K517 Diá4etro 4enor a 05/ 4icras Bacillus subtilis y Bacillus licheniformes5
'e concl(ye (e Bacillus anthracis no es n(estra 4(estra ya (e es $atógena y es 4(y $oco $robable (e la se .aya 4ani$(lado esta es$ecie en el laboratorio sin la ind(4entaria necesaria 5Ari4ero se deter4inó (e la bacteria $osee (na es$ora central 6ig5 *7 $ero no en $osición ec(atorial sino casi (na s(bter4inal, $ero esto no es s(ficiente5 Aor eso (tili%a4os el seg(ndo criterio $ara esto necesita4os $oder deter4inar s( ta4a8o, la 4etodología (e (sa4os f(e $ri4ero deter4inar el ta4a8o del ca4$o vis(al $ara 4ediante (na $ro$orción $oder conocer el ta4a8o de n(estra bacteria, este dato se conocía de (n e"$eri4ento anterior y es *+ 4icras $ara *000 a(4entos5 L(ego, con (n softJare se 4idió los $í"eles (e confor4an a la bacterias y se co4$aró con los $i"eles (e confor4an el ca4$o vis(al y se deter4inó (e a$ro"i4ada4ente la bacteria 4ide 05 4icras5 Con estos datos $ode4os deter4inar (e la bacteria es Bacillus subtilis $ero $ode4os conf(ndirla con Bacillus cereus debido a esto se necesitan 4ás $r(ebas $ara co4$robar esta aseveración 6>reed et. al , */B75
E##'#" "23"#i1"n*$%":
9n la t2cnica de D;rner al 4o4ento de es$arcir la tinta c.ina no se .i%o con 4(c.a
delicade%a, debido a eso no se observó de 4anera tan adec(ada5 !de4ás, se (tili%ó 4(c.a tinta c.ina5 Aara la deter4inación de la es$ecie de Bacillus sp, el criterio del diá4etro (e se (tili%ó no es 4(y confiable debido a (e no se 4idió en ese instante sino se (só (n dato antig(o, ade4ás de reali%ar $r(ebas de 4otilidad, co4$onente de $ared 6ácidos grasos7F cantidad de GC, etc5 $ara (e sea confiable5 !de4ás la tinción no ay(do 4(c.o ya (e no se reali%ó satisfactoria4ente 6>reed et. al , */B75
C'nc%+i'n": *5 La tinción de Dorner es (na tinción diferencial ácido-resistente (e $er4ite la
observación de las endos$oras dentro de (na c2l(la bacteriana en s( fase de es$or(lación, $(diendo a$reciarse la endos$ora de (na 4anera 4(y nítida y resaltante debido a (e la estr(ct(ra vegetativa (eda incolora, a diferencia de la tinción de 'c.aeffer y (lton donde no se observaron las endos$oras clara4ente5 15 La tinción de 'c.arffer y (lton $(ede res(ltar 4ás co4$licada de reali%ar $or el .ec.o de tener (e 4antener (na te4$erat(ra constante $or tres 4in(tos, $(es si no se llega a eso, el tinte no $enetrará la endos$ora y si .ay (n e"cedente de te4$erat(ra o tie4$o, la c2l(la se $odrá destr(ir5 'in e4bargo, c(ando no .ay errores e"$eri4entales la tinción res(lta 4(y til $(es se ve la diferencia de colores entre la bacteria y s( res$ectiva endos$ora5 35 'egn n(estro análisis, la 4(estra es $osible4ente Bacillus subtilis $ero $(ede ser ade4ás Bacillus cereus (e se conf(nde a 4en(do con Bacillus subtilis.
R"!"#"nci$ Bi4%i',#5!ic$:
>reed I5, M(rray 95 : '4it. 5 */B5 >ergeys Man(al of Deter4inative >acteriology5 T.e Nillians : NilEins Co4$any5 A$ *35
Ga4a%o C5, Ló$e%-Go8i, Día% I5 100/5 Man(al $ráctico de Microbiología Tercera edición5 9ditorial 9lsevier Masson5 9s$a8a5 K'> /-+-+B-*B*//5
García, A5, Aaredes, 5, ernánde%, M5 *//+5 Microbiología Clínica $ráctica5 'eg(nda 9dición5 'ervicio A(blicaciones OC!5 9s$a8a5 A$5 30-+35
Madigan M, MartiEo P : AarEer P5100/5 >iología de los Microorganis4os5 D2ci4a 9dición5 Arentice all5 >arcelona5 A$5 +/-+//5
Aresscot, L5M5, arley, P5A5, =lein D5!5 10015 Microbiology5 Bt. edition5 McGraJ-ill ig.er 9d(cation5
'ánc.e% !5, Ga4a%o C5, Ca4ac.o !5 10*35 Microbiología basada en la e"$eri4entación5 9ditorial 9lsevier Masson5 9s$a8a5 K'> /-+-/011-0B-5 A$5 B-*05
'Ja4y A5M5 1005 Laboratory Man(al on >iotec.nology5 Iastogi A(blications5Kndia5 13* $5 K'> /Q*Q*33Q/*Q*5
Tortora, G5, (nEe, >5, Case, C5 1005 Kntrod(cción a la Microbiología5 9ditorial M2dica Aana4ericana5 >(enos !ires, !rgentina5 A$5 *5
Vá%(e%, C5, Martín, !5, 'ilóni%, M5, 'errano, '5 10*05 T2cnicas básicas de Microbiología5 #bservación de >acterias5 Ied(ca 6>iología75 'erie Microbiología5 3 6B7 *B-35 K'' *//-3105
