Tinción diferencial ácido resistente

“Año del Buen Servicio al Ciudadano”

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

Facultad de Ciencias-Departamento Académico de Biología

INFORME N° 3 TINCION DIFERENCIAL ACIDO-RESISTENTE

INTEGRANTES: 201 21006

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Arana Ochoa, Giancarlo

20130337

Macedo Guerrero, Carmen

20140162

Martínez Parra, Gabriel

20150115

Rojas Castañeda, María Elena

20160451

Maita Noel, Javier Palermo

CURSO:

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Laboratorio de Microbiología DOCENTE: Roberto Ramos Chaupín

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Mesa 3

2017-I Introducción


Facultad de Ciencias-Departamento Académico de Biología La tinción acido resistente se utiliza principalmente para ciertos parásitos y bacterias que tienen un alto contenido de ácidos grasos (ácidos micolicos) de cadena larga (50 a 90 átomos de carbono) en su pared celular, lo cual les confiere la propiedad de resistir la decoloración con alcohol-ácido. (Santambrosio, 2009) Los microbiólogos microbiólogos utilizan esta tinción tinción para identificar identificar a todas las las bacterias bacterias del género Mycobacterium, que comprende dos patógenos importantes: Mycobacterium tuberculosis, el agente causal de la tuberculosis, y Mycobacterium leprae, el agente causal de la lepra. (Tortora G. J., 2007) Este tipo método también se utiliza para la diferenciación de estructuras resistentes como las endoporas, estructuras resistentes capaces de sobrevivir por largos periodos en ambientes desfavorables permitiendo a los microorganismos sobrevivir hasta que las condiciones exteriores sean favorables para el desarrollo. Los géneros de bacterias capaces de esporular hasta ahora descritos son Bacillus, Clostridium y Sporosarcina. (Stanier, Ingraham, & Wheelis, 1991) Estructuralmente la endospora está formada por: El córtex o corteza, compuesto por peptidoglicano. La cubierta está formada por una proteína similar a la queratina con gran cantidad de puentes puentes disulfuro. El exosporium es de naturaleza naturaleza lipoprotéica. Asimismo poseen en su su composición química una alta concentración de dipicolinato de calcio. (Stanier, Ingraham, & Wheelis, 1991) Existen diversas técnicas para detectar las endosporas, las que más destacan entre ellas son las técnica de Dorner y la de Schaeffer y Fulton. En esta práctica se harán uso de estas dos, con la técnica de “Dorner” se apreciará que la espora se se tiñe de color rojo, la parte vegetativa incolora incolora y toda la estructura aparece sobre un fondo o scuro, y con la técnica de “Schaeffer y Fulton” la espora se tiñe de rojo y la parte vegetativa de verde.

OBJETIVOS Distinguir a través de dos técnicas de tinción tinción diferencial la presencia de endosporas bacterianas y diferenciarlas de las estructuras vegetativas normales

MARCO TEÓRICO


Facultad de Ciencias-Departamento Académico de Biología Algunas bacterias, son capaces de producir formas de resistencia a través de un proceso llamado esporulación. Este proceso de diferenciación está c odificado genéticamente y permite a los microorganismos sobrevivir hasta que las condicio nes exteriores sean favorables para el desarrollo. (Stanier, Ingraham, Wheelis, & Painter, 1991) Los géneros de bacteria capaces de esporular, hasta ahora descritos, son: Baci llus, Clostridium y Sporosarcina: por lo cual la presencia de esporas en una bacteria es de gran utilidad taxo nómica. Las endosporas son células metabólicamente en estado de dormancia compuestas de un núcleo parcialmente deshidratado rodeado de capas protectoras concéntricas. Se desarrolla dentro de la “célula madre vegetativa”

Estructuralmente, las esporas bacterianas están rodeadas por gruesas envolturas y tienen muy bajo contenido de agua. El genoma está contenido en un núcleo deshidratado en el que Ca+2 reemplaza a casi todo el agua, lo cual la hace resistente a la desecación, por otro lado, la resistencia a radiación UV del ADN es conferida por la acción de Cot A, una enzima que genera un pigmento similar a melanina (Eichenberger, McKenney, & Adam, 2012). El córtex o corteza, está compuesto por un peptidoglicano que contiene menos enlaces cruzados que el correspondiente a la pared celular. La cubierta está formada por una proteína del tipo de la queratina con gran cantidad de puentes disulfuro. disulfuro. Esta capa es fundamental para la resistencia del esporo a los agentes físicos y químicos. El exosporium es de naturaleza lipoproteica. Asimismo, poseen en su composición química una alta concentración de dipicolinato de calcio, que es una sustancia que no se encuentra en las células vegetativas, y que estaría estaría involucrada en la eliminación de agua durante el proceso de esporulación. (Joklik, Willet, & Amos, 1983)

Ilustración 1: Ultraestructura de la endospora de Bacillus subtilis (Eichenberger, McKenney, & Adam, 2012)


Facultad de Ciencias-Departamento Académico de Biología Las características antes apuntadas, dan cuenta de la resistencia de las esporas a los agentes físicos y químicos y de la dificultad que presentan para ser coloreados. Cabe aclarar que una vez coloreados son difíciles de decolorar. Existen variantes como la tinción de Moller, donde carbolfucsina es el tinte primario y azul de metileno es el contrastante (Sandle, 2016). Así también se aplican técnicas de fluorescencia simple, como la desarrollada por Schichnes et al (2006) usando naranja de acridina (Schichnes, Nemson, & Ruzin, 2006).

Ilustración 2: Tinción con naranja de acridina

Para la coloración de esporas, según Dorner, se sensibiliza y colorea a la espora con fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina es una mezcla de tintes negros sintéticos producidos por calentamiento de una mezcla de nitrobenceno anilina e clorhidrato de anilina. Se utiliza industrialmente como colorante de lacas y barnices. Su sulfonación produce un tinte soluble aniónico, nigrosina WS. (Willey, 2017). Actuará extrayendo el colorante de todas las estructuras celulares excepto de las esporas y por consiguiente, se verán las esporas rojas, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro. Si bien es cierto que con otras coloraciones las esporas se verán incoloras, en algunos casos las bacterias pueden presentar zonas sin colorear que no corresponden a esporas y debe confirmarse su presencia mediante una coloración específica. Otro aspecto que debe tenerse en cuenta al observar esporas es su posición: t erminal, subterminal o central, y si deforman o no a la bacteria; ya que serán características que ayudarán en la clasificación. (Stanier, Ingraham, Wheelis, & Painter, 1991) La tinción de Schaelffer y Fulton emplea a la carbolf ucsina como colorante primario, el cual es eliminado posteriormente del resto de la célula bacteriana, pero no de la espora, mediante un enjuague con una solución decolorante: alcohol ácido. Como contratinción se emplea el colorante verde malaquita, el cual tiñe la célula vegetativa. (Rodríguez, Gamboa, Hernández, & García, 2005)



PARTE EXPERIMENTAL Técnica de Dörner

1. Extraer la muestra con el asa de kölle

2. Colocar la muestra en 1 ml de H O aprox.

3. Verter un volumen similar de carbol

4. Mantener la muestra en un recipiente con

fucsina

5. Transferir una gota de muestra a un portaobjeto

2

agua hirviendo (30 minutos)

6. Agregar gotas de nigrosina.

d



7. Realizar un frotis con otro portaobjeto

8. Dejar secar, añadir aceite de inmersión y observar al microscopio.

Técnica de Schaeffer y Fulton

1. Fijar la muestra

2. Añadir carbolfucsina. Mantener el portaobjeto

3. Lavar 2 veces con alcohol ácido y

4. Añadir verde malaquita y dejar actuar ( 30

enjuagar con H2Od

cerca al mechero evitando secar el colorante (3 minutos)

segundos)



5. Enjuagar con H O 2

d

OBSERVACIONES

6. Dejar secar, añadir aceite de inmersión y observar al microscopio.



DISCUCIONES Como se ve en Resultados, el gráfico de las bacterias Bacillus cereus que formaron endosporas y fueron sometidas a dos clases de tinción diferencial ácido-resistente: la técnica de Dörner y la de Schaeffer y Fulton. En ambas técnicas se emplean como colorante primario a la carbolfucsina, que contiene ácido bórico, fenol, resorcinol, fucsina, acetona, alcohol y agua; pero la primera lo complementa con calor proveniente de un baño María de 15 minutos y la segunda somete el portaobjetos con la muestra directamente al calor. El fenol de la carbolfucsina y el calor suministrado en ambos casos ayuda a que el colorante penetre en las bacterias, pero la diferencia entre el modo de suministro de calor (directo e indirecto) se reflejan en el tamaño y volumen de éstas. Después de aplicar la técnica de Dörner, podemos apreciar que las bacterias son más grandes ya que la parte vegetativa de la célula n o se deshidrató tanto como en la técnica de Schaeffer y Fulton. Otra característica resaltante viene a ser el uso de tinta china como agente decolorante y de tinción negativa en la técnica de Dörner. L a tinta china es una suspensión de partículas de carbono coloidal que decolora la parte vegetativa de las células pero no la endospora ya que la corteza de ésta que se encuentra en su membrana contiene peptidoglucano y más las otras complejas estructuras causan una impermeabilidad que impiden la decoloración de la endospora. Además, se dice que la tinta china genera una tinción negativa ya que al no tener afinidad por ninguno de los constituyentes celulares, y por ser una sustancia opaca a los fotones simplemente rodea a la célula mostrando el perfil de éstas. En la imagen de la bacteria sometida a la técnica de Dörner se puede p uede apreciar claramente 3 de éstas en medio de un ambiente opaco que vendría a ser la


Facultad de Ciencias-Departamento Académico de Biología tinta china, aunque las endosporas no se aprecian tan nítidamente ya que posiblemente la luz que emana el microscopio incida directamente sobre éstas impidiendo su visión, o quizá no se haya teñido lo suficiente por falta de calor (ya que el suministro es indirecto) como para que se note. En la técnica de Schaeffer y Fulton se emplea como solución decolorante alcohol y HCl al 3%, que al igual que en la anterior técnica solo logra decolorar la parte vegetativa y se enjuaga inmediatamente para que el alcohol no interfiera en la acción del colorante de contraste, en este caso, verde malaquita (C 23H25N2Cl) que es un colorante débilmente básico (tiene una carga positiva débil) y por tanto, se une débilmente a la bacteria, penetrando en la parte vegetativa de ésta. En la imagen que muestra los resultados obtenidos al aplicar ésta técnica, se aprecia claramente la parte vegetativa de las células, pero las endosporas solo se notan en algunas cuantas, y de color violeta producto de la combinación del verde malaquita con la carbolfucsina. También se ven, aunque no nítidamente algunas endosporas libres producto de la drástica deshidratación de la parte vegetativa o una posible lisis de éstas. é stas. Bacillus cereus es una bacteria perteneciente al género Bacillus. Vista al microscopio, es

un bastón alargado, gram positivo que es mótil por medio de flagelos perítricos. Una endospora simple de esta especie puede formarse en posición central o p aracentral sin hinchar el esporangio.

CONCLUSIONES ●

Como se pudo notar en la práctica, la compleja y resistente estructura de las endosporas hace que no sea fácil su tinción ni su decoloración.

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La parte vegetativa de la célula es fácilmente teñible y sensible a cambios bruscos de temperatura pudiendo hacer lisis, aunque también es sensible a cambios drásticos en otros parámetros como pH, radiación, etc.

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Se empleó la carbolfucsina en ambas tinciones como colorante primario ya que es altamente reactivo y además el fenol contenido en su interior actuó como mordiente.

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En algunos casos, se excedió el suministro de calor en la técnica de Schaeffer y Fulton por lo que las partes vegetativas de algunas células reventaron quedando solo sus respectivas endosporas.

CUESTIONARIO


Facultad de Ciencias-Departamento Académico de Biología 1. ¿Cuál de los métodos utilizados le permitió observar mejor mejor las endosporas bacterianas? ¿A qué atribuye la diferencia?

La técnica de Dörner es muy aplicada en los trabajos de observación en endosporas bacterianas. bacterianas. En esta técnica se emplea la carbolfucsina como colorante de la endospora llevado a baño maría, donde solo se tiñe tiñe la parte de la endospora pero pero no la zona vegetativa, para poder lograr lograr verla se recurre a la nigrosina la cual no tiene afinidad con los componentes celulares, por tanto no penetra al interior de la célula solo se observa alrededor de ella como una mancha negra inmersa en ella partes incoloras con puntos rojos que serían las endosporas. La técnica técnica de Scheffer y Fulton se diferencia diferencia del método Dörner en la tinción de la parte parte vegetativa. La parte vegetativa en éste método resulta teñida, la endospora es teñida por la carbolfucsina de color rojo, mientras la zona vegetativa se tiñe gracias a la verde malaquita quien brinda una coloración de azul-verdoso. Toda la célula se diferencia tanto parte vegetativa y la endospora cada uno con deferente coloración . Por lo tanto al grupo de trabajo le pareció más efectiva la segunda técnica (Scheffer y Fulton) porque nos permite observar el tamaño de las bacterias, su forma y poder diferenciarlas con colorantes distintos (carbolfucsina y verde malaquita), además de ser la técnica que mayor cantidad de grupos de trabajos pudo efectuar satisfactoriamente.

2. ¿Qué efecto produciría el reemplazar alcohol acido por otro decolorante como el alcohol acetona?

En la segunda técnica utilizada, se usó el alcohol acido como decolorante de carbolfucsina en la muestra Bacillus sp, con la finalidad de dejar teñidas con el primer colorante a todas aquellas bacterias con capacidad acido resistente, es decir, resistentes a la decoloración de la fucsina debido a la alta concentración de ácido micólico en la pared celular. En las bacterias que no son ácidoalcohol resistentes las paredes carecen de componentes lipídicos y la carbolfucsina se elimina con facilidad durante la decoloración, lo que deja a las células incoloras. Si hubiésemos usado la mezcla de alcohol/acetona, el cual es un solvente lipídico y disolvería la membrana exterior de la pared de la célula (lipídica), no tendría el mismo efecto puesto que este se debe utilizar tras tratamiento con un colorante básico y la carbolfucsina es un colorante ácido

3. ¿Qué otros géneros de bacterias pueden formar endosporas?

Ciertos géneros de bacterias Gram-positivas, tales como Bacillus, Clostridium, Sporohalobacter , Anaerobacter y Heliobacterium, pueden formar endosporas. Las endosporas son estructuras durmientes altamente resistentes cuya función primaria es sobrevivir cuando las condiciones ambientales son adversas. En casi todos los casos, las endosporas no forman parte de un proceso reproductivo, aunque Anaerobacter puede puede formar hasta siete endosporas a partir de una célula. Las endosporas tienen una base central de citoplasma que contiene DNA y ribosomas, rodeada por una corteza y protegida por una cubierta impermeable y rígida. Las endosporas no presentan un metabolismo detectable y pueden sobrevivir a condiciones


Facultad de Ciencias-Departamento Académico de Biología físicas y químicas extremas, tales como altos niveles de luz ultravioleta, rayos gamma, detergentes, desinfectantes, calor, presión y desecación. En este estado durmiente, las bacterias pueden seguir viviendo durante millones de años, e incluso pueden sobrevivir en la radiación y vacío del espacio exterior. Las endosporas pueden también causar enfermedades. Por ejemplo, puede contraerse carbunco por la inhalación de endosporas de Bacillus anthracis y tétanos por la contaminación de las heridas con endosporas de Clostridium tetani .

4. Revise otras técnicas de tinción de esporas y compárelas con las usadas en este ejercicio. (b) Fotografía al microscopio electrónico de una

Clostridium Granados y Villaverde (1996) mencionan el método de Wirtz donde se observaran lasbotulinum. esporas verdes entre

endospora de Bacillus sphaericus

las bacterias que presentan un color rojo; y le método de Moeller donde se ven las esporas rojas sobre las células bacterianas que presentan un color azul .

Existen diferentes métodos de tinción en donde se puede visualizar las endosporas de una forma implícita ya que estas no se tiñen tan fácilmente. Por ejemplo si utilizamos un cultivo viejo y la tinción de Gram, Rodamina-Auramina, Naranja de Acridina, Ziehl-Neelsen, etcétera. Se observará un espacio sin colorear que sería la endospora y la bacteria coloreada. Sin embargo, las mejores técnicas para tinción específicamente de endosporas son las usadas en esta práctica.



BIBLIOGRAFIA

Eichenberger, P., McKenney, P., & Adam, D. (2012). The Bacillus subtilis endospore: assembly and functions of the multilayered coat. Nature, 33-42. Granados, R., & Villaverde, C. (1996). Microbiología. Madrid, Expaña: Paraninfo. Sandle, T. (2016). Pharmaceutical microbiology: Essentials for quality assurance and quality control. Elsevier. Santambrosio, E. (2009). Tinción y observación de microorganismos. Buenos Aires: Universidad Tecnológica Nacional. Schichnes, D., Nemson, J., & Ruzin, S. (2006). Fluorescent Staining Method for Bacterial endospores. MICROSCOPE , 91-93.

Stanier, R. Y., Ingraham, J. L., & Wheelis, M. L. (1991). Microbiología. Barcelona-España: Reverté. Tortora, G. (1993). Introducción a la microbiología. Zaragoza: Acribia S. A. Tortora, G. J. (2007). Introduccion a la microbiologia. Buenos Aires-Argentina: Panamericana. Willey, J. (2017). Prescott's Principles of Microbiology: Biology, Microbiology. Content technologies.

Tinción diferencial ácido resistente

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