Teori Te ori Spektrofotometri Sp ektrofotometri
Spektrofotometri UV-Vis adalah pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel. Sinar ultraviolet ultraviolet dan cahaya tampak memiliki energi yang cukup untuk mempromosikan elektron pada kulit terluar ke tingkat energi yang lebih tinggi. Spektrum UV-Vis mempunyai bentuk yang lebar dan hanya sedikit informasi tentang struktur yang bisa didapatkan dari spektrum ini. Tetapi spektrum ini sangat berguna untuk pengukuran secara kuantitatif. Konsentrasi dari analit di dalam larutan bisa ditentukan dengan mengukur abso absorb rban an pada pada panja panjang ng gelom gelomban bang g tert tertent entu u denga dengan n mengg mengguna unakan kan hukum hukum Lamb Lamber ertt-e eer er !"achriyanus# $%%&'. Sinar Ultraviolet mempunyai panjang gelombang antara $%%-&%% nm# sementara sinar tampak mempunyai panjang gelombang &%%-(%% nm !"achriyanus# $%%&'.
Radiasi elektromagnetik (REM) (REM) )adiasi elektromagnetik adalah energi yang dipancarkan menembus ruang dalam bentuk gelombang-gel gelombang-gelombang. ombang. Untuk menggambarkan menggambarkan sifat-sifat sifat-sifat )*+# digunakan digunakan $ teori yang saling saling melengkapi yaitu teori panjang gelombang dan teori korpuskuler. Teori panjang gelombang digunakan untuk menerangkan beberapa parameter )*+ yang berupa kecepatan# frekuensi# panjang gelombang# dan amplitude# dan tidak dapat menerangkan fenomena-fenomena yang berkaitan dengan serapan atau emisi dari tenaga tenag a radiasi. Untuk proses ini# maka diperlukan teori korpuskuler yang menyatakan bah,a radiasi elektromagnetik sebagai partikel yang bertenaga yang disebut foton. Tenaga foton berbangding langsung dengan frekuensi radiasi. da $ teori yang digunakan
1. Teori ori panja panjang ng gelomb gelombang ang dan dan kece kecepa patan tan )*+ juga juga dicirik dicirikan an dengan dengan frekue frekuensi nsi
!bany !banyak akny nyaa daur daur..ling lingkar kar lengk lengkap ap tiap tiap deti detik' k'.. )adi )adias asii deng dengan an frek frekuen uensi si lebi lebih h tingg tinggii mengandung gelombang lebih banyak per detik. /ubungan antara panjang gelombang dan frekuensi adalah sbb 0 cv1 cv1 v 1 frekuensi !/ert2' ( 3 1 cepat rambat gelombang !456% m7s'
0 1 panjang gelombang !cm' 2. Teori partikel atau foton
- 3ahaya adalah sumber energi - )*+ dipancarkan dalam bentuk paket-paket energi yang menyerupai partikel yang disebut foton atau kuantum. *nergi suatu foton memiliki hubungan sebagi berikut hvE 1 * 1 energi foton / 1 tetapan Planck Suatu molekul memiliki panjang gelombang sendiri-sendiri. 8anjang gelombang suatu molekul memiliki panjang gelombang yang tetap untuk terjadinya absorbansi yang maksimum.
Kromofor
9 erasal dari kata 3hromophorus yang berarti pe mba,a ,arna 9 "alam pengertian yang dikembangkan# kromofor merupakan suatu gugus fungsi yang menyerap radiasi elektromagnetik apakah gugus itu ber,arna atau tidak 9 "igunakan untuk menyatakan gugus tidak jenuh kovalen yang dapat menyerap radiasi dalam daerah-daerah ultraviolet dan terlihat
Auksokrom
9 Suatu subtituen pada kromofor yang menghasilkan pergeseran merah 9 3iri auksokrom adalah heteroatom yang langsung terikat pada kromofor# misalnya -:3/ # 4 -3l# -:/# ;/ . $ 9 3ontoh pada konjugasi pasangan electron bebas pada atom nitrogen dari enamina akan mengeser serapan maksimum dari harga ikatan ganda terisolasi pada 6<%nm ke $4%nm. Subtituen nitrogen adalah auksokrom. Suatu auksokrom akan memperpanjang kromofor dan menghasilkan suatu kromofor baru.
8ergeseran merah atau efek batokromik merupakan pergeseran serapan maksimum ke panjang gelombang lebih panjang. /al ini dapat disebabkan oleh perubahan pelarut atau adanya suatu auksokrom. =eseran ke panjang gelombang yang lebih panjang mencerminkan fakta
bah,a electron dalam suatui system tergabung !terkonjugasi' kurang kuat terikat daripada dalam suatu system tak tergabung. 8ergeseran biru atau efek hipokromik merupakan pergeseran ke panjang gelombang lebih pendek. /al ini disebabkan oleh perubahan pelarut atau adanya konjugasi dari electron pasangan bebas pada atom nitrogen anilia dengan system ikatan > cincin ben2ene dihilankan dengan adanya protonasi. nilia menyerap pada $4%nm ! ? (@%%' tetapi dalam larutan asam puncak utamanya hamper sama dengan ben2ene yaitu $%4nm ! ? AB%%'# terjadi pergeseran biru. *fek hiperkromikCkenaikan dalam intensitas serapan *fek hipokromikCpenurunan dalam intensitas serapan erkas radiasi dikenakan pada cuplikan dan intensitas radiasi yang ditransmisikan diukur. )adiasi yang diserap oleh cuplikan ditentukan dengan membandingkan intensitas dari berkas radiasi yang ditransmisikan bila spesies penyerap tidak ada dengan intensitas yang ditransmisikan bila spesies penyerap ada. Kekuatan radiasi dari berkas cahaya sebanding dengan jumlah foton per detik yang melalui satu satuan luas penampang. Dika foton yang mengenai cuplikan tenaga yang sama dengan yang dibutuhkan untuk menyebabkan terjadinya perubahan tenaga# maka serapan dapat terjadi. Tingkat kejadian absorbsi tergantung pada 9 Darak yang diarungi radiasi mele,ati larutan itu 9 8anjang gelombang radiasi 9 Sifat dasar spesies molekul dalam larutan
Hukum Lambert-Beer
/ukum Lambert-eer !eerEs la,' adalah hubungan linearitas antara absorban dengan konsentrasi larutan analit !"achriyanus# $%%&'. +enurut hukum Lambert# serapan !' berbanding lurus dengan ketebalan lapisan !b' yang disinari 1 k. b "engan bertambahnya ketebalan lapisan# serapan akan bertambah. +enurut /ukum eer# yang hanya berlaku untuk cahaya monokromatis dan larutan yang sangat encer# serapan !' dan konsentrasi !c' adalah proporsional
1 k. c Dika konsentrasi bertambah# jumlah molekul yang dilalui berkas sinar akan bertambah# sehingga serapan juga bertambah. Kedua persamaan ini digabungkan dalam hukum Lambert-eer# maka diperoleh bah,a serapan berbanding lurus dengan konsentrasi dan ketebalan lapisan 1 k . c. b Umumnya digunakan dua satuan c !konsenterasi 2at yang menyerap' yang berlainan# yaitu gram per liter atau mol per liter. ;ilai tetapan !K ' dalam huku m Lambert-eer tergantung pada sistem konsentrasi mana yang digunakan. ila c dalam gram perliter# tetapan tersebut disebut dengan absorptivitas !a' dan bila dalam mol per liter tetapan tersebut adalah absorbtivitas molar !'. Dadi dalam sistem yang direkombinasikan# /ukum Lambert-eer dapat mempunyai dua bentuk ∈ 1 a. b. c g7liter atau 1 . b. c mol7liter ∈ 8enandaan lain untuk a adalah ekstingsi spesifik# koefisien ekstingsi# dan absorbsi spesifik# sedangkan adalah koefisien ekstingsi molar !"ay and Under,ood# 6<<<'. ∈ da beberapa hal yang harus diperhatikan dalam analisis dengan spektrofotometri ultraviolet yaitu 6. 8enentuan panjang gelombang serapan maksimum
8anjang gelombang yang digunakn untuk analisis kuantitatif adalah panjang gelombang dimana terjadi absorbansi maksimum. Untuk memperoleh panjang gelombang serapan maksimum dapat diperoleh dengan membuat kurva hubungan antara absorbansi dengan panjang gelombang dari suatu larutan baku dengan konsentrasi tertentu. $. 8embuatan kurva kalibrasi
"ilakukan dengan membuat seri larutan baku dalam berbagai konsentrasi kemudian asorbansi tiap konsentrasi di ukur lalu dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi dengan konsentrasi. Kurva kalibrasi yang lurus menandakan bah,a hukum Lambert-eer terpenuhi. 4. 8embacaan absorbansi sampel
bsorbansi yang terbaca pada spektrofotometer hendaknya antara %#$ sampai %#( atau 6BF sampai A%F jika dibaca sebagai transmitan. /al ini disebabkan karena pada kisaran nilai absorbansi tersebut kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal !)ohman# $%%A'. 2..! Analisis Kuantitatif
nalisis kuantitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis dapat digolongkan atas tiga macam pelaksanaan pekerjaan yaitu 1.
nalisis kuantitatif 2at tunggal !analisis satu komponen'
2.
nalisis kuantitatif campuran $ macam 2at !analisis $ komponen'
3.
nalisis kuantitatif campuran 4 macam 2at !analisis multi komponen'
nalisis kuantitatif 2at tunggal dilakukan dengan pengukuran harga pada panjang gelombang maksimum atau dilakukan pengukuran FT pada panjang gelombang minimum. "ilakukan pengukuran pada panjang gelombang maksimum karena perubahan absorban untuk setiap satuan konsentrasi adalah paling besar pada panjang gelombang maksimal# sehingga akan diperoleh kepekaan analisis yang maksimal. Selain itu pita serapan di sekitar panjang gelombang maksimal datar dan pengukuran ulang dengan kesalahan yang kecil dengan demikian akan memenuhi hokum Lambert-eer.
da & cara pelaksanaan analisis kuantitatif 2at tunggal yaitu 8ertama dengan membandingkan absorban atau persen transmitan 2at yang dianalisis dengan reference standard pada panjang maksimal.
!S' !S'
.3 1 .3 !S' !).S' !).S' 1 absorban larutan sample
3 1 konsentrasi larutan sample !S'
!).S'
1 absorban reference standard
3 1 kosentrasi larutan reference standard !).S'
Kedua dengan memakai kurva baku dari larutan refence standard dengan pelarut tertentu pada panjang gelombang maksimum. "ibuat grafik system koordinat 3artesian di mana sebagai ordinat adalah absorban dan sebagai absis adalah konsentrasi. Ketiga dengan cara menghitung harga absorbansi larutan sample !'F660 makscmG pada pelarut tertentu dan dibandingkan denga absorbansi 2at yang dianalisis yang tertera pada buku resmi. Keempat dengan memakai perhitungan nilai ekstingsi molar !absorbansi molar ?' sama dengan cara yang ketiga hanya saja pada perhitungan absorbansi molar lebih tepat karena melibatkan massa molekul relative !+r' 6%6F66..HG1 MRcm? nalisis kuantitatif campuran dua komponen merupakan teknik pengembangan analisis kuantitatif komponen tunggal. 8rinsip pelaksanaannya adalah mencari absorban atau beda absorban tiap-tiap kimponen yang memberikan korelasi yang linier terhadap konsentrasi# sehingga akan dapt dihitung masing-masing kadar campuran 2at tersebut secara serentak atau salah satu komponen dalam campurannya dengan komponen lainnya. eberapa cara yang telah dipakai para ilmuan untuk analisis kuantitatif campuran dua komponen dengan metode spektrofotometri UV-Vis antara lain dengan cara 9 Serapan individual 9 =rafik 9 8erbandingan serapan 9 8anjang gelombang ganda 9 "ifferensial beda pelarut 9 8engamatan tiga panjang gelombang atau lebih 9 "erivative Untuk analisis kuantitatif dengan cara pengamatan tiga panjang gelombang akan dijabarkan I sebagai 4$6 AnmnAAnmm999999JHJJ999999JH1I
da tiga koefisien korelasi yaitu K # K dan K yang dinyatakan sebagai 6 $ 4 nmmJH16 6$1 nmnJH14
pabila dilakukan pengamatan tiga panjang ge,lombang untuk analisis kuantitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis mutlak harus ada reference standard dengan cara penghilangan pengaruh komponen pengganggu. nalisis kuantitatif dengan metode spektrofotometri UV-Vis dengan cara pengamatan tiga panjang gelombang# prinsip kegunaannya hamper sama dengan cara derivative yaitu 9 Untuk analisis kuantitatif campuran dua komponen yang spektrumnya saling tumpang tindih 9 Untuk analisis kuantitatif campuran komponen dalam sample yang keruh
8rinsip analisis multi komponen dengan metode Spektrofotometri UV-Vis adalah kaliberasi tiaptiap komponen dengan memakai larutan standar. "ikenal ada dua macam larutan standar yaitu larutan standar murni dan larutan standar campuran. Larutan standar campuran teknik pembuatan dan dampak kesalahannya sudah jelas lebih rumit. Selanjutnya cara-cara perhitungan kadar tiaptiap komponen juga dikenal dua macam yaitu cara konvensional dan cara modern yang tergantung pada instrument yang dipakai pada Spektrofotometri UV-Vis yang konvensional perhitungan dilakukan pada tiap puncak 7 panjang gelombang maksimum tiap komponen. Untuk campuran pembacaan absorban adalah hasil jumlah absorban tiap komponen. "i antara cara-cara analisis tersebut di atas yang umum dan sering dipakai adalah cara derivative dan cara pengamatan tiga panjang gelombang atau lebih. Spectrum derivative pertama didapatkan dengan cara menggambarkan selisih absorban dua panjang gelombang !I 1 0 M 6 0 ' terhadap harga rata-rata dua panjang gelombang tersebut yang teratur berderet yaitu $ 999999J1$$6000 m 8ada prinsipnya semua spektrum yang dihasilkan oleh semua spekyrofotometri UV-Vis jenis apapun dapat diturunkan spectra derivatifnya secara manual atau otomatis. nalisis kuantitatif spectrum derivative dilakukan dengan jalan membuat kurva baku antara beda absorban puncak atau lembah spectrum dari garis dasar terhadap konsentrasi 2at tersebut. Untuk campuran dua komponen yang saling tumpang tindih perlu dicari 0 panjang gelombang yang m bebas !tidak terganggu' untuk tiap-tisp komponen yang akan ditentukan. 8ada spektrofotometer UV-Vis yang modern dapat membuat spectrum derivative sampai tingkat sembilan secara otomatis. Kegunaan spektrofotometer UV-Vis cara derivative adalah
9 pabila menghadapi campuran dua komponen yang spektrumnya saling tumpang tindih# maka analisis kuantitatif derivative yang akan menjadi metode yang terpilih 9 nalisis kuantitatif campuran dua komponen yang keruh 9 nalisis kuantitatif campuran dua komponen yang merupakan isomeri !kecuali isomer optis aktif atau arsemik' 9 Spectra derivative dapat dipakai untuk maksud kualitatif atau sebagai data pendukung. nalisis kuantitatif dengan cara pengamatan tiga panjang gelombang sama dengan cara derivative yaitu dengan cara membuat kurva baku beda absorban pada tiga panjang gelombang terhadap konsentrasi. 3ara modern dalam perhitungan analisis muti komponen 7 4 komponen adalah cara pembanding spectra pada setiap interval panjang gelombang yang sempit !$nm' pada rentang panjang gelombang pengukuran. 8erhitungan kadar masing-masing komponen dapat dilakukan dengan dua cara statistic yaiu dengan cara LSN !Least SOuares +ethods' atau dengan +L/ !+a5imum Likelihood'. Kedua metode tersebut tidak memerlukan kurva baku standar murni. Semua perhitungan LSN dan +L/ untuk analisis multikomponen berasal dari persamaan Lambert-eer yang merupakan hukum dasar spektrofotometri UV-Vis. /ukum Lambert-eer menyatakan hubungan antara serapan dan panjang jalan mele,ati medium yang menyerap # dan hubungan antara konsentrasi spesies penyerap dan tingkat absorbsi. /okum ini menyatakan absorban 2at terlarut adalah proporsional dengan konsentrasi sebagai 1 ?. b. 3
1 absorban ? 1 koefisien ansorbansi molar -6 3 1 konsentrasi solute ! mol7L ' b 1 tebal curvet
A"AL#S#S K$AL#TAT#% #dentifikasi &Kualitatif' # yaitu dengan membandingkan hasil pengukuran pada sampel dengan pustaka atau pembanding. Pang dibandingkan adalah
6. 8anjang gelombang serapan maksimum !lma('Q $. ;ilai a !absorptivitas'Q 4. ;ilai e !absortivitas molar' &. A1) 1cm !absorptivitas jenis' khas untuk senya,a yang dilarutkan dalam suatu pelarut pada p/ tertentuQ B. ;ilai pada 3 tertentu @. )asio pada berbagai panjang gelombang $ji kemurnian # dengan membandingkan hasil pengukuran pada sampel dengan persyaratan yang ada pada kompendia. Pang dibandingkan adalah nilai maksimum dan lma5# rasio pada dua lma5 yang berbeda.
2.* +alidasi
Keamanan dan efiksi suatu produk obat hanya dapat dijamin dengan penga,asan analisis dari kualitasnya. Rdentitas# kemurnian# kekuatan dan ku alitas yang lain dari suatu obat Validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu pada prosedur penetapan yang dipakai untuk membuktikan bah,a parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunanya !*rmer and +iller# $%%BQ /armita# $%%&'. Validasi dilakukan untuk menjamin bah,a metode analisis yang dilakukan akurat# spesifik# reprodusibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis !)ohman# $%%A'. 2.*.1 Akurasi , Kecermatan
kurasi adalah ukuran yang menentukan derajat kedekatan hasil analisis dengan kembali !recovery' analit yang ditambahkan. kurasi dapat ditentukan melalui dua cara# yaitu metode simulasi !spiked-placebo recovery' atau metode penambahan baku !standard addition method'. "alam metode simulasi# sejumlah analit bahan murni ditambhakna ke dalam plsebo !semua campuran reagen yang digunakan minus analit'# lalu campuran tersebut dianalisi dan hasilnya dibandingkan dengan kadar standard yang ditambahkan !kadar yang sebenarnya'. )ecoveri dapat ditentukan dengan cara membuat sampel plasebo !eksepien obat# cairan biologis' kemudian ditambah analit dengan konsentrasi tertentu !biasanya (%F sampai 6$%F dari analit yang diperkirakan'# kemudian dianalisa dengan metode yang akan divalidasi.
"alam metode adisi !penambahan baku'# sampel dianalisis lalu sejunlah tertentu analit diperiksa !pure analit7standar' ditambahkan ke dalam sampel# dicampur dan dianalisis lagi. Selisih kedua hasil dibandingkan dengan kadar yang sebenarnya !http77,,,.chem-eng.its.ac.id7labotorium' 2.*.2 resisi , Keseksamaan
8resisi merupakan ukuran keterulangan metode analisis dan biasanya diekspresikan sebagai Standard "eviation !S"' atau Simpangan aku )elatif 7 )elative Standard "eviation !)S"' 1 koefisien keragaman 7 coefisien variansi !3V' dari serangkaian data !)ohman# $%%A'. 8resisi !Keseksamaan' dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut S" 1 6'!HHnrataXrataXi 2.*.2 Sensitifitas &L/ dan L0'
atas deteksi !L:"' adalah konsentrasi terendah yang masih dapat terdeteksi. atas deteksi dapat dipeoleh dari kalibrasi yang diukur sebanyak @ sampai 6% kali. atas kuantitasi !L:N' adalah jumlah terkecil yang masih dapat diukur dalam kondisi percobaan yang sama dan masih memenuhi kriteria cermat. !ustralian 8esticides and Veterinary +edicines uthority# $%%&Q *rmer and +iller# $%%B Q )ohman# $%%A' 8ada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blangko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blangko dan rumus di ba,ah ini dapat digunakan untuk perhitungan. N 1 SIkxSb Keterangan N 1 L:" !batas deteksi' atau L:N !batas kuantitasi' k 1 4 untuk batas deteksi atau 6% untuk batas kuantitasi Sb 1 simpangan baku respon analitik dari blanko SR 1 Slope !b pada persamaan garis y 1 a J b5' atas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis regresi linear dari kurva kalibrasi. ;ilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada persamaan garis linear y 1 a5 J b# sedangkan simpangan baku blanko sama dengan simpangan baku residual !Sy75'. a. atas deteksi !L:"'
Karena k 1 4# Simpangan baku !Sb' 1 Sy75# maka L:" 1 !4 Sy75'7SR b. atas kuantitasi !L:N'
Karena k 1 6%# Simpangan baku !Sb' 1 Sy75# maka L:N 1 !6% Sy75'7SR
ara kerja spektrofotometer
3ara kerja spektrofotometer secara singkat adalah sebagai berikut. Tempatkan larutan pembanding# misalnya blangko dalam sel pertama sedangkan larutan yang akan dianalisis pada sel kedua. Kemudian pilih foto sel yang cocok $%%nm-@B%nm !@B%nm-66%%nm' agar daerah 0 yang diperlukan dapat terliputi. "engan ruang foto sel dalam keadaan tertutup WnolX galvanometer didapat dengan menggunakan tombol dark-current . 8ilih h yang diinginkan# buka fotosel dan le,atkan berkas cahaya pada blangko dan WnolX galvanometer didapat dengan memutar tombol sensitivitas. "engan menggunakan tombol transmitansi# kemudian atur besarnya pada 6%%F. Le,atkan berkas cahaya pada larutan sampel yang akan dianalisis. Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan sampel. Komponen-komponen pokok dari spektrofotometer meliptui 6. Sumber tenaga radiasi yang stabil $. Sistem yang terdiri dari lensa-lensa# cermin# celah-celah# dan lain-lain 4. +onokromator untuk mengubah radiasi menjadi komponen-komponen panjang gelombang tunggal &. Tempat culikan yang transparan B. "etektor radiasi yang dihubungkan dengan system meter atau pencatat "iagram sederhana dari spektrofotometer adalah sebagai berikut !6' Sumber Tenaga )adiasi Sumber tenaga radiasi terdiri dari benda yang tereksitasi hingga ke tingkat tenaga yang tinggi oleh sumber listrik bertegangan tinggi atau oleh pemanasan listrik. enda atau materi yang kembali ke tingkat tenaga yang lebih rendah atau ke tingkat dasarnya# melepaskan foton dengan tenaga-tenaga yang karakteristik yang sesuai dengan I*# yaitu perbedaan tenaga antara tingkat tereksitasi dan tingkat dasar rendah. Sumber radiasi yang ideal untuk pengukuran serapan harus menghasilkan spektrum kotinu dengan intensitas yang seragam pada keseluruhan kisaran panjang gelombang yang sedang dipelajari. a. Sumber )adiasi Ultraviolet
Sumber-sumber radiasi ultraviolet yang kebanyakan digunakan adalah lampu hydrogen dan lampu deuterium. +ereka terdiri dari sepasang elektroda yang terslubung dalam tabung gelas dan diisi dengan gas hidrogen atau deuterium pada tekanan yang rendah. ila tegangan yang tinggi dikenakan pada elektroda-elektroda# maka akan dihasilkan electron-elektron yang mengeksitasikan electron-elektron lain dalam molekul gas ke tingkatan tenaga yang tinggi. ila electron-elektron kembali ke tingkat dasar mereka melepaskan radiasi dalam daerah sekitar 6(% dan 4B% nm. Sumber radiasi UV yang lain adalah lampu 5enon# tetapi dia tidak sestabil lampu hydrogen. b. Sumber )adiasi Terlihat Sumber radiasi terlihat dan radiasi infra merah dekat yang biasa digunakan adalah lampu filament tungsten. Yilament dipanaskan oleh sumber arus searah !"3'# atau oleh baterai. Yilament tungsten menghasilkan radiasi kontinu dalam daerah antara 4B% dan $B%% nm.
!$'. +onokromator Seperti kita ketahui bah,a sumber radiasi yang umum digunakan menghasilkan radiasi kontinu dalam kisaran panjang gelombang yang lebar. "alam spektrofotometer# radiasi yang polikromatik ini harus diubah menjadi radiasi monokromatik. da $ jenis alat 6A
yang digunakan untuk mengurai radiasi polikromatik menjadi radiasi monokromatik yaitu penyaring dan monokromator. 8enyaring dibuat dari benda khusus yang hanya meneruskan radiasi pada daerah panjang gelombang tertentu dan menyerap radiasi dari panjang gelombang yang lain. +onokromator merupakan serangkaian alat optic yang menguraikan radiasi polikromatik menjadi jalur-jalur yang efektif7panjang gelombang-gelombang tunggalnya dan memisahkan panjang gelombang-gelombang tersebut menjadi jalur-jalur yang sangat sempit. !4'. Tempat cuplikan 3uplikan yang akan dipelajari pada daerah ultraviolet atau terlihat yang biasanya berupa gas atau larutan ditempatkan dalam sel atau cuvet. Untuk daerah ultraviolet biasanya digunakan Nuart2 atau sel dari silika yang dilebur# sedangkan untuk daerah terlihat digunakan gelas biasa atau Nuart2. Sel yang digunakan untuk cuplikan yang berupa gas mempunyai panjang dari %#6 hingga 6%% nm# sedang sel untuk larutan mempunyai panjang lintasan tertentu dari 6 hingga 6% c#. sebelum sel dipakai harus dibersihkan dengan air# atau jika dikehendaki dapat dicuci dengan larutan deterjen atau asam nitrat panas. *Pelarut
8elarut-pelarut yang digunakan spektrofotometri harus 6. +elarutkan cuplikan $. +eneruskan radiasi dalam daerah panjang gelombang yang sedang dipelajari. 4. 8elarut yang dipakai tidak mengandung sistem ikatan rangkap terkonjugasi pada struktur molekulnya dan tidak ber,arna &. Tidak terjadi interaksi dengan molekul senya,a yang dianalisis. B. Kemurniannya harus tinggi# atau derajat untuk analisis tinggi. /al lain yang perlu diperhatikan dalam pemilihan pelarut adalah polaritas pelarut# karena akan sangat mempengaruhi pergeseran spectrum yang dianalisis. eberapa pelarut yang bisa digunakan dalam daerah-daerah ultraviolet dan terlihat adalah seperti aseton# ben2ena# karbon tetraklorida# kloroform# dioksan# sikloheksan# isopropanol# diklorometan#
Pembuatan Larutan
Larutan selalu dibuat dengan cermat larutan standar dibuat dalam labu ukur# konsentrasi biasanya sekitar %#6F. Untuk pekerjaan yang memerlukan ketelitian semua gelas-gelas standard an sebagainya harus mempunyai kualitas analitis yang tinggi# dan jika pengenceran dilakukan harus dikerjakan dalam volume yang dapat diukur dengan telitiQ karena perbedaan volume yang sangat kecil akan dapat menyebabkan kesalahan. !&'. "etektor 8eranan detector penerima adalah memberikan respon terhadap cahaya pada berbagai panjang gelombang. 8ada spektrofotometer# tabung pengganda electron yang digunakan prinsip kerjanya telah diuraikan. Setiap detector menyerap tenaga foton yang mengennainya dan mengubah tenaga tersebut untuk dapat diukur secara kuantitatif seperti sebagai arus listrik atau perubahan perubahan panas. Kebanyakan detector menghasilkan sinyal listrik yang dapat mengaktifkan meter atau pencatat. Setiap pencatat harus menghasilkan sinyal yang secara kuantitatif berkaitan dengan tenaga cahaya yang mengenainya. 8ersyaratan-persyaratn penting untuk detector meliputi 6. Sensitivitas tinggi hingga dapat mendeteksi tenaga cahaya yang mempunyai tingkatan rendah sekalipun $. Zaktu respon pendek 4. Stabilitas yang panjang7lama untuk menjamin respoon secara kuantitatif &. Sinyal elektronik yang mudah diperjelas.
Kelebian dan kekurangan Spektrofotometer $+,+#S Kelebihan
8anjang gelombang dari sinar putih dapat lebih terseleksi 3aranya sederhana "apat menganalisa larutan dengan konsentrasi yang sangat kecil
Kekurangan
bsorbsi dipengaruhi oleh p/ larutan# suhu dan adanya 2at pengganggu dan kebersihan dari kuvet
/anya dapat dipakai pada daerah ultra violet yang panjang gelombang [6(B nm 8emakaian hanya pada gugus fungsional yang mengandung elektron valensi dengan energy
eksitasi rendah Sinar yang dipakai harus monokromatis
Syarat pengukuran dengan spektrofotometer UV: -Sampel dalam larutan menyerap sinar UV (180-350 nm) -Molekul senyaanya memiliki ikatan rangkap atau elektron non!onding (transisi n- π"# π - π"# n-$") -%arutan !ening dapat didak !erarna
Syarat pengukuran dengan spektrofotometer V&S&'%: -Sampel dalam larutan menyerap sinar tampak (350-0 nm) -%arutan sampel *arus !ening dan !erarna -+elarut tidak menyerap sinar tampak
Suatu senya,a dapat dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis jika mempunyai kromofor pada strukturnya# seperti 6. Rkatan rangkap terkonjugasi "ua ikatan rangkap terkonjugasi memberikan suatu kromofor# seperti dalam butadien akan mengabsorbsi pada $6Anm. 8anjang gelombang serapan maksimum !lma5' dan koefisien ekstingsi molar !e' akan bertambah dengan bertambahnya jumlah ikatan rangkap terkonjugasi. $. Senya,a aromatik cincin aromatik mengabsorbsi dalam daerah radiasi UV. +isal ben2en menunjukkan serapan pada panjang gelombang sekitar $BBnm# begitu juga asam asetil salisilat. 4. =ugus karbonil pada gugus karbonil aldehida dan keton dapat dieksitasi baik dengan peralihan n\p] atau p\p]. &. uksokrom gugus auksokrom mempunyai pasangan elektron bebas# yang disebabkan oleh terjadinya mesomeri kromofor. Pang termasuk dalam gugus auksokrom ini adalah substituen seperti M:/# -;/$# -;/)# dan M;)$. =ugus ini akan memperlebar sistem kromofor dan menggeser absorbsi maksimum !lma5' ke arah l yang lebih panjang B. =ugus aromatik adalah yang mempunyai transisi elektron n\pseperti nitrat !464 nm'# karbonat !$6A nm'# nitrit !4@% dan $(% nm'# a2ida !$4% nm' dan tritiokarbonat !B%% nm'.