I.
SPEKTROFOTOMETRI
1. Pengertian Secara Umum Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu suatu lajur larutan berwarna pada panjang panjang gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan detektor fototube. Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut den gan spektrofotometri. Dan spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual dengan studi yang lebih mendalam men dalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu pe rkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.
2. Prinsip Kerja Spektrofotometer Spektrofotometer bekerja dengan cara mengukur jumlah relatif cahaya dari panjang gelombang yang berbeda yang diabsorbsi dan ditransmisikan oleh suatu senyawa. Gambar 1 menjelaskan mekanisme kerja spektrofotometer yang mana cahaya putih dibiaskan oleh prisma menjadi sejumlah cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda. Cahaya tersebut te rsebut akan melewati sampel dan kemudian melewati tabung/kuvet yang mengubah energi cahaya menjadi energi listrik yang digunakan untuk mengukur densitas sampel tersebut (Campbell et al., 2011).
Gambar 1. Prinsip kerja spektrofotometer (Campbell et al., 2011). Teknik spektrofotometri dapat digunakan untuk menganalisi baik secara kuantitatif maupun secara kualitatif. Analisis secara kualitatif dilakukan dengan adanya pola spektrum yang mengenali suatu senyawa dan secara kuantitatif berdasarkan hukum Lambert-Beer. Hukum Lambert-Beer mengatakan bahwa intensitas suatu cahaya yang diserap berbanding lurus dengan konsentrasi senyawa. Semakin besar suatu konsentrasi, maka semakin besar nilai absorbasinya. Dengan adanya Hukum ini, maka dapat dirumuskan nilai absorbansi dengan persamaan:
A=εbc Keterangan: A = Absorban ε = koefisien ekstingsi molar b = tebal larutan (kuvet) c = konsentrasi larutan
Tipe-tipe Spektrofotometer Pada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer, yaitu:
1. Single-beam instrumen Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan mengukurabsorbansi pada panjang gelombang tunggal. Single-beam instrument mempunyai beberapakeuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan mengurangi biaya yang ada
merupakankeuntungan yang nyata. Beberapa instrumen menghasilkan singlebeam instrument untuk pengukuran sinar ultra violet dan sinar tampak. Panjang gelombang paling rendah adalah 190sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm (Skoog, DA, 1996).
2. Double-beam instrumen Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang 190 sampai 750 nm. Double-beaminstrument dimana mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan cerminyang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan blangko dansinar kedua secara serentak melewati sampel, mencocokkan foto detektor yang keluarmenjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh alat pembaca (Skoog, DA, 1996).
3. Komponen utama dari spektrofotometer 3.1. Sumber cahaya
Untuk radisi kontinue : Untuk daerah UV dan daerah tampak :
Lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan spektrum kontiniu pada gelombang 320-2500 nm. Lampu hidrogen atau deutrium (160-375 nm) Lampu gas xenon (250-600 nm)
Untuk daerah IR Ada tiga macam sumber sinar yang dapat digunakan :
Lampu Nerst,dibuat dari campuran zirkonium oxida (38%) Itrium oxida (38%) dan erbiumoxida (3%)
Lampu globar dibuat dari silisium Carbida (SiC).
Lampu Nkrom terdiri dari pita nikel krom dengan panjang gelombang 0,4 – 20 nm
Spektrum radiasi garis UV atau tampak :
Lampu uap (lampu Natrium, Lampu Raksa) Lampu katoda cekung/lampu katoda berongga Lampu pembawa muatan dan elektroda (elektrodeless dhischarge lamp) Laser
3.2. Pengatur Intensitas
Berfungsi untuk mengatur intensitas sinar yang dihasilkan oleh sumber cahaya agar sinar yang masuk tetap konstan. 3.3. Monokromator
Berfungsi untuk merubah sinar polikromatis menjadi sinar monokromatis sesuai yang dibutuhkan oleh pengukuran Macam-macam monokromator :
Prisma kaca untuk daerah sinar tampak kuarsa untuk daerah UV Rock salt (kristal garam) untuk daerah IR Kisi difraksi
Keuntungan menggunakan kisi : Dispersi sinar merata Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum
3.4. Kuvet
Pada pengukuran di daerah sinar tampak digunakan kuvet kaca dan daerah UV digunakan kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah IR. 3.5. Detektor
Fungsinya untuk merubah sinar menjadi energi listrik yang sebanding dengan besaran yang dapat diukur. Syarat-syarat ideal sebuah detektor :
Kepekan yang tinggi Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi Respon konstan pada berbagai panjang gelombang. Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi. Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.
Macam-macam detektor :
Detektor foto (Photo detector) Photocell Phototube Hantaran foto Dioda foto Detektor panas
3.6. Penguat (amplifier)
Berfungsi untuk memperbesar arus yang dihasilkan oleh detektor agar dapat dibaca oleh indikator. 3.7. Indikator
Dapat berupa :
Recorder Komputer
4. Jenis – Jenis Spektrofotometri Spektrofotometer terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang digunakan. Diantaranya adalah sebagai berikut: 1. Spektrofotometer Visible (Spektro Vis) Pada spektrofotometer ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm. Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau, apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar tampak (visible). Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 ºC) dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu. Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilkii warna. Hal ini
menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa. Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil. Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein). Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin. Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar konsentrasi protein terlarut dalam sample. 2. Spektrofotometer UV (ultraviolet) Berbeda dengan spektrofotometer visible, pada spektrofotometer UV berdasarkan interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm. Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga heavy hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti ‘dua’, mengacu pada intinya yang memiliki dua
pertikel. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan. Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut sempurna.
Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. Sebagai contoh pada analisa protein terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV, sample dapat langsung dianalisa. Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap sample
(Absorbansi
tinggi),
maka
konsentrasi
protein
terlarut
semakin
besar.
Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible, terutama pada bagian preparasi sample. Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa. 3. Spektrofotometer UV-Vis Spektrofotometer ini merupakan gabungan antara spektrofotometer UV dan Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna.
4. Spektrofotometer IR (Infra Red) Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometer ini berdasar pada penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5- 1000 μm. Pada spektro IR meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.
Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni. Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva yang diperoleh. Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry (NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan baku yang bersifat rutin dan cepat. 5. Kalibrasi Alat Spektrofotometer
Kalibrasi yang dimaksud ini adalah men-seting blank alat spektrofotometer, sebelum digunakan untuk analisis. Secara umum sbb: 1. Nyalakan alat spektrofotometer 2. Isi kuvet dengan larutan blanko (aquades) 3. Diseting/diatur panjang gelombang untuk kalibrasi. 4. ->keterangan: 0%T itu diukur saat kuvet dalam keadaan kosong. 100%T itu diukur saat kuvet dalam keadaan terisi larutan. 5. Kuvet berisi larutan blanko dimasukkan ke spektrofotometer 6. lalu tekan tombol 0 ABS 100%T, tunggu sampai keluar kondisi setting blank (dalam bentuk teks)
Contoh tabel pengamatan absorbansi sebagai fungsi gelombang
Hal-hal yang harus diperhatikan :
a) Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna, maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang berwarna. Kecuali apabila diukur dengan menggunakan lampu UV. b) Panjang gelombang maksimum Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang mempunyai absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panajgn gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal karena pada panjang gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap satuan konsentrasi adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang gelombang maksimal, akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer dapat terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat kesalahannya akan kecil sekali. c) Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawa yang terbentuk. Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorban pada spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan lebih teliti. 7. Cara menetapkan kadar kafein dengan instrumen
a. Prosedur kerja Preparasi Sampel
1.
Memipet sampel sebanyak 10 mL dan masukkan ke dalam labu pemisah
2.
Menambahkan kloroform sebanyak 50 mL dan mengocoknya selama 5 me nit
3.
Mendiamkan selama beberapa menit sampai terlihat jelas batas pisah kedua
cairan. 4.
Mengalirkan cairan yang berada di bawah batas pisah melalui corong gelas yang
telah diberi kertas saring ke dalam labu ukur 100 mL. 5.
Mengulangi ektraksi dengan menambahkan kloroform sebanyak 40 mL dan
mengocoknya selama 1 menit. 6.
Mendiamkan selama beberapa menit sampai terlihat jelas batas pisah kedua
cairan.
7.
Mengalirkan cairan yang berada di batas pisah melalui corong pisah yang telah
diberi kertas saring ke dalam labu ukur 100 mL sebelumnya. 8.
Mengencerkan cairan ekstrak tadi dengan kloroform sampai batas garis.
Pengenceran
1.
Memipet 2 mL larutan contoh dari labu ukur 100 mL ke dalam labu ukur 10 mL
2.
Mengimpitkan sampai batas garis dengan kloroform
Pembuatan Larutan Baku
1.
Larutan baku induk
Menimbang ± 50 mg standar kafein, add 100 mL (500 ppm). 2.
Larutan baku kerja
Memipet 10,0 mL larutan 1, add 50 mL (100 ppm)
Pembuatan Deret Standar
Membuat deret larutan standar yang mengandung 4, 6, 8, 10, 12 ppm dari larutan baku kerja 100 ppm. a.
Dari 100 ppm dipipet sebanyak 4 mL ke dalam labu ukur 100 mL (4 ppm)
b. Dari 100 ppm dipipet sebanyak 6 mL ke dalam labu ukur 100 mL (6 ppm) c.
Dari 100 ppm dipipet sebanyak 8 mL ke dalam labu ukur 100 mL (8 ppm)
d. Dari 100 ppm dipipet sebanyak 10 mL ke dalam labu ukur 100 mL (10 ppm) e.
Dari 100 ppm dipipet sebanyak 12 mL ke dalam labu ukur 100 mL (12 ppm)
Pengukuran
Mengukur larutan sampel, standar, dan blanko pada λ maksimum.
b. Data pengamatan c.
Deret standar Konsentrasi (ppm)
Absorbansi
4
0,2258
6
0,3231
8
0,4193
10
0,5129
12
0,6112
Sampel ID
mL
Sampel
sampel
fp
Kons. pembacaan
Abs.
λ
Kons.
Persamaan
maks
(mg/150
korelasi
(nm)
mL)
Y= Eng
10
50
7,1763
0,379
276
53,83
0,04803x+0 ,0322 r = 0,9999
II.
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS
1. Pengertian umum Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan kepolaran. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun cuplikannya. KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa – senyawa yang sifatnya hidrofobik seperti lipida – lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas. KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi senyawa murni skala kecil. Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan pereaksi – pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi se nyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat
dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0
2. Fungsi Kromatografi Lapis Tipis
Digunakan untuk tujuan analitik
Identifikasi komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi atau pemadaman fluoresensi, radiasi UV
Dapat dilakukan elusi dengan mekanik (ascending ) atau menurun (descending ) atau dengan cara elusi 2 dimensi
Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang ditentukan merupakan noda yang tidak bergerak
Identitas komponen dijabarkan dalam harga Rf (retardation factor ) yang dalam penentuan kualitatif dibandingkan dengan standar
Untuk tujuan kuantitatif digunakan KLT preparatif (dikerok lalu senyawa diisolasi dalam pelarutnya)
3. Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis
Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.
Proses berikutnya dari kromatografi lapis tipis adalah tahap visualisasi. Tahapan ini sangat penting karena diperlukan suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat karena harus disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang di uji. Salah satu yang dipakai adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione) adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Apabila pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu. Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol.
Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut faktor retensi. Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut : Rf = Jarak yang ditempuh substansi/Jarak yang ditempuh oleh pelarut Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis. Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan merupakan senyawa yang berbeda. a. Fase diam-jel silika Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom silikon berlekatan pada gugus -OH.Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika. Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van der Waals dan atraksi dipol-dipol.. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah aluminaaluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang kita
sebutkan
tentang
jel
silika
kemudian
digunakan
serupa
untuk
alumina.
b. Senyawa-senyawa pemisah dari Kromatogram Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawasenyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut. Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung pada: • Kelarutan senyawa dalam pelarut. Tergantung pada besar atraksi antara molekul-molekul senyawa dengan pelarut.
• Senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Tergantung pada bagaimana besar atraksi antara senyawa dengan jel silika. Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang lemah. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan. Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari permukaan silika. Penyerapan pada kromatografi lapis tipisbersifat tidak permanen, terdapat pergerakan yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali pada larutan dalam pelarut. Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat senyawa
dijerap,
semakin
kurang
jarak
yang
ditempuh
ke
atas
lempengan.
Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut. 4. Pelaksanaan Kromatografi Lapis Tipis
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning a. Kromatogram Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna yang merupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.
Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis: Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan tinta,
pewarna
dari
tinta
akan
bergerak
selayaknya
kromatogram
dibentuk.
Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan bahwa
batas
pelarut
berada
di
bawah
garis
dimana
posisi
bercak
berada.
Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.
Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai perbedaan bercak warna. Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam. b. Perhitungan nilai Rf
Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna masing-masing. Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan. Pengukuran berlangsung sebagai berikut: Nilai
Rf
untuk
setiap
warna
dihitung
dengan
rumus
sebagai
berikut:
Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm dari garis awal, sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah menjadi: nilai Rf yang akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Sebagai contoh, nilai Rf untuk warna merah selalu adalah 0.34. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi pelarut dan sebagainya), nilai tersebut akan berubah. c. mengidentifikasi senyawa-senyawa Dimisalkan campuran asam amino yang ingin diketahui senyawanya. Caranya : Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M dan asam amino yang telah diketahui ditandai 1-5. Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir mencapai bagian atas dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan apa yang terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin. Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat membandingkan bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang telah diketahui melalui posisi dan warnanya. 5. Kromatografi Lapis Tipis pada Substansi Tak Berwarna a. Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar ultraviolet (UV). Itu berarti jika menyinarkannya dengan sinar UV, akan berpendar. Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-
bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa menyinarkan sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.
Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, dan tandai posisi-posisi dari bercak bercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Seketika anda mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali. b. Menggunakan bercak secara kimia Untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat ata u ungu.
Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal iodium. Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak sebagai bercak-bercak kecoklatan
1.Penjerap/Fase diam
Penjerap yang paling sering digunakan pada KLT adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu mekanisme perpindahan solut dari fase diam ke fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi. Lapisan tipis yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang di gunakan untuk pemisahan kiral. Beberapa penjerap KLT serupa dengan penjerap yang digunakan pada KCKT. Kebanyakan penjerap dikontrol keajegan ukuran partikel dan luas permukaannya. Beberapa prosedur kromatografi, terutama pemisahan yang menggunkan larutan pengem-bang anhidrat, mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam silika. Kandungan air yang ideal adalah antara 11-12 % b/b. Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penjerap fase terbalik dengan cara membacemnya menggunakan parafin cair, minyak silikon, atau dengan lemak. Lempeng fase terbalik jenis ini digu nakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid. 2. Fase Gerak pada KLT
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencobacoba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:
Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan teknikyang sensitive
Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing - masing akan mening-katkan elusi solut-solut yang bersifat basa dan asam.
3. Aplikasi (Penotolan) sampel
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang lain,jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan resolusi.