LAPORAN RESMI PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI “Teknik Inokulasi dan Transfer Aseptik serta Pengenalan Morfologi Koloni Mikroba”
Oleh: Nama : Putu Pradnya Candra Asih NPM : 2013210185 Kelas : A Tanggal Praktikum: Senin, 15 September 2014
FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS PANCASILA JAKARTA 2014
I.
Pendahluan 1.1 Latar Belakang Dalam ilmu mikrobiologi, melakukan pekerjaan memindahkan atau mentransfer kultur bakteri dari suatu media ke media lain diperlukan teknik khusus agar dihasilkan bakteri yang baik saat dipanen. Pengerjaan mentransfer kultur bakteri ini haruslah dikerjakan secara aseptis guna memelihara dan mencegah dari kontaminasi mikroba lain atau kontaminan. Teknis aseptis juga diperlukan untuk menghasilkan kultur dengan morfologi koloni yang jelas. Teknik yang harus dipahami dalam teknik transfer aseptis antara lain, inoculating (inokulasi dengan jarum Ose), yaitu memindahkan kultur bakteri dari media satu ke media yang lain. Di mana inokulasi pada praktikum kali ini dilakukan dari inokulum cair ke media agar tegak, dari kultur NA ke media agar miring, dari kultur NA ke media agar lempeng, dari kultur NA ke media kaldu pepton, dari kultur cair ke media kaldu pepton, dan teknik tuang. Hasil daripada pembiakan bakteri pada masing-masing media dengan teknik inokulasi tersebut menghasilkan pola pertumbuhan yang akan diamati bentuk serta morfologinya sehingga dapat digunakan sebagai dasar untuk memisahkan mikroorganisme ke dalam kelompok-kelompok taksonomi. 1.2 Rumusan Masalah 1. Metode inokulasi apa yang sesuai digunakan untuk media agar tegak, agar lempeng, dan kaldu pepton? 2. Bagaimana bentuk morfologi koloni mikroba yang tumbuh pada media agar tegak, agar lempeng, dan kaldu pepton? 3. Apa yang menyebabkan tidak terbentuknya koloni pada media agar lempeng? 1.3 Tujuan 1. Melakukan teknik transfer aseptis dari kultur cair ke media cair, media miring, dan pencawanan, dari kultur miring ke media miring, media cair dan pencawanan 2. Membedakan karakteristik kultural mikroorganisme yang menjadi syarat utama dalam upaya mengidentifikasi dan mengklasifikasi organisme dalam kelompok taksonominya 1.4 Manfaat 1. Mampu melakukan teknik transfer kultur bakteri dari media satu ke media yang lain secara aseptis 2. Mampu membedakan pola pertumbuhan dan morfologi koloni mikroba pada media agara lempeng dan agar miring
II.
Tinjauan Pustaka 2.1 Teknik Dasar Inokulasi dan Transfer Mikroba Secara Aseptis Penanaman bakteri atau yang biasa juga disebut dengan inokulasi adalah pengerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Inokulasi dilakukan dalam kondisi aseptik, yakni kondisi di mana semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium dan pengerjaan dijaga agar tetap steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi. Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadaannya harus steril agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau
percobaan. Inokulasi mikroba umumnya menggunakan alat, yakni jarum Ose yang berfungsi menginokulasi kultur mikroba dari media satu ke media yang lainnya. Inokulasi jamur menggunakan jarum Ose bentuk batang, hifa yang berbentuk seperti benang mudah diambil dengan jarum Ose batang dan mudah sekali tumbuh di dalam suatu media. Inokulasi bakteri menggunakan jarum Ose bentuk bulat, pada ujung jarum Ose yang berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif banyak. Ada beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murni ataupun inokulasi mikroba, antara lain: a. Metode Cawan Gores Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan-keterampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. . inokulum digoreskan ke permukaan agar nutrient dalam cawan Petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garis-garis goresan akan terdapat selsel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni. Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Bila dilakukan dengan baik, teknik inilah yang paling praktis. Beberapa teknik metode goresan antara lain: goresan T, goresan radian, goresan kuadran, goresan sinambung. b. Metode Cawan Tebar Setetes inokulum diletakkan di tengah-tengah medium agar nutrient dalam cawan Petri dan dengan menggunakan batang kaca bengkok yang steril, inokulum itu disebarkan di permukaan medium. Batang yang sama dapat digunakan untuk menginokulasi pinggan kedua untuk menjamin penyebaran sel-selnya dengan baik. Pada beberapa pinggan akan muncul koloni-koloni yang terpisah-pisah. c. Metode Tuang Isolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukan pengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanya ditemukan satu sel di dalam tabung. d. Metode Tusuk Metode tusuk, yaitu dengan cara meneteskan atau menusukkan ujung jarum Ose yang di dalamnya terdapat inokulum, kemudian dimasukkan ke dalam media. 2.2 Pola Pertumbuhan dan Morfologi Koloni Mikroba Bakteri sering digambarkan sebagai sel-sel individual, tetapi ternyata bakteri juga dapat mengorganisir diri menjadi koloni. Koloni bakteri telah terlibat dalam dua pertiga dari infeksi pada manusia, termasuk beberapa yang paling sulit untuk diobati. Antibiotik dapat membunuh bakteri pada permukaan koloni, tapi gagal untuk menembus ke lapisan yang paling dalam. Ketika tumbuh di berbagai media, mikroorganisme akan menunjukkan perbedaan dalam penampilan makroskopik pertumbuhan mereka. Perbedaan-perbedaan ini yang digunakan sebagai dasar untuk memisahkan kelompok taksonomi ke dalam
kelompok taksonomi. Beberapa pola pertumbuhan yang ditunjukkan oleh masing-masing media, antara lain: 1) Nutrient Agar Miring Pertumbuhan ditunjukkan pada garis lurus inokulasi pada permukaan agar, dan evaluasi hasil pertumbuhannya antara lain: 1. Kelimpahan pertumbuhan: Banyaknya pertumbuhan dinyatakan sebagai none (tidak), slight (lemah), moderate (sedang), large (lebar). 2. Pigmentasi: Mikroba bersifat kromogenik dapat menghasilkan pigmen intraseluler yang bertanggung jawab dalam pembentukan warna organisme yang terlihat pada permukaan koloni. Mikroba lainnya juga ada yang dapat menghasilkan pigmen ekstraseluler (bersifat larut) yang diekskresikan ke dalam media dan juga menghasilkan warna. Pada umumnya mikroba dengan sifat non-kromogenik akan tampak berwarna putih hingga abu-abu. 3. Karakteristik optik: Karakteristik optik dapat dievaluasi berdasarkan jumlah cahaya yang ditransmisikan melalui pertumbuhan karakteristik ini digambarkan sebagai buram (tidak ada transmisi cahaya), tembus (transmisi parsial), atau transparan (transmisi penuh). 4. Bentuk: Penampakan koloni yang tumbuh pada satu goresan lurus pada permukaan agar dinyatakan sebagai berikut: a. Filiform: Sinambung/berkelanjutan, pertumbuhan seperti benang dengan tepian yang rata b. Echinulate: Sinambung/berkelanjutan, pertumbuhan seperti benang dengan tepian tidak rata (irregular) c. Beaded: Nonconfluent (tidak sinambung) hingga semiconfluent d. Arborescent: Pertumbuhan seperti pohon e. Rhizoid: Pertumbuhan seperti akar 5. Konsistensi a. Dry: Bebas dari kelembaban b. Buttery: Lembab dan mengkilat c. Mucoid: Berlendir dan berkilau 2)
Nutrient Agar Lempeng Karakteristik koloni yang tumbuh terpisah dengan baik dapat dievaluasi dengan ciri-ciri sebagai berikut: a. Ukuran: Pinpoint (titik sangat kecil), small (kecil), moderate (sedang), large (lebar) b. Pigmentasi: Warna koloni c. Bentuk: Circular (tepian yang teratur, tidak patah), irregular (tepain yang berlekuk), rhizoid (pertumbuhan menyebar seperti akar) d. Tepi: Penampakan tepian terluar koloni yang digambarkan sebagai berikut: Entire (sangat rata), lobate (lekukan yang jelas), undulate (lekukan seperti gelombang), serrate (bergerigi), fillamentous (seperti benang, tepian menyebar) e. Elevasi: Sudut penonjolan pertumbuhan koloni pada permukaan agar yang digambarkan sebagai berikut: Flat (datar, elevasi tidak nyata), raised (sedikit menonjol), convex (elevasi berbentuk kubah), umbonate (menonjol dengan elevasi konveks di bagian tengah)
3)
III.
Nutrient Agar Cair Evaluasi berdasarkan penyebaran dan penampakan pertumbuhan sebagai berikut: a. Seragam dengan penyebaran yang rata: Pertumbuhan yang tersebar rata dengan baik dalam seluruh media b. Flocculant: Agregat yang mudah terbelah yang tersebar di seluruh media c. Pellicle: Tebal, pertumbuhan yang membentuk blok di permukaan media d. Sediment: Pertumbuhan terkonsentrasi pada bagian bawah kultur broth, bisa berglanular, serpihan, atau flocculant
Metodologi 3.1 Teknik Dasar Inokulasi dan Transfer Bakteri Sebelum masuk ke Laboratorium Mikrobiologi praktikan memakai jas laboratorium yang bersih lengkap dengan masker, penutup kepala, dan sarung tangan, kemudian mensterilkan diri sendiri sebelum memulai pekerjaan dengan cara mencuci tangan dengan sabun di wastafel, lalu tangan dibersihkan lagi dengan alkohol 70%. Bersihkan pula meja laboratorium dengan alkohol 70% dan diletakkan 2 lampu spiritus yang telah diberi jarak sekitar 10 cm. Pengerjaan dilakukan di antara 2 lampu spiritus agar dicapai media yang steril. Kemudian, disiapkan alat-alat berupa jarum Ose, pipet volume, api Bunsen atau api spiritus, media steril cair, media steril miring, media steril dalam cawan, dan bahan-bahan berupa kultur biakan miring isolat bakteri dan jamur. A. Cara Kerja Inoculating dengan Jarum Ose Untuk melakukan teknik inoculating, langkah awal yang dilakukan adalah membakar jarum Ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup (ujung) sampai berpijar merah, kemudian dibiarkan selama beberapa detik sampai pijar menghilang. Segera diambil tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, dibuka penutupnya dengan ketiga jari tengah, manis, dan kelingking. Jari telunjuk dan ibu jari memegang jarum Ose. Dibakar bibir tabung reaksi dengan cara memutar tabung sehingga semua bagian bibir tabung terkena api. Segera dimasukkan jarum Ose ke dalam tabung reaksi, lalu segeran dikeluarkan. Diusahakan ketikan memasukkan jarum Ose jangan sampai menyentuh dinding tabung dan dilakukan di dekat pembakar Bunsen/spiritus. Dibakar kembali bibir tabung reaksi dan segera tutup (jarum Ose jangan dibakar kembali karena akan membunuh bakteri yang akan diinokulasikan). Diambil tabung reaksi lain yang akan diinokulasi, dibuka tutupnya dengan tangan kanan dan dibakar bibir tabung reaksi. Segera dimasukkan jarum Ose ke dalam tabung reaksi lalu dibakar kembali bibir tabung kemudian ditutup. Dibakar kembali jarum Ose setelah melakukan teknik inokulasi. B. Teknik Inokulasi dan Transfer Aseptis dari Kultur Agar Miring ke Media Agar Miring dan Agar Cawan Untuk melakukan teknik inoculating, langkah awal yang dilakukan adalah membakar jarum Ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup (ujung) sampai berpijar merah, kemudian dibiarkan selama beberapa detik sampai pijar menghilang. Segera diambil tabung reaksi yang
berisi kultur bakteri, dibuka penutupnya dengan ketiga jari tengah, manis, dan kelingking. Jari telunjuk dan ibu jari memegang jarum Ose. Diambil tabung reaksi yang berisi kultur bakteri, dibuka penutupnya dan diambil kultur bakteri dari tabung menggunakan jarum Ose, kemudian dibakar mulut tabung dengan cara melewatkannya di api spiritus, kemudian ditutup mulut tabung segera. Diambil tabung reaksi yang berisi media agar miring, kemudian dibuka tutupnya dan dibakar mulut tabung dengan cara melewatkannya pada api spiritus, lalu segera ditutup kembali. Dilakukan teknik gores pada media agar miring dengan pola zig-zag (jangan sampai menggores media agar), kemudian dipanaskan mulut tabung media agar yang telah diinokulasi. Ditutup tabung yang telah diinokulasi, lalu dibakar jarum Ose bekas inokulasi sampai merah membara. C. Teknik Inokulasi Tusuk dari Media Cair ke Media Agar Tegak Untuk melakukan teknik tusuk, disiapkan dahulu media Nutrient Agar. Dituang media Nutrient Agar tersebut ke dalam tabung reaksi steril, lalu dibiarkan hingga mengeras. Dibakar jarum Ose dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup sampai berpijar merah. Dibakar bibir tabung reaksi yang berisi kultur bakteri dengan cara memutar tabung hingga semua bagian bibir tabung terkena api. Segera dimasukkan jarum Ose ke dalam tabung reaksi berisi kultur bakteri dan segera dikeluarkan. Ditusuk dari atas permukaan agar perlahan sampai hampir ke dasar agar (jangan sampai ke dasar tabung), lalu dilepaskan perlahan jarum Ose dari media agar ke luar. Dibakar bibir tabung dengan cara melewatkannya pada api spiritus, kemudian ditutup tabung. Dibakar jarum Ose bekas inokulasi. D. Teknik Pour Plate (Lempeng Tuang) Sebelum melakukan langkah ini, pertama-tama media pertumbuhan dipanaskan terlebih dahulu hingga mendidih merata, kemudian dibiarkan beberapa saat sampai agak dingin (suhu sekitar 40°C-50°C). Langkah kedua, diambil sampel sebanyak 0,1 mL dari masing-masing pengenceran berseri. Dibakar bibir cawan Petri dengan cara melewatkannya pada api spiritus. Dimasukkan kultur bakteri pengenceran berseri ke dalam cawan Petri steril, kemudian segera ditutup cawan agar terhindar dari kontaminan. Ditambahkan media Nutrient Agar untuk mengisolasi bakteri, kemudian ditutup cawan Petri dan dibakar kembali bibir cawan. Diputar cawan Petri secara perlahan di atas meja horizontal untuk mengaduk campuran media agar dengan dilusi kultur mikroba. Setelah memadat, cawan diletakkan dalam posisi terbalik dan diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam dan diamati keesokan harinya. E. Teknik Sebar dari Inokulum Cair dan Inokulum NA ke Media Kaldu Pepton Sebelum melakukan langkah ini, pertama-tama disiapkan dahulu media kaldu pepton. Dituang kaldu pepton tersebut ke dalam tabung reaksi steril dan dibiarkan kaldu dingin. Dibakar jarum Ose (sengkelit) dari bagian pangkal dalam terus hingga ke bagian lup sampai berpijar merah. Dibakar bibir tabung reaksi yang berisi kultur bakteri dengan cara memutar tabung hingga semua bagian bibir tabung terkena api. Segera dimasukkan jarum Ose ke dalam tabung reaksi berisi kultur bakteri cair dan segera dikeluarkan. Dicelup dari atas permukaan agar perlahan sampai hampir ke dasar kaldu
(jangan sampai ke dasar tabung), lalu dilepaskan perlahan jarum Ose dari media kaldu pepton ke luar. Dibakar bibir tabung dengan cara melewatkannya pada api spiritus, kemudian ditutup tabung. Dibakar jarum Ose bekas inokulasi. Diulangi langkah ini terhadap pengerjaan media teknik sebar dari kultur agar ke media kaldu pepton. IV.
Hasil Praktikum dan Pembahasan Nama Media
Nutrient Agar
Jenis Media
Metode Inokulasi
Agar Miring
Streak Method
Agar Tegak
Metode Tusuk
Agar Lempeng
Metode Tuang
Agar Lempeng
Streak plate
Cair
Metode Sebar
Endapan, (+), keruh
TBUD
Cair
Metode Sebar
Endapan, (+), keruh
TBUD
Kaldu Pepton
Gambar
Keterangan Bentuk: Rhizoid, (+), keruh Bentuk: Beaded, (+), keruh Bentuk: Tidak beraturan, (+), keruh; Tepian: lengkung; Elevasi: datar Bentuk: Tidak beraturan, (+), keruh; Tepian: undulatus; Elevasi: datar
Jumlah Koloni TBUD
TBUD
TBUD
TBUD
1. Pada percobaan inokulasi dari kultur agar lempeng ke media agar miring dengan streak method dihasilkan pola pertumbuhan koloni mikroba bentuk rhizoid yang positif dan berwarna keruh dengan jumlah TBUD. Hal ini menandakan bahwa media tidak steril dan berhasil ditumbuhi oleh mikroba. 2. Pada percobaan inokulasi dari kultur cair ke media agar tegak dengan metode tusuk dihasilkan pola pertumbuhan beaded yang positif dan berwarna keruh dengan jumlah TBUD. 3. Pada percobaan inokulasi dengan teknik tuang yang sebelumnya telah dilakukan dilusi dihasilkan pola pertumbuhan tidak beraturan yang positif dan berwarna keruh dengan jumlah TBUD. Hal ini disebabkan kurang sterilnya alat sehingga terjadi pencemaran dan mengakibatkan media agar ditumbuhi bakteri yang terlalu banyak untuk dihitung, di mana seharusnya jumlah koloni bakteri mencapai 30-300 koloni.
4. Pada percobaan inokulasi dari kultur agar lempeng ke media agar lempeng dengan streak method dihasilkan pola pertumbuhan tidak beraturan yang positif dan berwarna keruh dengan jumlah TBUD yang pola pertumbuhannya mengikuti alur inokulasi zig-zag. 5. Pada percobaan inokulasi dari kultur cair ke media kaldu pepton dengan metode sebar dihasilkan pola pertumbuhan berbentuk endapan yang positif dan berwarna keruh dengan jumlah TBUD. 6. Pada percobaan inokulasi dari kultur Nutrient Agar ke media kaldu pepton dengan metode sebar dihasilkan pola pertumbuhan berbentuk endapan yang positif dan berwarna keruh dengan jumlah T BUD. V.
Kesimpulan 1. Metode inokulasi yang cocok digunakan untuk media agar miring adalah streak method, pada media agar tegak digunakan metode tusuk, pada media agar lempeng digunakan metode tuang dan streak plate, pada media kaldu pepton digunakan teknik sebar. 2. Pada media agar miring diperoleh pola pertumbuhan koloni bentuk rhizoid, yakni seperti akar, pada media agar tegak diperoleh pola pertumbuhan koloni bentuk beaded (tidak sinambung), pada media agar lempeng diperoleh morfologi koloni bentuk tak beraturan dengan tepian lengkung dan undulatus dan elevasi datar, pada media kaldu pepton diperoleh pola pertumbuhan endapan yang keruh. 3. Pada media agar lempeng, tidak terbentuk koloni pada media yang disebabkan alat yang digunakan kurang steril sehingga terdapat kontaminan.
VI.
Daftar Pustaka 1. Cappuccino, James dan Natalie Sherman. -. Microbiology a Laboratory Manual Eight Edition. Pearson Benjamin Cummings. New York. hal. 21-24 dan 133-134 2. Pelczar, Michael J. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia Press. Jakarta. hal. 85-87 3. Pratiwi, Sylvia T. -. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta. hal. 190-191
VII.
Lampiran
Keterangan (dari kiri ke kanan): 1. Media agar lempeng metode tuang 2. Media agar tegak metode tusuk, media kaldu pepton metode sebar (dari inokulum), media agar miring streak method, media kaldu pepton metode sebar (dari kultur agar lempeng) 3. Media agar lempeng streak plate method dari kultur bakteri agar miring 4. Media kaldu pepton metode sebar (dari inokulum) dan media kaldu pepton metode sebar dari kultur agar lempeng 5. Kultur bakteri pada nutrient agar lempeng (Bentuk: bulat; Tepian: lengkung; Elevasi: datar) 6. Kultur bakteri pada nutrient agar lempeng (Bentuk: bulat; Tepian: lengkung; Elevasi: datar) 7. Kultur bakteri pada nutrient agar miring (Bentuk: arborescent; Tepian: filamen; Elevasi: tumbuh ke dalam media)
8. Kultur bakteri pada nutrient agar lempeng (Bentuk: filamen; Tepian: filamen; Elevasi: naik)
