Técnicas de Cultivo - 1

FACULTAD FACULTAD DE CIENCIA CIENCIAS S FARMAC FARMAC UTICAS UTICAS Y BIOQU BIOQU MICA

INTRODUCCIÓN Existen métodos que que se han diseñado diseñado para estudiar a los microorganismos, microorganismos, los cuales permiten cultivarlos bajo condiciones artificiales y experimentales, manejando incluso un solo tipo de microorganismo. Estos métodos permiten proveer el ambiente bioquímico y biofísico apropiado. El ambiente bioquímico (nutricional) se hace disponible como medio de cultivo, y dependiendo de las necesidades especiales de cada microorganismo en particular se ha desarrollado una gran variedad v ariedad y tipos de medios de cultivo con diferentes propósitos y utilizaciones. Los medios de cultivo son empleados para el aislamiento y mantenimiento de cultivos puros de bacterias y también son utilizados para l a identificación de éstas de acuerdo a sus propiedades bioquímicas y fisiológicas. El modo en que las bacterias son cultivadas, culti vadas, y el propósito de los medios de cultivo, varían ampliamente. Los medios líquidos son utilizados para el crecimiento de lotes de cultivos puros mientras que los medios sólidos son ampliamente utilizados para el aislamiento de cultivos puros, para la estimación de poblaciones de bacterias viables, y una variedad de otros propósitos A l efectuar este procedimiento, procedimiento, es necesario necesario considerar que en el área de trabajo, existen muchos otros microorganismos; debido a esto, es necesario tomar precauciones para impedir que éstos penetren y contaminen los cultivos en estudio. Por otra parte, para considerar no sólo el aspecto nutricional, sino también las condiciones ambientales de su hábitat natural, por lo que en el medio de cultivo se debe ajustar el pH y concentración de sales y durante la incubación condiciones condiciones tales como la temperatura, aireación la luminosidad.

1

FACULTAD DE CIENCIAS FARMAC UTICAS Y BIOQU MICA

1. MARCO TEÓRICO 1. Técnicas de siembra: Las muestras a analizar pueden presentar poblaciones microbianas mixtas, por esta razón se utilizan diversas técnicas para separar un microorganismo de otro y obtener así un cultivo puro que permita identificar al microorganismo aislado. El diagnóstico bacteriológico se basa en el aislamiento de microorganismos a partir de una muestra, por lo que es indispensable tener en cuenta las máximas condiciones de asepsia, desde la toma de muestra hasta la siembra, la cual debe efectuarse lo más rápido posible. Términos importantes:  Siembra  Inóculo

 Cultivo  Cepa

puro

Se denomina “técnica de siembra” al procedimiento mediante el cual se pone en

contacto a los microorganismos con un medio de cultivo y después de un período de incubación se produce el desarrollo de colonias bacterianas. Existen varios tipos de siembra, entre los cuales están los siguientes: Siembra por dispersión y agotamiento Siembra por puntura Siembra por estría Siembra por inoculación Siembra por incorporación, en placa vertida, en masa o en todo el medio Siembra por diseminación o en superficie o con cayado 2. Desarrollo bacteriano Algunas veces las especies bacterianas se pueden identificar basándose en el aspecto que tienen sobre o dentro de los distintos medios de cultivo , es así que la observación de las características de crecimiento de las colonias de microorganismos en medio sólido (agar) y líquido (caldo), puede ser de gran utilidad. Estudio bacteriano en medio líquido: - Velocidad de desarrollo (crecimiento): lento, moderado, rápido. - Aspecto: turbio, claro o transparente, difuso, granulado. Se registran las observaciones como: presencia o ausencia de: turbidez, sedimento y -

“película”.

- Producción de gas: formación de burbujas. Estudio bacteriano en medio semisólido: - Movilidad - Cambios metabólicos Estudio bacteriano en medio sólido: 2


- Características morfológicas de las colonias en cuanto a: elevación, forma, borde, superficie, tamaño, consistencia y color de pigmentación.

2. OBJETIVO:  Realizará diversas técnicas de siembra para su cultivo y aislamiento  Aplica las técnicas de aislamiento hasta la obtención de cultivos puros  Describe sus observaciones usando la terminología técnica apropiada 3. MATERIALES Y EQUIPOS: a) Técnicas de Siembra en Medios Líquidos, Semisólidos y Sólidos:  Placas petri con PLATE COUNT AGAR  Tubos con agar SIM y TSA en agar inclinado  Tubos con caldo TSB  Cultivos de: Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis y Pseudomonas aeruginosa 

b) Desarrollo bacteriano: Utilizar los medios de cultivo preparados en la práctica anterior y proceder a realizar los sembrados en los distintos medios según técnicas. 4. PROCEDIMIENTO Técnicas de Siembra en Medios Líquidos, Semisólidos y Sólidos: a) Con el asa en aro previamente esterilizada, tomar una asada de cada cultivo de microorganismos (tubo 01, tubo 20, tubo 22) y sembrar por el método de dispersión y agotamiento en cada una de las placas con el medio de cultivo preparadas la practica anterior ( PLATE COUNT AGAR)

3


b) Rotular las placas y guardar en la incubadora por 48 horas

c) Con el asa en aro previamente esterilizada tomar una asada del cultivo, y sembrar por el método de inoculación en el tubo con TSB.

2

3

4


4

5

6

8

9

10

11

5


d) Con el asa en aro, toma el inóculo del cultivo bacteriano y siembra en el tubo con agar en pico de flauta o plano inclinado, por el método de estría. Siempre siguiendo los 11 pasos descritos en los gráficos anteriores.

e) Con el asa en punta previamente esterilizada, tomar el inóculo del cultivo de bacterias (tubo 01) y sembrar en agar SIM, por el método de puntura.

6


Desarrollo bacteriano: Después transcurrido 48 horas aproximadamente, se obtuvieron los siguientes resultados. a) Placas petri con PLATE COUNT AGAR Antes

Después de 48 h

7


b) Después de 48 horas: Tubo con TSB, TSA, SIM

8


5. RESULTADOS: 







En la placa Petri con Plate Count Agar: - Con sembrado del tubo 01 se observa el crecimiento muy marcado de microorganismos, por todo el recorrido que se hizo con el asa de un color blanquecino, durante las 48 horas de incubación. - Con sembrado del tubo 20 no se observa ninguna huella de crecimiento de microorganismos, durante las 48 horas de incubación - Con sembrado del tubo 22 se observa el crecimiento de microorganismos, en forma de un pequeño círculo color crema. En cultivo liquido TSB con sembrado del tubo 01 - Se observa una turbidez, con una especie de nata blanquecina sobre la superficie y un precipitado color crema. Lo que indica que si hubo crecimiento de microorganismos. En cultivo de agar inclinado TSA con sembrado del tubo 01 - Se observa manchas blanquecinas sobre la superficie lo que indica que si hubo crecimiento de microorganismos. En cultivo con agar SIM con sembrado del tubo 01 - Se observa manchas sobre la superficie y también sobre el recorrido que hizo el asa de siembra en el interior del tubo, lo que indica el crecimiento de microorganismos.

Cuestionario: 1. ¿Con qué propósito se emplean cada una de las diferentes técnicas de siembra? El propósito de emplear diferentes técnicas de siembra es facilitar su estudio, caracterización, aplicación y control de los mismos. Por ejemplo se puede necesitar que el desarrollo del microorganismo se produzca de forma masiva, mientras que en otras resulta indispensables que las colonias queden aisladas o que las manifestaciones del metabolismo tengan lugar con tensiones reducidas o privadas de oxígeno.

9


También ha permitido propagar a los microorganismos en cultivos mixtos, así como su aislamiento y la obtención de cultivos puros.

2. Describe las características del crecimiento de cada uno de los cultivos bacterianos proporcionados en la práctica . a) PLATE COUNT AGAR : Recomendado para la determinación y recuento de microorganismos en alimentos, aguas y aguas residuales.

FORMULA:  Caseína enzimática hidrolizada 5.0 gr  Extracto de levadura 2.5 gr  Dextrosa 1.0 gr  Agar 15.0 gr pH final 7.0 +/- 0.2

b) Tryptic Soy Broth TSB (medio de digerido de soja y caseína) es un medio líquido para enriquecimiento de uso general utilizado en procedimientos cualitativos para la prueba de esterilidad y para el enriquecimiento y cultivo de microorganismos aerobios no exigentes en exceso. Es un medio nutritivo que favorece el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos, en especial las bacterias anaerobias f acultativas y aerobias comunes. Debido a su capacidad para favorecer el crecimiento, esta fórmula fue adoptada por la Farmacopea de Estados Unidos (USP) y la Farmacopea Europea (EP) como medio de prueba de esterilidad. Bacto Tryptone (digerido pancreático de caseína) Bacto Soytone (digerido péptico de harina de soja)

10

17,0 g 3,0


Glucosa (dextrosa) Cloruro sódico Fosfato dipotásico de hidrógeno

2,5 5,0 2,5

Fórmula por litro de agua purificada

CONTROL DE CALIDAD Cepa de prueba Staphylococcus aureus ATCC 6538 Bacillus subtilis ATCC 6633

Resultados de crecimiento esperados (turbidez)* +++ o más +++ o más

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 Candida albicans ATCC 10231

+++ o más +++ o más

Aspergillus niger ATCC 16404

+++** o más Ambar claro a mediano, transparente, sin precipitación

Sin inocular

c) Tripteina Soya Agar TSA es un medio utilizado para propósitos generales, favorece el desarrollo y aislamiento de una gran variedad de microorganismos aerobios, y anaerobios facultativos y estrictos. El agregado de sangre, permite el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes y la observación de reacciones de hemólisis. También, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate. FÓRMULA

CONTROL DE CALIDAD

11


d) SIM Medio Es un medio semisólido destinado a verificar la movilidad, producción de indol y de sulfuro de hidrógeno en un mismo tubo. Es útil para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

FÓRMULA

CONTROL DE CALIDAD

3. Describe el método de siembra por incorporación y señala en qué casos se emplea La siembra por incorporación puede tener ciertas ventajas como por ejemplo Menor error en el recuento, mejor aprovechamiento de nutrientes por parte de los microorganismos, Se puede utilizar para el recuento de organismos anaerobiospero puede presentar desventajas como la dificultad para subcultivar colonias, difícil visualización de colonias y la temperatura del agar puede afectar a ciertos microorganismos

12


Fuentes de información PREGUNTAS Y RESPUESTAS SOBRE LA MICROBIOLOGIA DE LA LECHE Y LOS PRODUCTOS LÁCTEOS, RICHARD ELLNER, EDICIONES DÍAS DE SANTOS S.A., MADRID-ESPAÑA,  https://es.scribd.com/doc/21943852/Tecnicas-Basicas-Para-El-Cultivode-Microorganismos 



http://www.britanialab.com.ar/esp/productos/b02/simedio.htm



http://www.labmedibac.com/medio-caldo-tsb-medio-de-cultivo-caldo-tsbtriptic-soya-broth/



http://www.mastgrp.com/IFUS/IFU342_SPA.pdf

13

Técnicas de Cultivo - 1

Recommend Documents