“TECNICAS DE AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN, CONSERVACIÓN CONSERVACIÓN Y PROPAGACION DEMICROORGANISMOS”
alumno o apren aprende derá rá a elabo elaborar rar distin distintos tos medio medios s de culti cultivo vo y a OBJET OBJETIV IVO; O; el alumn desarrollar la técnica de cultivo por estría cruzada para el aislamiento de bacterias.
FUNDAMENTOS
El crecimie crecimiento nto de los microorg microorganis anismos mos no se puede puede estudiar estudiar individ individualm ualment ente e debido a su tamaño microscópico, por lo que es necesario recurrir a medios de nutritivos artificiales, donde se puedan desarrollar y producir grandes poblaciones, para manipular y realizar investigaciones. Existe una variedad muy amplia de medios de cultivo, pero esta ocasión ablaremos de algunos en particular. Existen diferentes tipos de medios de cultivo, se debe utilizar el medio que cumpla con con
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para para que el micr microo oorrgan ganismo ismo de inte interé rés s
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adecuadamente adecuadamente por e!emplo, e!emplo, ay medios medios llamados selectivos selectivos,, que permiten el crecimiento de determinadas bacterias e iniben el desarrollo de otras porque pose poseen en
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diferenciales, diferenciales, son usados usados para aislar los organismos organismos dentro de una mezcla, mezcla, por los caracteres diferenciales que presentan. #uelen ser medios sólidos y se basan en la capacidad de fermentación de un determinado az$car %&ranados, '(()*. +n medio medio de tipo tipo selec selectiv tivo o y difer diferenc encia iall es e "gar gar E-, E-, adec adecua uado do para para el crecimie crecimiento nto de Entero Enterobac bacteri terias/. as/.Est Esté é medio medio es utilizad utilizado o para la b$squed b$squeda a y diferenciación de bacilos entéricos, a partir de muestras clínicas, principalmente, aguas servidas, y otros materiales. Está recomendado por la "merican 0ublic 1ealt "ssociation, para el análisis microbiológico de productos lácteos y alimentos, y por la +#0 para la realización de los ensayos límite microbiológicos. 2a fórmula original de este medio de cultivo, fue modificada por 2evine, eliminando la sacarosa e incrementando la concentración de lactosa, lo que permite una me!or diferenciación de E. coli % "lfonso, '(()*.
“TECNICAS DE AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN, CONSERVACIÓN Y PROPAGACION DEMICROORGANISMOS” 2a combinación utilizada de eosina y azul de metileno, inibe el desarrollo de microorganismos &ram positivos y de bacterias &ram negativas fastidiosas, y también, permite diferenciar bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa % "lfonso, '(()*.
2os microorganismos fermentadores de lactosa, originan colonias de color azulado3negro, con brillo metálico. 2as colonias producidas por microorganismos no fermentadores de lactosa son incoloras. "lgunas bacterias &ram positivas %cepas de estafilococos, enterococos* y levaduras, pueden crecer, originando colonias incoloras y puntiformes. Este medio de cultivo, es $til para la orientación y no confirmación de especies bacterianas %ya que numerosas cepas de Citrobacter spp. producen colonias con brillo metálico*, por lo cual será necesario realizar pruebas bioquímicas, para la identificación de género y especie. edio preparado4 color p$rpura con tonos verdosos, ligeramente tornasolado con un precipitado floculento disperso %5elc, '((6*.
Agar eos!a"a#$% &e 'e(%e!o)
"&"7 #"2 8 "9:;<2
“TECNICAS DE AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN, CONSERVACIÓN Y PROPAGACION DEMICROORGANISMOS” 2a degradación del manitol con producción de ácido cambia el color del medio, de rosado a amarillo. 2a formación de colonias de estafilococos no patógenos son de tamaño pequeño rodeadas de una zona ro!a. 2os estafilococos patógenos producen ácido del manitol, desarrollan colonias más grandes rodeadas de una zona amarilla. #i se agrega a cada litro de medio, una yema de uevo en condiciones de esterilidad, los estafilococos, que además de fermentar el manitol producen lipasa, darán un precipitado amarillento de ácidos grasos alrededor de la colonia. Este fenómeno comprueba la propiedad de coagular el plasma que presentan
los
estafilococos
patógenos
coagulasa
positivos.
2a
elevada
concentración de cloruro de sodio inibe a la mayoría de las bacterias que son alo3sensibles y favorecen a los estafilococos alo3resistentes %0isabarro, '((6*.
MATERIAL A USAR 3
Ca*as Pe(r +o! agar !$(r(o)
2
Ca*as Pe(r +o! agar &e eos!a"a#$% &e 'e(%e!o)
2
Ca*as Pe(r +o! agar -ara Es(a.%o+o+os) Ca*as Pe(r +o! 'e&o '/!'o &e sa%es) T$o +o! ag$a &es(%a&a es(0r%) T$1os +o! agar !$(r(o) Me+2ero) Asa &e !o+$%a+3!) Parr%%a &e ag(a+3!) A$(o+%ae)
2 1 4 1 1 1 1
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18 1 1 1
Pa-e% -ara.%' Mar+a&or Fra!e%a B(4+ora
REACTIVOS Agar nutritivo5 -e-(o!a &e +ase/!a, NaC%,
e6(ra+(o &e +ar!e, agar) Agar eosina-azu !e "etieno5 Pe-(o!a
&e ge%a(!a, %a+(osa, sa+arosa, 789PO:, eos!a, a#$% &e 'e(%e!o) Agar #ara esta$o%o%os5 e6(ra+(o &e %ea&$ra, -e-(o!a, +ase/!a, ge%a(!a, %a+(osa, D"'a!(o%, NaC%,789PO:, agar) Me!io "&ni"o !e saes5 g%$+osa, N9:<8SO:, MgSO:)=98O, 789PO:,FeSO:)=98O) Ba+%%$s s$1(%s, Es+2er+2a +o%) Pse$&o'o!as >$ore+e!s) S(re-(o+o++$s s-) S(a-2?%o+o+$s a$re$s) 7%e1se%%a s-)
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M$es(ra -ro1%e'a A%+o2o% a% =@
RESULTA'OS IDENTIFICACION DE LAS CARACTERISTICAS DE LA FORMA DE LAS COLONIAS EN CADA CLTIVO M+roorga!s'o +$%(a&o; Escherichia coli Me&os &e +$%(o;
presento un color amarillento con superficie umbilicada, notamos colonias separadas con forma irregular y filamentosa y también con bordes ondulados la cepa tenia aproximadamente ' mm de espesor.
A. Nutritivo;
“TECNICAS DE AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN, CONSERVACIÓN Y PROPAGACION DEMICROORGANISMOS” s$ 'oro%og/a s$-er.+a% es -%a!a, +o! -e$eas #o!as -%a!o+o!e6a, -rese!(a! +o%o!as as%a&as +o! or'a -$!(or'e ? $sor'e +o! 1or&es re&o!&os) La +e-a es &e a'ar%%e!(o +o! a-ro6'a&a'e!(e a 8 '' &e es-esor) Me!io "&ni"o !e saes (MMS)*
La +e-a -rese!(a $!a +o%ora+3! rosa, s$s +o%o!as se e!+$e!(ra! se-ara&as 'e&a!as, +r+$%ares, +o!e6as) Prese!(a 1or&es re&o!&ea&os &e 8 a : '' &e &4'e(ro)
A+ Eosina azu !e "etieno (EM,)+
A) ara esta$o%o%os* s$ +re+'e!(o es(e 'e&o &e +$%(o)
$e !21&o e!
M+roorga!s'o +$%(a&o; staphylococcus aureus
Medios de cultivo
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-rese!(a $! +o%or a'ar%%e!(o, +o! +o%o!as se-ara&as, s$ s$-er.+e es -%a!o+o!e6a, s$s -e$eas +o%o!as (e!e! or'a -$!(or'e ? $sor'e +o! 1or&es re&o!&ea&os ? +o! $! grosor &e a-ro6'a&a'e!(e '')
A. .utritivo*
Me!io "&ni"o !e saes (MMS)* -rese!(a! $! +o%or a'ar%%e!(o, s$
s$-er.+e es -%a!a +o! +o%o!as as%a&as $e -rese!(a! $!a or'a +r+$%ar e rreg$%ar +o! 1or&es o!&$%a&os ? +o! $! grosor &e 8 '')
%a 1a+(era o %%ego a +re+er e! s$ (o(a%&a& &e1&o a $e es(e 'e&o &e +$%(o '-&e e% +re+'e!(o &e 1a+(eras gra' -os(as ? S) a$re$s es $!a &e e%%as)
A+ Eosina azu
!e "etieno (EM,)*
A+ ara esta$o%o%os* -rese!(a! $! +o%or a'ar%%e!(o
+o! s$-er.+e $'1%+a%, (e!e +o%o!as se-ara&as +r+$%ares e rreg$%ares +o! 1or&es o!&$%a&os ? +o! $! grosos &e a-ro6'a&a'e!(e '')
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M+roorga!s'o +$%(a&o; Pseudomonas
Medios de cultivo
+re+3 e! or'a &e a!%%o, +o! +o%o!as 1r%%a!(es +o!>$e!(es &e 1or&e +o!(!$o (e!e!&o $!a (o!a%&a& er&osa) S$ s$-er.+e es a+$'!a&a s$ 'oro%og/a +o%o!a% es +r+$%ar +o! 1or&es re&o!&ea&os)
A+ .utritivo*
Prese!(o $! +o%or a'ar%%e!(o +o! s$-er.+e -%a!a &e or'a rreg$%ar ? +o! 1or&es re&o!&ea&os (e!e!&o $! grosor &e a-ro6'a&a'e!(e 8 '') Me!io "&ni"o !e saes (MMS)*
A+ Eosina azu !e "etieno (EM,)* -rese!(a $! +o%or rosa&o +%aro
+o! $!a s$-er.+e -%a!o +o!e6a +o! or'a $sor'e e! s$s +o%o!as as%a&as ? +o! 1or&es re&o!&ea&os +o! $! grosor &e a 8 '')
“TECNICAS DE AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN, CONSERVACIÓN Y PROPAGACION DEMICROORGANISMOS” Agar #ara esta$o%o%os* -rese!(o $! +o%or a'ar%%e!(o
+o! s$-er.+e -%a!a, +o! or'a rreg$%ar ? 1or&es re&o!&ea&os, +o! $! grosor &e '' a-ro6'a&a'e!(e ? +o! +o%o!as se-ara&as)
DISCUSION DE RESULTADOS:
2a siguiente práctica ace referencia a las técnicas de aislamiento de microorganismos, con las cual podemos conservarlos y llevar a cabo una identificación morfológica de los microorganismos que se inocularon en los diferentes medios que acabamos de mencionar como por e!emplo fue el agar nutritivo en el que se prepararon en tubos de ensaye, cuando esto sucedió se inoculo con los siguientes microorganismos como%E.coli, #aureus ,seupdomonas* en cada uno y en los cuales se realizaron para su conservación con las siguientes técnica que fue por cola de ratón, lo que paso es que en este medio de cultivo con estos tres microorganismos que se inocularon crecieron exitosamente debido a que a su composición del agar nutritivo, ya que tiene un alto contenido en nutrientes ,a comparación del medio mínimo de sales que se dividió en tres partes para inocular nuestros tres microorganismos y poder realizar nuestra técnica de estría cruzada para su conservación pero debido a su escaza y muy simple composición de nutrientes de este medio no creció ninguno de nuestros microorganismos. Esto es muy curioso ya que aquí tiene que ver muco nuestra técnica de aislamiento para que nuestro microorganismo se conserve y lo podamos identificar además de que también tiene que ver al medio que lo sometas ,esto es distinto a lo que paso en el medio de caldo nutritivo ya que en este medio se inocularon nuestros tres microorganismos y se realizó la técnica cola de ratón para conservarlos pero debido a que en este medio que se realizó en tubos con rosca solo creció o desarrollo %E.coli,#.aureus*ya que estos no necesitan de un excesivo requerimiento nutricional aunque creció poco pero tiene muco que ver la técnica que realizas y su composición del medio , En nuestro medio mínimo de Eosina azul de metileno se realizó en cada placa se inoculo con nuestros tres microorganismos para que estos crecieran y se conservaran con nuestra técnica de estría cruzada solo, que al revisar no creció nada porque se supone que este medio es selectivo e inibe el crecimiento de &ram negativas y positivas con lo cual nos damos cuenta que con este medio podemos seleccionar
“TECNICAS DE AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN, CONSERVACIÓN Y PROPAGACION DEMICROORGANISMOS” microorganismos que quieramos,para terminar nuestro siguiente medio es el de "gar para estafilococos en este también se dividió en tres partes y se inoculo los tres microrganismos y se realizó para aislarlos la siguiente técnica que es la de estría cruzada y cuando terminamos esto, obtuvimos como resultado que el $nico microorganismos que iba a crecer es %#.aureus* ya que este medio solo es selectivo y este aísla alas demás microorganismos que no son similares en conclusión lo que nosotros nos dimos cuenta fue de que los medios mínimos debido a su distinta composición y a las diferentes técnicas para aislar los microorganismos tienen un distinto índice de crecimiento de estos ya que no todos los medios son similares por eso con ello podemos identificar y aislar nuestros microorganismos o consérvalos de manera eficiente permitiendo una gran facilidad de manipular nuestros microorganismos.
Conclusión
Esta práctica fue muy interesante y nos será de gran utilidad en un futuro como biotecnologos, pues aprendimos una gran variedad de medios de cultivo para conservación y=o reproducción de microorganismos además de que cada medio de cultivo posee propiedades químicas que lo distinguen de los demás. Existen una gran variedad de microrganismos que podemos cultivar en el laboratorio pero, no todos crecen ba!o las mismas condiciones %p1, nutrientes, temperatura etc.*, es por eso que se an inventado una gran variedad de cultivos, para poder cultivar a los microorganismos en el laboratorio.