INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA LABORATORIO DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
Separación e identificación de aminoácidos de jugo de frutos por cromatografía bidimensional en capa fina
Alumno: Rico Inocencio José Orlando Compañero: Salinas Ceja Fernando Grupo: 5Qv2 Sección: 2 Profesores: Hernández Fernando Rosas Sandoval Guillermina Macías Martínez Victor Manuel Luis Rivas Farias Arturo
Separación e identificación de aminoácidos de jugo de frutos por cromatografía bidimensional en capa fina Introducción La cromatografía es un método de separación en la que los componentes de una mezcla se separan por diferencia en la velocidad con la que se mueve cada uno de los solutos a través de un medio, arrastrado por un disolvente en movimiento. Los elementos del sistema cromatográfico son: soporte, fase estacionaria y fase móvil o eluyente. El parámetro experimental asociado a la técnica es el Rf (coeficiente de reparto), que expresa la interacción de cada compuesto entre la fase estacionaria y fase móvil, y que depende de su estructura química y polaridad (Jesús V. Jorrín, 2011).
Objetivo Separar e identificar los aminoácidos presentes en jugo de toronja por cromatografía unidimensional y bidimensional en capa fina, comparando el grado de resolución de las mismas y evaluando posibles alteraciones durante el proceso de elaboración.
Resultados Tabla 1. Cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las dos fases móviles. 2° fase móvil
1° fase móvil Aminoácido Arg Lys Pro Gly Glu His Thr Tyr Met Phe
Frente de soluto* 1.7 2 4.1 4.5 5.3 5.4 5.8 6.3 6.4 6.7
Frente de disolvente* 7.6 7.6 7.6 7.6 7.6 7.6 7.6 7.6 7.6 7.6
Rf 0.22 0.26 0.53 0.59 0.69 0.71 0.76 0.82 0.84 0.88
Frente de soluto* 1.1 0.8 2.1 2.3 2.1 1 2.6 4.6 4.3 4.9
Frente de disolvente* 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9 7.9
Rf 0.13 0.10 0.26 0.29 0.26 0.12 0.32 0.58 0.54 0.62
*Unidades en centímetros (cm)
Fd
Fs1
Fig.1 Cromatograma unidimensional desarrollado con la fase móvil de clorofor mometanol-amoníaco 17% (2:2:1) Cálculo del valor de Rf =
Ejemplo: Rf del aminoácido arginina. = =
1
1.7 7.2
= 0.2236
Fig. 2 Cromatograma unidimensional desarrollado con la fase móvil de Butanol-Ác. Acético-agua (3:1:1)
Tabla 2. Cromatograma bidimensional tipo desarrollado en las 2 fases móviles No. de mancha 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
1° fase móvil Frente de Frente de soluto* soluto* 1.1 7.9 1.2 7.9 2.4 7.9 3.3 7.9 3.4 7.9 3.9 7.9 4.6 7.9 5.2 7.9 5.3 7.9 5.4 7.9
Rf 0.13 0.15 0.3 0.41 0.43 0.49 0.58 0.65 0.67 0.68
2° fase móvil Frente de Frente de soluto* disolvente* 1.3 8.7 1.7 8.7 3 8.7 3.2 8.7 2.5 8.7 3.3 8.7 5.5 8.7 5.2 8.7 3.2 8.7 5.9 8.7
Rf
Aminoácido
0.14 0.19 0.34 0.36 0.28 0.37 0.63 0.59 0.36 0.67
Arginina Lisina Prolina Glicina Histidina Ác. Glutámico Treonina Tirosina Metionina Fenilalanina
Fig. 3 Cromatograma bidimensional tipo Tabla 3. Cromatograma bidimensional problema desarrollado en las 2 fases móviles No. de mancha 1 2 3 4 5 6
1° fase móvil Frente de Frente de soluto* soluto* 4.4 7.5 4.5 7.5 5.1 7.5 6.3 7.5 6.7 7.5 7.4 7.5
Rf 0.58 0.6 0.68 0.54 0.89 0.98
2° fase móvil Frente de Frente de soluto* disolvente* 2.8 7.6 3.5 7.6 2.2 7.6 2.7 7.6 2.3 7.6 5.1 7.6
Rf 0.36 0.46 0.28 0.35 0.3 0.67
Fig. 4 Cromatograma bidimensional problema Tabla 4. Cromatograma bidimensional problema (IV) desarrollado en las 2 fases móviles No. de mancha 1 2 3 4 5 6
Rf creciente en la 1° fase móvil 0.58 0.6 0.68 0.84 0.89 0.98
Rf creciente en la 2° fase móvil 0.36 0.46 0.28 0.35 0.3 0.67
aminoácido correspondiente Glicina Treonina Ác. glutámico Tirosina Metionina Fenilalanina
Discusión De acuerdo a los resultados obtenidos, en la tabla 1 se presentan los cromatogramas unidimensionales tipo desarrollados en las 2 fases móviles en donde se puede observar las diez manchas correspondientes a las soluciones tipo de aminoácidos distribuidas en función de su estructura. El orden de elución fue el siguiente: Arginina, lisina, prolina, glicina, ácido glutámico, histidina, treonina, tirosina, metionina y fenilalanina; Denotando que los aminoácidos más polares son arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos que más se desplazaron fueron fenilalanina, metionina y tirosina, reparto explicado debido a su interacción hidrofóbica con el disolvente cloroformo-metanol-amoníaco y por la repulsión con la fase estacionaria. El coeficiente de reparto de cada aminoácido en la cromatoplaca 2
disminuye proporcionalmente al aumento en la polaridad de los disolventes utilizados en comparación a los utilizados en la primer cromatoplaca. Ambos cromatogramas solo permitieron la identificación relativa de los aminoácidos glicina, metionina, treonina, tirosina, prolina y fenilalanina, denotándolos como las manchas más características, dado que la concentración del jugo no permitió visualizar una correcta resolución. En el caso del cromatograma bidimensional tipo (Fig. 3), se observan diez manchas correspondientes a los diez aminoácidos y que al comparar el coeficiente de reparto con los de los anteriores cromatogramas, estos se identificaron. En el cromatograma bidimensional problema (Fig. 4) en donde se aplicó el jugo de jitomate se observaron 6 manchas distinguibles, las cuales corresponden a los aminoácidos: Glicina, treonina, ácido glutámico, tirosina, metionina y fenilalanina, que comparando con la bibliografía son aminoácidos que forman parte del jugo de jitomate*, se cree que sí no se hubiera aplicado este orden en las fases móviles, no se hubiera presentado esta buena resolución, recalcando que el uso de las fases móviles se encuentra sujeto a un incremento en la polaridad conforme se aplican. * Ácido aspártico, ácido glutámico, alanina, arginina, cisteína, fenilalanina, glicina, prolina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, serina, tirosina, treonina, triptófano, valina .
Cuestionario 1. Investigar en la literatura los aminoácidos que contiene el jugo empleado como problema. Aminoácidos del juego de jitomate: Ácido aspártico, ácido glutámico, alanina, arginina, cisteína, fenilalanina, glicina, prolina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, serina, tirosina, treonina, triptófano, valina. 2. Escriba la reacción completa y con nombres, de la ninhidrina con un aminoácido.
Reacción del reactivo Ninhidrina con un aminoácido
3. ¿Es posible cambiar el orden de las fases móviles? Explique su respuesta. Si es posible, pero está sujeto a un incremento en la polaridad conforme se aplican las fases móviles, debido a que el movimiento del soluto está sujeto a interacciones con la fase móvil, al aumentar la polaridad de la fase móvil en una fase estacionaria polar, disminuye el coeficiente de reparto, por lo que se recomienda conocer la polaridad del soluto para aprovechar eficientemente el espacio bidimensional de la placa cromatográfica, lo cual a su vez proporcionaría una mejor resolución. 4. Indique las posibles fuentes de error de esta técnica. No usar guantes. La inclinación en la que se coloca el cromatograma durante el corrimiento, para evitar solapamiento entre solutos. Uso de disolventes adecuados. Que las cámaras no se saturen con el disolvente empleado.
Conclusiones Los aminoácidos obtenidos e identificados a partir de la cromatografía bidimensional en capa fina en la muestra problema (juego de jitomate), fueron: Glicina, treonina, ácido glutámico, tirosina, metionina y fenilalanina. La cromatografía bidimensional proporciona una mejor resolución que la unidimensional, sujeta al uso de la fase móvil adecuada.
Referencias bibliográficas Separación de aminoácidos por cromatografía en capa fina y detección mediante reacción con ninhidrina, Jesús V. Jorrín Novo, Ma. Nieves Abril Díaz, José A. Bárcena Ruiz, 2011. Departamento de bioquímica y biología molecular, campus Universitario de Rabanales, edificio Severo-Ochoa 14071-Còrdoba. Determinación de aminoácidos en productos pesqueros J. M. Gallardo, L. Pastoriza y M. López Benito, 1979. Inf. Técn. Inst. Inv. Pesq. Voet, D., Voet, J. Bioquímica, 3ª edición, editorial Médica Panamericana, 2006; Pág. 150151. Aminoácidos del jitomate. Javier Callón Álvarez. Calle Energía 36 piso 3 puerta 4, CP 08038, Barcelona.11 de Julio del 2002. http://alimentos.org.es/aminoacidos-tomate
