LABORATORIO BIOQUÍMICA 1.2
PROFESOR: NICOLAS FORRERO
SEPARACIÓN DE AMINOÁCIDOS POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA María Fernanda Acevedo Ortiz Jeison Contreras Hoyos Jason Alexander Torres Parra Química industrial, Jornada Noche, Corporación tecnológica de Bogotá, Colombia-Bogotá D.C. RESUMEN: Se sembraron diferentes aminoácidos (glicina, glutamato, fenilalanina, lisina, Aspartame en agua y Aspartame en HCl) y un producto comercial (Cola-cola Zero) en una placa de sílice, para ser separadas por la fase móvil (Butanol: Ácido Acético: Agua. En relación 12:3:5) para determinar cuál de ellas es más polar en ese solvente. PALABRAS CLAVE: aminoácidos, solvente, polaridad, glicina, glutamato, fenilalanina, lisina, aspartame
ABSTRACT: Different amino acids (glycine, glutamate, phenylalanine, lysine, aspartame in water and aspartame in HCl) and a commercial product (Cola-cola zero) were seeded on a silica plate, to be separated by the mobile phase (Butanol: Acetic acid: Water, in relation to 12: 3: 5) to determine which of them is more polar in that solvent. KEYWORDS: Amino acids, solvent, polarity, glycine, glutamate, phenylalanine, lysine, aspartame INTRODUCCIÓN: La cromatografía de capa fina es un procedimiento que se utiliza para separar moléculas relativamente pequeñas. Al igual que otras cromatografías, consiste de una fase estacionaria y una fase móvil y el principio es el mismo: la sustancia de interés se adherirá a la fase estacionaria o se moverá con la fase móvil, viajando una distancia que es inversamente proporcional a la afinidad por la fase estacionaria. La fase estacionaria puede ser variada. Puede ser de papel, de celulosa o de un gel de silicato (vidrio molido bien fino) unido a una superficie sólida (una placa de vidrio, aluminio, plástico o papel). Esta superficie sólida puede ser rígida o flexible. El tipo de fase estacionaria que se utilice en un experimento dependerá del tipo de moléculas que se quieran separar. Incluso vienen algunas placas con indicadores fluorescentes. La fase estacionaria consiste de un solvente que puede ser agua, un solvente orgánico o una mezcla de ambos.
PROCEDIMIENTO Coloque 5 mL de fase móvil (Butanol: ácido acético: agua) en la cámara cromatográfica y deje saturar por 30 minutos. Sobre la placa de sílice, suavemente con un lápiz, trace una línea a 1.0 cm desde la base. Sobre esta línea va a sembrar las muestras de aminoácidos y de análisis. En un tubo de ensayo tome 50 mg de aspartame y adicione 5 mL de HCl 3 M. Caliente en mechero por 30 segundos, sin dejar que el contenido se evapore. Precaución, desarrollar este paso sujetando el tubo de ensayos con pinzas y orientar la boca del tubo en dirección opuesta a cualquier persona. En un tubo de ensayo tome 50 mg de aspartame y disuélvalos en 5 mL de agua. En tubos de ensayo, disuelva 20 mg de cada aminoácido en 5 mL de agua. Con un capilar siembre en la placa cubierta de sílice Placa 1: Línea 1: Glicina. Línea 2: Glutamato. Línea 3: Fenilalanina. Línea 4: Lisina Placa 2: Línea 1: Fenilalanina. Línea 2: Aspartame en agua. Línea 3: Aspartame en HCl. Línea 4: CocaCola Zero En cada caso siembre 5 veces con el capilar y use un solo capilar por cada muestra. En el caso de la bebida comercial siembre 10 veces, dejando entre cada sembrada que la muestra se seque, use una estufa para este caso. Coloque las placas en la cámara cromatográfica, previamente preparada con la fase móvil, y deje que la fase móvil recorra la placa hasta que llegue a 1 cm del límite superior de esta.
La ninhidrina a pH entre 4 y 8 es un oxidante muy fuerte y siempre reacciona con los grupos de a-amino libreando amonio, el cual se condensa con la ninhidrina reducida y con otra molécula de ninhidrina formando un compuesto coloreado que varía de azul a violeta púrpura.
Mecanismo de reacción
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Retire la placa de la cámara, deje secar por 5 minutos en estufa (hasta que ya no perciba el olor a solvente) Coloque el agente de revelado, solución de ninhidrina 0,2 %. Seque en estufa a 70°C por 2 minutos. Tome con cuidado la placa y calcule los Rf para cada marca.
RESULTADOS Y ANÁLISIS DE RESULTADOS
Placa 2. # 5 6 Placa 1. #
Nombre de la Muestra
Color de la mancha
1 2 3
Glicina Glutamato Fenilalanina
4
Lisina
Amarillo Café Claro Violeta Café oscuro
=
7 Distancia recorrida Rf (cm) 0 0 0 0 1 0.333 0
0
1. = = 0
8
Distancia recorrida (cm)
Rf
Morado
1
0.333
Café
1.5
0.5
Amarillo
2
0.666
Lila
0
0
Nombre de Color de la la Muestra mancha Fenilalanin a Aspartame en agua Aspartame en HCl CocacolaZero 1
5. = = 0.333 1.
6. = = 0.5 2
7. = = 0.666
8. = = 0
CONCLUSIONES La Glicina, el glutamato y la lisina plantados en la primera placa no son polares con el solvente usado
2. = = 0 1
3. = = 0.333
4. = = 0
En la placa dos, se puede evidenciar que el más polar es el aspartame en HCl, seguido por el aspartame en agua y la fenilalanina, dejando por último, el producto comercial (coca cola Zero) que no presenta polaridad
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