ANÁLISIS CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA DE EXTRACTO DE ACEITE VEGETALES ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO Las técnicas cromatográficas se basan en la separación de las sustancias presentes presentes en una mezcla compleja al poner ésta en contacto con una fase móvil (líquido o gas) y otra estacionaria (sólida o líquida) que permanece fija. Las Las sustancias van van a migrar a través través de la fase estacionaria estacionaria arrastradas por la fase móvil a distinta velocidad seg!n su afinidad o solubilidad en una u otra fase. Las sustancias más afines por la fase estacionaria migrarán más despacio y las más afines por la fase móvil más deprisa. "justando "justando los parámetros cromatográficos cromatográficos conseguiremos conseguiremos separar todos todos los componentes. componentes. Los tres tipos tipos más comunes comunes son la cromatografía en capa fina (##$) cromatografía de gases (#%L) y la de líquidos (&'L#).
CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA (CCF) e emplea en controles de todo tipo de productos naturales abiéndose establecido como método analítico muy importante en las farmacopeas far macopeas modernas. modernas. 'ermite identificar de forma rápida y bajo coste los componentes presentes en un determinado material vegetal. *ambién *ambién se puede emplear como método semicuantitativo. +n un proceso de cromatografía líquida entran en juego por lo tanto tres elementos principales, el adsorbente y su forma física de apoyo el sistema eluyente y su composición concreta y finalmente la muestra a analizar y su naturaleza química. +l soporte de la *L# son placas de má-imo / - / cm de vidrio aluminio o plástico recubiertas por una cara de una fina capa de material adsorbente que tradicionalmente a sido celulosa gel de sílice ó-ido de aluminio o poliamida y que !ltimamente se a ampliado la gama de posibilidades a sílices químicamente modificados. +l n!mero de sistemas eluyentes son casi infinitos. 0ayoritariamente son combinaciones de disolventes de diferentes polaridades con presencia ocasional de ácidos o bases. +l !nico requisito que se e-ige a estos reactivos químicos es que contengan pocas impurezas y por lo tanto es redundante decir que su grado de riqueza sea elevado. on aconsejables los productos de calidad '" (para análisis) como mínimo. #on respecto a las muestras la mayoría de los materiales utilizados en los procedimientos artísticos son sustancias complejas. 1n barniz como el damar por ejemplo no es una sustancia química pura sino que está formado por mucos componentes los triterpenos entre otros. #uando #uan do se 2sie 2siemb mbra ra33 una una gota gota de una una diso disolu luci ción ón de esta esta resi resina na cerc cercaa del del e-tr e-trem emoo de una una plac placaa cromatográfica y acto seguido se sumerge en un determinado sistema eluyente contenido en un recipiente especialmente pensado para este uso éste empieza a ascender por capilaridad por encima de la placa (fase estacionaria) arrastrando la muestra de barniz. Lo que sucederá transcurridos unos minutos es que cada componente diferente del damar se quedará a una distancia concreta del origen seg!n presente más o menos afinidad por los disolventes de la fase móvil 2dibujando3 un spot o manca. +l conjunto de todas estas mancas y su distribución relativa se convierte en una especie de uella digital de la resina que la permite identificar. La pregunta que surge aora es cómo el conservador4restaurador sabe que éste conjunto de 2mancas3 corresponden precisamente precisamente al damar y no a ning!n otro barniz. La respuesta está en los patrones.
5os resinas diferentes como el damar la almáciga la colofonia la sandáraca o también la goma laca nunca presentarán la misma composición química y por lo tanto siempre se puede encontrar un sistema eluyente y unas condiciones cromatográficas concretas que nos permitan obtener distribuciones de mancas propias y perfectamente distinguibles para cada uno de los barnices. La forma de actuar por lo tanto es cromatografiar junto con la muestra4problema que queremos analizar todos aquellos patrones de resinas conocidas que sospecamos que pueden constituir el barniz de nuestra pieza. 1na vez desarrollada la cromatografía por comparación con las 2uellas digitales3 obtenidas podremos identificar sin duda la naturaleza del barniz presente en el objeto artístico. +s absolutamente recomendable para obtener buenas identificaciones sembrar siempre patrones junto a la muestra que se quiere analizar para que se desarrollen e-actamente con las mismas condiciones y no utilizar resultados de antiguas cromatografías. 6ariables como la temperatura o el grado de saturación de la cubeta influyen en el proceso provocando peque7as variaciones en la distribución de las diferentes alturas de las 2mancas3. +s cierto tal y como dicen 0auro 0atteini y "rcangelo 0oles [19] que la cromatografía en capa fina o *L# presenta el inconveniente de requerir un trabajo prolongado de puesta a punto de las condiciones operativas, encontrar qué composición debe tener el sistema eluyente determinar el tipo de adsorbente a utilizar y concretar otras condiciones cromatográficas que veremos más adelante todo para la resolución de un problema analítico muy concreto. "ora bien una vez an sido establecidas las condiciones óptimas la cromatografía de capa fina se convierte en uno de los métodos con más ventajas de la química analítica. "sí pues en el caso de la *L# una posible colaboración entre ciencia y restauración podría ir por el siguiente camino, primero el científico investiga y encuentra las condiciones operativas óptimas (pone a punto una metodología) para resolver un determinado problema por ejemplo la identificación de barnices. 1na vez encontrada la presenta al conservador4restaurador traducida a un sencillo protocolo de análisis que éste puede seguir él mismo cada vez que se encuentre en la necesidad de resolver analíticamente una identificación similar.
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¿CÓMO SE HACE UNA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA? Protocoo !"t#$%&r %! %!"&rroo cro'&tor#*co TLC +4 eg!n las condiciones operativas de cada metodología se puede necesitar un tratamiento previo de la placa o no. 'uede tratarse de, "ctivación dentro de la estufa a 8/9 # durante :/ minutos para eliminar toda el agua adsorbida. Limpieza previa para eliminar impurezas aciendo ascender por la placa el mismo sistema eluyente que se utilizará en la cromatografía pero sin aber sembrado las muestras. ,4 'reparación del sistema eluyente en las proporciones indicadas. "costumbran a ser suficientes entre ; y ;/ ml en total. e introduce en la cubeta de manera que el nivel del líquido no quede por encima de 8 cm de altura. i ace falta se vierte una cantidad controlada del eluyente dentro de la cubeta tapada durante un tiempo determinado para que tenga lugar el equilibrio entre las fases del líquido y vapor (saturación de la cubeta). -4 #on ayuda de un lápiz se ace una línea a unos cm de uno de los lados de la placa.
forzar esta evaporación con un secador de aire. =o obstante ay que ir con cuidado y no transmitir demasiado calor a las muestras. 04 e introduce la placa dentro de la cubeta teniendo en cuenta que no ay que tenerla destapada más tiempo de lo estrictamente necesario. e deja que el eluyente ascienda por la placa asta una altura tal que falten 8 o cm para llegar al e-tremo superior. > si ya se tiene el tiempo controlado se deja transcurrir el tiempo que indica el protocolo. 14 1na vez transcurrido el tiempo necesario se saca la placa de la cubeta y antes de que los disolventes se evaporen se marca la línea dónde a llegado el frente del sistema eluyente. e deja acabar de evaporar a temperatura ambiental asta que la placa esté bien seca. 24 i los compuestos no son visibles ni con luz natural ni con luz 16 ace falta acer un proceso de revelado químico rociando sobre la placa un producto revelador. +l revelador es una sustancia capaz de reaccionar químicamente con los compuestos cromatografiados dando productos de reacción que adsorben en la zona visible y por lo tanto presentan color o en la zona 16 siendo semillas observables con lámparas de ?ood. +ste paso es aconsejable acerlo en cabinas de e-tracción de gases y con elementos de protección personal. 34 e visualizan los resultados obtenidos a simple vista o con luz 16. e documenta fotográficamente el cromatograma o gráficamente resiguiendo los spotsobtenidos con lápices en caso de sustancias lábiles o no visibles. *ambién se puede acer una documentación numérica calculando los valores @f de cada manca obtenida o lo que es lo mismo de cada componente cromatografiado. +l valor @f para una manca determinada se define así, distancia recorrida por cada manca 2i3 distancia recorrida por el frente del eluyente "cto seguido se presenta el diagrama de flujo a seguir para resolver un problema analítico de identificación que se le puede presentar al conservador4restaurador. @f iA
acotación de la ="*1@"L+B" C1D0E#" de la 01+*@" a analizar
colorante
aglutinante proteico
goma vegetal
cera
resina
elección de la 0+*>5>L>%D" adecuada '@+'"@"#EF= 5+ L" 01+*@" obtención e-tracción elección de los '"*@>=+ preparación de los patrones 5+"@@>LL> #@>0"*>%@G$E#>
CROMATOGRAFÍA DE GASES (CGL) La cromatografía de gases o cromatografía gas H líquido (#%L) se emplea para sustancias volátiles o volatilizables como son los aceites esenciales. e emplea como fase móvil un gas y como fase estacionaria un líquido contenido en una columna capilar de diámetro muy peque7o y varios metros de longitud que va enrollada en el interior del cromatógrafo. e trabaja a alta temperatura para que los
componentes de la mezcla se mantengan volatilizados. +s la técnica más selectiva y la recomendada por la $armacopea +uropea como el método estándar para el análisis los mismos. 'ermite separar e identificar aceites esenciales alcanfor ácidos vegetales algunos alcaloides como los del opio y tabaco resinas de cannabis y compuestos esteroideos como sapogeninas y eterósidos cardiotónicos. +s un método a la vez cuantitativo y cualitativo. +sta técnica acoplada con +spectrometría de 0asas (%#40) permite obtener el espectro de masas de cada componente con el cual se obtiene el peso molecular e información estructural. +-isten bases de datos con los espectros de masas de mucos componentes. 0ás recientemente se an desarrollado columnas cromatográficas quirales para la separación de componentes ópticamente activos. iii. CROMATOGRAFÍA LÍ4UIDA DE ALTA RESOLUCIÓN (HPLC) &'L# son las siglas en inglés de &ig 'ressure Liquid #romatograpy. +sta técnica permite separar e identificar moléculas de estructura química muy similar incluso isómeros. e aplica a compuestos no volátiles como eterósidos alcaloides lípidos esteroides gl!cidos flavonoides y a sustancias termolábiles como las proteínas y vitaminas. *anto la fase móvil como la estacionaria son líquidas de distinta polaridad de modo que la separación de las sustancias ocurre en base a este parámetro. e trabaja a temperatura ambiente pero se bombean las fases móviles a presión. +l resultado en ambos casos (#%L y &'L#) es un cromatograma que muestra los compuestos separados y el área del pico de cada uno de ellos que es proporcional a su concentración.
5IGANDIA ECUADORENSIS (H6DROPH6LLACEAE)7 UNA NUEVA ESPECIE DEL 8OS4UE MU6 SECO TROPICAL AL OCCIDENTE DE ECUADOR e describe ?igandia ecuadorensis #ornejo una nueva especie de arbusto o arbolillo endémica del fragmentado y disturbado bosque muy seco tropical en la provincia de 0anabí en la costa del +cuador. +s parecida a ?. urens (@uiz I 'avón) Junt s.l. de la que difiere por presentar ovarios más grandes (;HK mm vs. :H mm)M estilos de mayor longitud (8NHK mm vs. (H)NH8(H8;) mm)M estambres con filamentos completamente glabros versus provistos de pelos íspidos patentes a retrorsosM y corolas más grandes (H :.; cm) con lóbulos divergentes versus corolas más peque7as (8.H8.;(H) cm) con lóbulos patentes a más o menos refle-os. 'or sus cualidades de colonizadora suble7osa y elevada tolerancia a los bajos niveles de precipitación esta nueva especie podría ser utilizada para recuperar la vegetación nativa y para protección de suelos poco consolidados en las áreas de bosque muy seco tropical de la costa de +cuador y la adyacente esquina noroccidental de 'er!.
ANÁLISIS DE LOS METABOLITOS PRESENTES EN LOS EXTRACTOS DE OREGANO La Lippia origanoides, comúnmente conocida como “Orégano de monte” es un arbusto silvestre nativo de algunos países de América Central y del norte de América del Sur, especialmente en la Amazonía !sta especie puede alcanzar " m de longitud, posee #o$as ovaladas muy arom%ticas e in&orescencias en racimo, a'ilares y blancas !l presente estudio tiene como ob$etivo determinar los componentes presentes en el orégano de monte, con un en(o)ue investigativo en la de la presencia de los compuestos (en*licos timol y carvacrol a través de di(erentes métodos de detecci*n de metabolitos La composici*n )uímica del orégano de monte presenta contenido de metabolitos secundarios en la planta se encuentra determinados por muc#os (actores Como principales )uimiotipos presentes en el orégano de monte se encuentran el timol y el carvacrol cada una con sus enzimas )ue dirigen y orientan su biosíntesis, + terpenos, eugenol, trans+ bergamoteno, p cimeno y cario(ineno -aterial vegetal .estilaci*n del aceite esencial !'tracci*n de metabolitos cl%sica !'tracci*n de metabolitos por So'#let /elton .eterminaci*n de la presencia de timol en el e'tracto Cromatogra(ía en capa 0na Cromatogra(ía en columna • • • • • • •
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!valuaci*n de la capacidad antio'idante !valuaci*n de la capacidad antimicrobiana An%lisis 0to)uímico preliminar Alcaloides1 2eactivo .ragendor3, reactivo de Sones#ain, reactivo de 4agner y reactivo de -eyer 5lavonoides1 !nsayo de S#inoda 2eactivos como1 -agnesio, acido clor#ídrico 6"789, etanol, cloruro (érrico e #idr*'ido de sodio 6:;89 ?:: @rueba de 5eling y /enedict, las cuales utilizan como reactivos1 5e#iling A, 5e#iling / Saponinas1 cido acético an#ídrido, reactivo de 2osent#er y %cido sul(úrico Briterpenos1 cloro(ormo y an#ídrido acético Baninos1 agua destilada, cloruro de sodio al 8 @rueba con cloruro (érrico y con (errocianuro de potasio Duinonas1 @ruebas con #idr*'ido de amonio, %cido sul(úrico y la reacci*n de /ortraguer Cumarinas1 >idr*'ido de amonio
ANÁLISIS DE LOS METABOLITOS PRESENTES EN LOS EXTRACTOS DE OR$GANO DE MONTE %Lii# o!i&#noi'"s( !valuaci*n de la capacidad antio'idante1 .eterminaci*n de la presencia de timol en el e'tracto1 La soluci*n de timol tenía una absorbancia de ,F7G La prueba de absorbancia con el e'tracto a la longitud de onda de "7 nm, se obtuvo un resultado de ,; Se realiz* el c%lculo para determinar el error de absorbancia entre la soluci*n patr*n y el e'tracto So'#let#, de esta manera se obtuvo un valor de ",EH8 Cromatogra(ía en capa 0na y en columna1 !valuaci*n de la capacidad antimicrobiana1 para el microorganismo del Stap#ylococcus con una distancia de in#ibici*n de ;,7 cm por parte del e'tracto de So'#let# y una distancia de in#ibici*n de :," para el patr*n 6nor&o'acin9
.entro de los componentes identi0cados en los e'tractos del orégano de monte 6Lippia origanoides9 se encontr* la presencia de gluc*sidos y triterpenos Los ensayos acerca de la presencia de timol (ueron positivos pero en ba$as cantidades !l orégano de monte puede contener metabolitos como timol y carvacrol pero debido a algunos posibles (actores= estos no se detectan en gran cantidad ya )ue sus propiedades antio'idantes y antimicrobianas (ueron relativamente ba$as @ara la evaluaci*n antimicrobiana se detect* una distancia de in#ibici*n de ;,7 cm en Stap#ylococcus, lo )ue conlleva a deducir )ue se presenta esta actividad pero con ba$a capacidad con respecto al patr*n Los e'tractos de orégano presentan una capacidad antio'idante y antimicrobiana aun)ue en ba$os niveles de o'idaci*n e in#ibici*n respectivamente IDué aprendimosJ Conocimos algunas di(erencias entre el orégano mediterr%neo y el orégano de monte Aprendimos a #acer la e'tracci*n de metabolitos a partir de un material vegetal 2ealizamos un an%lisis del orégano para poder determinar sus propiedades y compuestos Cromatogra(ía en capa 0na y columna .eterminaci*n de timol 6prueba patr*n9
