Separación de Proteínas Por Electroforesis en Gel de Poliacrilamida

Instituto Politécnico Nacional Escuela Nacional de Ciencias Biológicas.

1.-Materia: Métodos de Análisis

2.- Práctica: “Separación de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida”

3.-Alumno: López Morales Pedro Daniel

4.- Grupo: 4IM1

5.-Sección: 1

6.-Profesora: Carolina Acuña González

7.- Fecha de realización: realización: 21 & 24/Octubre/2016 07/Noviembre /2016

8.- Fecha de entrega: 14/Noviembre/2016

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“Separación de proteínas por electroforesis en gel de poliacrilamida.”

Fundamento.

La electrolisis del agua es el proceso en el que corrientes eléctricas continuas o pulsatorias pasan a través del agua, sus moléculas se alinean y se separan los átomos de hidrogeno y oxígeno. La etimología de la palabra refiere a dos términos: electro: que significa electricidad, y lisis que significa rotura. En la descomposición de agua han de intervenir sustancias ionizadas denominadas electrolitos.



H2O 2H+O La electroforesis es una técnica de separación de de moléculas de una muestra por aplicación de un campo eléctrico. Las moléculas disueltas se desplazan o migran en un campo eléctrico a una velocidad determinada pos su relación carga-masa. Por ejemplo, si dos moléculas tienen masa y formas iguales, la de mayor carga neta se desplazara más rápido al electrodo. La separación electroforética de proteínas se suele efectuar en geles de poliacrilamida. Cuando una mezcla de proteínas se aplica a un gel y se le pasa una corriente eléctrica. Las proteínas más pequeñas migran más rápido a través del gel que las proteínas más grandes. Los geles se moldean entre dos hojas de vidrio mediante polimerización de una solución de monómeros de acrilamida en cadenas de poliacrilamida y al mismo tiempo se crean enlaces cruzados que forman una matriz semisólida. El tamaño del poro de un gel se puede variar mediante ajustes en las concentraciones de poliacrilamida y del reactivo que forma enlaces cruzados. La velocidad a la cual cua l una proteína se mueve a través del gel depende del tamaño del poro del gel y de la fuerza del campo eléctrico. Mediante el ajuste apropiado de estos parámetros, es posible a separar las proteínas de tamaños muy variables. La seroalbúmina es una proteína monómera no glicosilada de 585 aminoácidos, con un peso molecular de 66 kDa, su punto isoeléctrico está alrededor de pH 4,6.







desde la circulación sanguínea a órganos como el hígado, el riñón, el intestino y el cerebro. La lactoalbúmina es una proteína soluble que se encuentra en fase dispersa en estado coloidal, rica en aminoácidos azufrados y de fácil digestión. Es una proteína globular pequeña que está constituida por 123 aminoácidos y posee un peso molecular próximo a 14 kDa. El punto isoeléctrico isoeléctrico de la holo- α-lactoalbúmina se ha reportado en el rango entre 4.2 y 4.8 siendo el valor más utilizado en la literatura el de 4.5 .

La ovoalbúmina es la principal proteína de la clara del huevo. Pertenece a la superfamilia proteínica de las serpinas. La ovoalbúmina de los huevos de gallina posee cerca de 385 aminoácidos. Es una fosfoglicoproteína con un peso molecular aproximado de unos 42.7 KDa y su punto isoeléctrico es de 4.6 Objetivos.  Efectuar la separación de proteínas de varias muestras mediante la electroforesis en gel de poliacrilamida.  Determinar el tamaño óptimo de poro de gel, para la mejor separación de cada una de las muestras.  Mediante el método de de Ferguson, determinar cuál es la proteína de mayor tamaño molecular y de mayor carga neta. Resultados Experimentales 1.Tabla 3. Características de los electroferogramas a diferentes %T Característica

%T

Longitud del gel antes de teñir, cm, (l) Longitud del gel después de teñir, cm, (l') Distancia recorrida por el colorante, cm, (f) Suero No de bandas en: Leche Clara

5.5

7.5

10

12.5

7.5 8.0 5.9

7.6 7.8 6.5

7.2 7.5 6.2

7.0 7.7 6.0

7 4 2

10 8 9

10 9 9

14 8 10

Mediante la siguiente formula se calculó la movilidad electroforética relativa (M):

(  )*(̅ )

Dónde: l: Longitud del gel antes de teñir (cm)







Tabla 4 Movilidad electroforética relativa promedio %T

Muestra/ Proteína

5.5

Suero/ Seroalbúmina Yogurt/ Lactocaseína Clara/ Conalbúmina Suero/ Seroalbúmina Yogurt/ Lactocaseína Clara/ Conalbúmina Suero/ Seroalbúmina Yogurt/ Lactocaseína Clara/ Conalbúmina Suero/ Seroalbúmina Yogurt/ Lactocaseína Clara/ Conalbúmina

7.5

10

12.5

Valores de m de la proteína seleccionada (cm) 6.3

6.3

6.4

Valor promedio de m(cm) 6.3

Movilidad electroforética relativa (µ) 1.001

log (Mx100)

2.0000

5.4

5.4

5.5

5.4

0.858

1.9333

3.7

3.7

3.7

3.7

0.588

1.7690

6.0

6.0

6.0

6.0

0.8880

1.9484

5.0

5.0

5.0

5.0

0.7495

1.8747

3.2

3.2

3.2

3.2

0.4896

1.6898

4.4

4.4

4.4

4.4

0.6823

1.8329

4.3

4.3

4.3

4.3

0.6668

1.8239

2.5

2.5

2.5

2.5

0.3877

1.5896

3.7

3.7

3.7

3.7

0.5606

1.7486

4.5

4.5

-

4.5

0.6818

1.8335

2.4

2.5

2.4

2.43

0.3681

1.5650

Gráfico Gráfico de Ferguson 2.5

Clara de Huevo Suero

2

) 0 1.5 0 1 x M ( g o 1

Yogurt Lineal (Clara de Huevo) Lineal (Suero) Lineal (Yogurt)







Tabla 5. Regresión lineal de la gráfica de Ferguson. Muestra

Ecuación de la recta

R2

Clara Suero Yogurt

-0.0231x + 1.9154 -0.0371x + 2.212 -0.0241x + 2.0624

0.9531 0.9915 0.989

Se elimino el punto de 1.8336 de Yogurt de tamaño de poro no. 12.5 ya que al momento de graficar nos alteraba el resultado En cada ecuación de la recta obtenida cada variable representa Y=mx+b donde m=Tamaño molecular relativo de la proteína

b= Carga relativa de la proteína

Por ejemplo en la clara sería m= 0.0231 igual a su tamaño molecular de la proteína b= 1.9154 igual a su carga relatica de la proteína Así para cada una una de las demás proteínas proteínas Fotografía del electroferograma

Tamaño de Poro no 10







Al comparar las 3 ecuaciones ecuaciones obtenidas obtenidas por el gráfico de Ferguson, Ferguson, se puede comparar sus pendientes , y ver que el tamaño molecular relativo de las moléculas es mayor en la conoalbumina, después seroalbúmina y la caseína, al compararlos con los pesos moleculares (PM) teóricos quedan ordenados de la misma forma Conalbúmina (78000Da), Seroalbúmina (67000Da), y Caseína (25000Da). 5.- Diga cuál %T recomienda para la separación de las proteínas de cada muestra y ¿Por qué? Muestra

%T recomendado

Suero

10

Yogurt

12.5

Clara

7.5 y 10

Ya que se tuvo mejor resolución en la bandas número 10 para clara y suero para número 7.5 para clara y en 12.5 para yogurt (caseína), como el número de bandas presentes en estos geles. 6.-Escriba la reacción completa para la copolimerización de la acrilamida y a bisacrilamida por radicales libres, ¿Qué función tienen el TEMED y el persulfato de amonio?

Los geles de poliacrilamida actúan a modo de tamiz molecular retardando el movimiento de macromoléculas grandes mientras que permiten a moléculas más pequeñas moverse libremente, potenciando de esta forma la separación. El entramado de los geles de poliacrilamida se genera mediante la polimerización, a través de radicales libres, de monómeros de acrilamida en presencia de pequeñas cantidades de “bis -acrilamida”(N,N,N’,N' -metilen-bis-acrilamida). Se forman enlaces cruzados entre los 2 polímeros de acrilamida, de manera que se generan geles con tamaño de poro determinado tanto por la concentración total (%T) como por la concentración relativa de acrilamida y de bisacrilamida. La reacción de polimerización se inicia por un sistema redox de catálisis. El TEMED cataliza la formación de radicales libres que dirigen la reacción a partir del ión persulfato que se añade en forma de APS y que actúa como iniciador. Se trabajó con diferentes concentraciones de gel separador, de 5.5%, 7.5%, 10% y 12.5%, esto es debido a que a diferente tiempo varia la concentración final de la bisacrilamida en el medio.









7.- Mencione una aplicación de la electroforesis preparativa y una electroforesis analítica.

-Electroforesis preparativa : Se puede aplicar en la preparación y purificación de (por extracción de bandas del gel) moléculas y fragmentos de DNA y RNA. -Electroforesis analítica: Permite realizar algunos tipos de diagnósticos, conocer la composición de un preparado proteico heterogéneo, monitorear un proceso de purificación, estimar peso molecular, utilizada también en métodos ópticos, métodos radio químicos, ensayos biológicos. 8.- Defina velocidad de migración y movilidad electroforética. Explique la diferencia.

La velocidad de migración (v) de la partícula es directamente proporcional al







9.- Defina el término electroferograma 

Un electroferograma es un gráfico realizado con los resultados de un análisis por electroforesis. Se pueden realizar electroferogramas con resultados derivados de: Pruebas genealógicas de ADN, pruebas de paternidad, secuenciación de ADN, huella genética  Grafico que representa la respuesta del detector frente al tiempo de electroforesis. 10.- ¿Qué se desprende del ánodo y del cátodo?

La fuerza iónica (m) determina el potencial electrocinético ya que reduce la carga neta de los grupos con cargas efectivas. Se ha determinado que la movilidad de las partículas cargadas es inversamente proporcional a la raíz cuadrada de la fuerza iónica, a baja m se eleva la velocidad de migración y es menor la difusión, de manera que la zona de separación es más ancha y mayor la resolución. 1 Con el aumento de la m, se incrementa el desprendimiento de calor y la evaporación. En la electroforesis, los efectos de absorción de agua, no-homogeneidad del material, intercambio iónico con grupos cargados del soporte y electroendósmosis, pueden influir sobre la movilidad y la calidad de la separación. La electroendósmosis generalmente ocurre porque grupos cargados del soporte se ionizan en soluciones tampón neutras o ácidas y los contraiones libres hidratados (H 3O+) migran hacia el cátodo, esto provoca un movimiento relativo del solvente respecto al soporte sólido y que las moléculas no cargadas sean transportadas hacia el cátodo a pesar de no tener grupos ionizados. Se despende de resultado siendo el cátodo Hidrogeno y tanto en el ánodo Oxigeno. 2H2O 2H2+ O2







nuestro gel quedo con los pozos mal hechos. Se inició la electroforesis aplicando un voltaje de 100 Voltios hasta aumentar a 200 Voltios en un tiempo de 65 minutos, conforme aumenta el voltaje aumenta la velocidad de migración. Las muestras aplicadas tenían azul de bromofenol, este colorante nos permitió observar que la muestra cayó en el pozo correspondiente además evita que las proteínas salgan del gel también es un indicador de pH que nos indica que las proteínas de fijaron al gel, el azul de bromofenol debe ser una molécula cargada y de tamaño pequeño que avanza más rápido que la proteína en el gel. Al termino del corrimiento, el gel se pasó a un recipiente que contenía el TCA, para desnaturalizar a las proteínas, posteriormente de coloco en un recipiente que contenía azul de Coomasie G-250. Al terminar la tinción de los geles, se observó que conforme aumentaba aumentaba la concentración se obtenían bandas mejores definidas, a una concentración de 5.5% se observaron manchas muy difusas, mientras que a una concentración de 12.5% las bandas se podían distinguir mejor. Por lo tanto, a mayor concentración de poliacrilamida las bandas se van definiendo más. El tamaño del poro puede ser ajustado para optimizar la separación de la muestra de interés. Así que, en geles con un porcentaje alto de acrilamida son óptimos para la separación de proteínas de tamaño pequeño, mientras que geles de porcentajes menores (<10%T) son los indicados para la separación de proteínas grandes. De manera general, se esperaba que las medidas de l’ (longitud del gel después de teñir) fueran mayores a l (longitud del gel antes de teñir) y que estas dos medias fueran mayores a f (distancia recorrida por el colorante). En los datos registrados en la tabla 3, se observa que este comportamiento se cumple en todas las concentraciones de acrilamida (desde 5.5% hasta 12.5%) En el no. de bandas obtenidas, se esperaba que a mayor concentración de







mostraron que conforme aumente la concentración de poliacrilamida la movilidad en cada proteína disminuye. Debido al dato obtenido donde la medida de f fue mayor que la medida de l, se elaboraro la grafica de Ferguson, tomando en cuenta el factor de hinchamiento. Con la gráfica de Ferguson, se puede determinar el tamaño relativo de la proteína (que corresponde al valor absoluto de la pendiente) y la carga neta relativa de la proteína (que corresponde al valor de la ordenada al origen). Tomando en cuenta el factor de hinchamiento para construir la gráfica de Ferguson, se obtuvo que el valor de la pendiente del suero fue mayor a la del yogurt y esta fue mayor a la de la clara, es decir, Suero>Yogurt>Clara, con esto se puede decir que la proteína del suero es la de mayor tamaño molecular. En cuanto a los valores de ordenada de origen, los cuales no corresponden al valor de la carga, sólo hacen referencia de qué moléculas tienen más carga, se obtuvo que la mayor ordenada al origen fue la del suero, después la del yogurt y finalmente la de menor valor fue la de la clara de huevo, es decir, Suero>Yogurt>Clara. Por lo tanto, la proteína con mayor carga neta relativa es la del suero seguido por la del yogurt, y la menor carga relativa corresponde a la de la muestra de clara de huevo. En la segunda gráfica de Ferguson, se mostró el mismo comportamiento, es decir, la de mayor carga neta fue la del suero, seguido por la carga neta del yogurt y la de menor carga neta fue la de la clara de huevo (S>Y>C). Con la carga relativa comparamos las cargas netas de una proteína con otra. De manera general a mayor carga neta la movilidad será mayor. Si el pH fuera igual al pI de las proteínas, estas no se moverían en el gel, la solución B que es Tris- HCl nos dio el pH de trabajo. Esta sustancia a un intervalo de pH entre 8.7 y 9,2 funciona como regulador.







 



A mayor concentración de poliacrilamida habrá mayor número de bandas, que estarán más definidas. A mayor concentración de gel la movilidad electroforética electroforétic a disminuye, ya que una concentración alta de gel ocasiona un tamaño de poro más pequeño y viceversa. Es recomendable concentraciones bajas de poliacrilamida poliacrilami da para proteínas de tamaño molecular muy grande, y concentraciones altas para proteínas de tamaño molecular pequeño.

Anexo. Gel

a) Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecruzador ('cross-linking'), la bis-acrilamida en presencia de un iniciador y un catalizador. Como iniciador se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-tetrametilnediamina) y como catalizador el ión persulfato (S2O8 -) que se añade en forma de persulfato amónico. En algunas situaciones, como por ejemplo en el isoelectroenfoque en el que la presencia de persulfato puede interferir con la electroforesis se emplean riboflavina y TEMED. b) Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el oxígeno es un inhibidor de la polimerización. Además, durante la polimerización se libera calor que podría provocar la formación de burbujas en el seno del gel. c) La velocidad de polimerización viene determinada por la concentración de persulfato (catalizador) y TEMED (iniciador). d) La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida, siendo menor el poro cuanta más bisacrilamida









Bibliografía. 

Lodish Harvey, Harvey, 2005, Biología celular y molecular, Editorial

Separación de Proteínas Por Electroforesis en Gel de Poliacrilamida

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