PRACTICA No. 2 Electroforesis en gel de agarosa y visualización de ADN plasmídico
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
Un método que permite visualizar ADN plasmídico o fragmentos del mismo es la electroforesis en gel de agarosa, en la cual las moléculas de ADN se separan en función de su tamaño. Esta técnica consiste en someter la mezcla de moléculas de ADN embebidas en un gel de agarosa aplicando un campo eléctrico. Las moléculas de ADN son atraídas al polo positivo debido a la carga neta negativa las cadenas consecuencia de sus grupos fosfato. Las moléculas más pequeñas migran más rápido que las grandes al verse menos “frenadas” por el gel de agarosa en su desplazamiento. Cuando los fragmentos se han separado, el gel se sumerge en una solución que contiene bromuro de etidio y luego se ilumina con luz UV. El bromuro de etidio (EtBr) es una molécula plana con afinidad por el ADN que se intercala entre los pares de bases y que tiene la particularidad de fluorescer cuando está unido a él. Al iluminar el gel con luz UV se ven bandas de fluorescencia que corresponden a moléculas de ADN.
MATERIAL Puntas estériles. Pipetas automáticas. Agua destilada. Tanques, camas y peines de electroforesis. Fuente de alimentación. Agarosa. Microcentrífugas. Vaso de precipitado (para desecho). Erlenmeyer de 100 ml. Microondas. Balanza. Cinta adhesiva. TAE.
PROCEDIMIENTO 1.
Fabricación del gel de agarosa al 1 % y preparación de la muestra a. En un matraz mezclar una cantidad adecuada de agarosa (1 g) con tampón TAE (100 ml). Calentar la mezcla (agarosa + TAE) con la ayuda de un microondas u hornillo eléctrico hasta fundir y disolver completamente la agarosa (¡cuidado al agitar el matraz, que la agarosa al calentarse puede salpicar abruptamente fuera del matraz y producir serias quemaduras!). b. En un tubo eppendorf limpio añadir 20 μl (10 μl del ADN aislado anteriormente + 10 μl de agua) de la disolución de ADN y 3 μl de “tampón de carga”. c. Centrifugar ligeramente la mezcla SÓLO si hay demasiadas gotas repartidas dentro del tubo, con objeto de recoger todo el volumen de muestra. d. Depositar la muestra en uno de los pocillos del gel de agarosa al 1% previamente fabricado (éste se ha colocado con anterioridad sumergido en tampón TAE en una e. Cerrar o tapar la cubeta de electroforesis, colocar los electrodos de tal forma que el polo negativo quede al lado de los pocillos y el polo positivo en el extremo opuesto del gel, hacia donde va a migrar el ADN, y aplicar una corriente eléctrica continua de 100-120 voltios f. Detener la electroforesis tras unos 60 minutos o cuando el colorante haya recorrido las tres cuartas partes del gel. Visualizar el ADN con ayuda de un transiluminador de luz ultravioleta de onda corta.
2. Tinción Rápida de Geles de Agarosa en 100x Fast Blast DNA Stain
Este protocolo permite una rápida visualización de las bandas de ADN en geles de agarosa en alrededor de 15 minutos. Para una rápida tinción, el tinte Fast Blast DNA (500X) deberá ser diluido a una concentración de 100X. Recomendamos usar 120 ml de Fast Blast a 100X para teñir dos bandejas individuales de gel de agarosa de 7x7 cm ó 7x10 cm que las proveen los kits educativos Bio-Rad. Si se usan otras bandejas, añada volumen suficiente de la solución del tinte hasta sumergir completamente el gel. Después de la electroforesis, los geles de agarosa deben ser retirados de su bandeja antes de ser colocados en la solución para teñir. Esto se logra al sostener la base de la bandeja del gel con una mano y, gentilmente, empujar el gel hacia fuera con el pulgar de la otra mano. Debido a que el gel es frágil, se le debe de dar atención especial mientras es manipulado. Recomendamos ampliamente el uso de una espátula larga u otra superficie de soporte para transferir el gel de un contenedor a otro. La distinción requiere el uso de mínimio un contenedor largo de volumen de al menos 500 ml, en cada mesa de estudiantes. Cada equipo puede utilizar contenedores de lavado diferentes para cada paso, o simplemente usar un contenedor que se vacíe después de cada lavado y rellenado para el siguiente. Marque las bandejas con sus iniciales y salón. Se teñirán 2 geles por bandeja. Tinción de Geles Remueva cada gel de su bandeja y cuidadosamente deslícela en la bandeja de tinción. Vierta aproximadamente 120 ml del tinte a 100X en la bandeja de tinción. Si es necesario, añada más solución al 100X para sumergir completamente los geles. Tiña los geles de 2-3 minutos, pero no más de 3 minutos. El tinte puede ser usado de nuevo al menos 7 veces •
Enjuagado de Geles Transfiera los geles en un contenedor largo que contenga 500-700 ml de agua tibia (40-55 oC) y limpia. Después agite gentilmente en el agua por alrededor de 10 segundos para enjuagar. •
Lavado de Geles Transfiera el gel en un contenedor largo con 500-700 ml de agua tibia limpia. Gentilmente agite el gel en una plataforma que vibre por 5 minutos. Si no hay plataforma que vibre, mueva los geles gentilmente en el agua una vez cada minuto. •
Lavado de Geles Realice un segundo lavado como en el paso 4 •
•
Registre Resultados
Tire el agua y examine los geles teñidos por bandas de ADN. Las bandas pueden aparecer borrosas inmediatamente después del segundo lavado, pero se empezarán a plasmar en bandas finas de 5-15 minutos después del segundo lavado. Esto es debido a que las moléculas de Fast Blast migran en el gel y se adhieren más fuertemente al ADN. Para obtener un máximo contraste, se necesitarán más lavados en agua tibia. Destiña hasta el nivel deseado, pero no lave el gel en agua durante la noche. Si no puede completar el desteñido en el tiempo permitido, puede transferir el gel a una solución de Fast Blast 1X para un teñido durante la noche. Vea protocolo 2. a) Coloque el gel en un fondo claro y registre sus resultados haciendo un diagrama como se indica. Coloque una hoja clara de plástico o acetato sobre el gel. Con un marcador
permanente, marque los orificios y los patrones de las bandas en la hoja de plástico para hacer una réplica del gel. Remueva la hoja de plástico para análisis posteriores. Los geles también pueden ser fotocopiados en una hoja amarilla de película transparente para un contraste óptimo. b) Secado del gel de agarosa para un registro permanente del experimento. 1) Deshágase de todas las líneas no marcadas con un cuchillo o navaja. Corte el gel de arriba hacia abajo para remover las líneas que en las que no se depositó muestra, dejando solamente las líneas 1-4. 2) Coloque el gel directamente sobre la cara hidrofílica de un pedazo de película de soporte del gel (El agua formaría gotas en la cara hidrofóbica de un pedazo de película de soporte del gel). Centre el gel en la película y remueva las burbujas que se puedan formar entre el gel y la película. Coloque la película en una toalla de papel y déjela secar en un área bien ventilada, asegurándose de evadir el contacto directo con la luz. Mientras el gel se seca, se adherirá a la película, aunque no se sumergirá. Si se mantiene sin alteraciones en la película de soporte, el gel se secará completamente a temperatura ambiente después de 2-3 días. El resultado será un registro plano, transparente y durable del experimento.
ANEXO 1. Solución tampón 10X TAE 2 litros (g) “Tris base” Ácido acético glacial Na2–EDTA Agua destilada
216 110 14,8 Hasta 2 litros
1 litro (g) 108 21,05 2,45 Hasta 1 litro
