TUGAS BIOTEKNOLOGI TANAMAN Metode Restriction Metode Restriction Fragment Fragment Length Polymorphism Polymorphism (RFLP) (RFLP)
Oleh: KELOMPOK II Sinta Lestari S!i Khairni Ra"ot #e$on Silalahi Re%a Fahle$i Sihalas Ta Sit"oran& Ir'anto
AGROTEKNOLOGI AGROTEKNOLOGI
#URUSAN AGROTEKNOLOGI AGROTEKNOLOGI FAKULTAS PERTANIAN UNI*ERSITAS RIAU PEKANBARU +,-.
Te/nolo&i Analisis Mole/lar Men&&na/an Metode Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP): A0li/asin1a ala" ia&nosis Mole/lar S0esies Candida
Identifikasi secara cepat isolat Candida untuk mengetahui pada tingkat spesies untuk pemilihan terpi antijamur yang efektif dan juga kontrol fasilitas dari rumah sakit infeksi. Metode analisis berdasarkan fenotip untuk mengidentifikasi spesies Candida seringkali sulit dilakukan dan membutuhkan waktu yang lebih panjang. Teknik biologi molekular memberikan teknik alternatif yang dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies Candida secara cepat, murah dan tepat. Dalam makalah ini akan membahas tentang teknologi analisis molekular dengan menggunakan metode restriction fragment length polymorphism (R!"# dan aplikasinya untuk diagnosis secara cepat pada spesies Candida yaitu C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei dan C. guilliermondii. $nalisis dilakukan dengan mengamplifikasi daerah polimorfis IT%&'IT% menggunakan Polymerase Chain Reaction (")R#. *asil amplifikasi kemudian dipotong menggunakan en+im restriksi tunggal yaitu MspI. Dengan menggunakan metode ")R'R!" dengan en+im restriksi tunggal MspI, %pesies Candida dapat diidentifikasi secara sederhana, cepat dan hemat biaya untuk dapat diaplikasikan dalam laboratorium klinik. Pendahlan
%pesies Candida dianggap penyebab terbesar penyakit infeksi yang mempunyai peluang besar terjadi pada manusia. Infeksi penyakit yang disebabkan oleh Candida antara lain adalah jenis infeksi sistemik dan mukosal ( autiste' Muno+ et al ., -/0 Dendis et al ., -/0 1arababa et al ., -#. 1etika sistem imun lemah atau ketika persaingan flora yang dihilangkan dengan pemberian antibiotic, Candida akan membentuk koloni dan menyerang sel jaringan inang (2aren dan *a+en, &334#. Meskipun kebanyakan infeksi Candida disebabkan oleh C. albicans, spesies Candida non'albicans, misalnya seperti C. glabrata dan C. krusei telah dilaporkan dengan frekuensi yang tinggi. Diagnosis awal infeksi jamur penting dilakukan untuk mengurangi tingkat kematian. Dalam kasus lain, identifikasi spesies sangat penting dilakukan untuk menentukan jenis terapi antijamur yang efektif dengan memperhatikan bahaya
resistesi obat antijamur. 5enus Candida termasuk kedalam &4 spesies yang menunjukkan tingkat resistensi terhadap antijamur yang berbeda'beda. %angat penting untuk menentukan tingkat spesies secara benar, karena kesamaan fenotip pada Cadida sangat tinggi antar spesies Candida (6eppelekenbroek et al ., -4#. Telah dilaporkan tentang analisis spesies Candida menggunakan metode R$"D (random amplified polymorphic D6$#'")R, sekuensing D6$, sekuensi urutan gen R6$ subunit besar pada ribosomal dll, tetapi metode tersebut memiliki kelemahan yaitu masih membutuhkan waktu yang lebih panjang dan sangat mahal untuk penggunaan secara rutin dilaboratorium kesehatan. 7leh karena itu diperlukan kit diagnostik
secara cepat, tepat dan murah
untuk dapat
mengidentifikasi pada tingkat spesies Candida dalam penentuan terapi antijamur. 1it identifikasi spesies Candida berdasarkan tes asimilasi tersedia secara komersial, tes kit ini membutuhkan &'4 hari untuk identifikasi Candida pada tingkat spesies. "ada saat ini, teknik molekular memberikan metode alternatif untuk diagnosis dan identifikasi jamur patogen, termasuk spesies Candida ( Reis et al ., &3380 9eo et al ., --#. Teknik molekular menggunakan amplifikasi D6$ target memberikan alternatif
metode untuk
diagnosis dan
identifikasi beberapa organisme.
Identifikasi spesies Candida dilakukan dengan menggunakan metode R!" pada rD6$ ()irak et al ., -/#. "ada salah satu penelitian di )ina, %ensi:itas dan kecepatan teknik telah digunakan untuk mengidentifikasi / spesies penting dalam kesehatan yaitu Candida, Aspergillus dan Cryptococus dengan menggunakan ")R'R!" secara in :itro. 7leh karena itu dalam makalah ini akan dilakukan pembahasan tentang metode analisis molekular menggunakan teknik R!" dan aplikasinya dalam mengidentifikasi spesies Candida secara cepat, murah dan tepat.
Te/ni/ Analisis RFLP
R!" merupakan perbedaan pada homolog urutan D6$ yang dapat dideteksi dengan menggunakan adanya perbedaan fragmen D6$ yang telah dipotong dengan menggunakan en+im endonuklease tertentu. R!" digunakan sebagai marker molekular karena spesifik untuk setiap tunggal atau kombinasi dari en+im restriksi. $plikasi dari R!" dapat digunakan untuk pemetaan genom, genome typing, tes paternitas, forensic dan diagnostik hereditas penyakit. Tahapan R!" meliputi tahapan yaitu, isolasi D6$, pemotangan D6$ dengan en+im restriksi endonuklease, elektroforesi hasil pemotangan D6$ dan southern blot. Tahapan analisis R!" dapat diamati pada 5ambar &.
Ga"2ar -3 Taha0an analisis RFLP 0ada identi4i/asi 0en1a/it A0li/asi RFLP nt/ ia&nosis Mole/lar se!ara 5e0at 0ada S0esies Candida
"entingnya mengetahui spesies Candida untuk menentukan jenis terapi yang akan dilakukan sehingga diperlukan teknik identifikasi spesies secara tepat, cepat dan murah yaitu dengan menggunakan teknik R!". Mirhendi et al ( -;#., melaporkan bahwa penggunaan metode ini telah berhasil untuk mengidentifikasi spesies Candida yaitu spesies C. albicans, C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. krusei dan C. guilliermondii dari &/< isolat. Tahapan untuk dapat menganalisis spesies Candida menggunakan metode ")R'R!" yaitu (Mirhendi et al ., -;0 Mousa:i et al ., -<# = 1. Isolasi D6$ dari isolat Candida 2. $mplifikasi ")R dengan menggunakan satu pasang primer pada daerah IT%&'IT%
3. "emotongan menggunakan en+im restriksi MspI 4. >lektroforesis gel agarosa Tahapan pertama dalam analisis R!" adalah isolasi D6$. "ada tahapan ini isolasi D6$ menggunakan kombinasi yaitu secara kimia dan fisik yaitu dengan buffer lisis (&mM Tris, &mM >DT$ p*8, &? %D%, &mM 6a)l, -? Triton @'&#, /A! phenol'chloroform (&=&# dan /mg glass bead (dengan deameter .4 mm# dengan cara di:orteB selama 4 menit. 1emudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan &. rpm selama 4 menit. 1emudian supernatan diambil dan dipindahkan ke ependorf yang baru dan tambahkan chloroform sejumlah yang sama. 1emudian disentrifugasi dan supernatant dipindahkan ke tabung ependorf yang baru. 1emudian dilakukan presipitasi D6$ dengan menambahkan .& m! 6a'asetat (p* 4.-# dan -.4 m! etanol absolute dingin, kocok dengan perlahan dan sentrifugasi dengan kecepatan &. rpm selama 4 menit dengan suhu C). %etelah itu pellet dicuci dengan menggunakan alkohol <? dan disentrifus. 1emudian pellet dilarutkan dengan menambahkan &A! buffer T> (&mM Tris, &mM >DT$#. Tahapan kedua yaitu amplifikasi daerah IT%&'IT% dengan menggunakan sepasang
primer
forward
dan
T))5T$55T5$$))T5)55'/#
re:erse
yatu
dan
pR
p
(IT%&, (IT%,
4' 4'
T))T))5)T$TT5$T$T5)'/#. 1omposisi dalam tabung ependorf untuk ")R dimasukkan komponen sebagai berikut =
&A! D6$ template
.-AM primer
.&mM d6T"
& A! buffer ")R &B
-.4 E TaF D6$ "olimerase
Tahapan ")R dilakukan dengan /4 siklus =
Inisiasi denturasi pada suhu 3C) selama 4 menit, kemudian dilanjutkan tahapan denaturasi pada suhu 3 C) selama / detik dengan -4 siklus.
Tahapan penempelan primer pada suhu 4; C) selama -4 detik.
Tahap perpanjangan pada suhu <-C) selama & menit dan tahap perpanjangan terakhir selama < menit. %etelah tahapan ")R, kemudian dilakukan analisis produk ")R
(amplikon# dengan melakukan elektroforesis gel agarosa dalam buffer T> (.3M Tris, .3M asam borat, -mM >DT$ p* 8./# dengan pewarnaan >tr (.4AgGml#. *asil analis yang dilaporkan oleh Mirhendi et al (-;# menunjukkan bahwa hasil produk ")R menggunakan satu pasang primer IT%&'IT% menunjukkan ukuran yang berbeda'beda antara spesies Candida yang digunakan sebagai standar. Ekuran hasil ")R yang berbeda'beda yaitu sekitar 4&'8< bp (5ambar -#. Ekuran produk ")R tidak memberikan permasalahan untuk tahap selanjutnya yaitu tahap pemotongan menggunakan en+im restriksi endonuklease MspI.
Ga"2ar +3 Prod/ P5R dari 6 s0esies Candida 1ait C. albicans AT55 -,+6(-)7 C. glabrata AT55 8,,9, (+)7 C. tropicalis AT55 ,., (9)7 C. krusei AT55 6+; (<)7 C. guilliermondii AT55 8,; () dan C. parapsilosi AT55 ++,-8 (6) dan "ar/er (M) (Mirhendi et al 37 +,,6)3
%etelah dilakukan analisis produk ")R, kemudian dilakukan pemotongan menggunakan en+im restriksi MspI yaitu dengan menginkubasi -A! aliFuot produk ")R, &E MspI dengan :olume total -4 A! pada suhu /< C) selama - jam. 1emudian dianalisis dengan menggunakan elektroforesis gel agaros &.8? dalam buffer T> selama 4 menit pada &H dan pewarnaan menggunakan >tr. *asil pemotongan menggunakan MspI pada produk ")R dari masing'masing spesies
menunjukkan pola ukuran fragmen yang berbeda'beda. %elain menggunakan isolat )andida standar, Mirhendi et al., juga menggunakan isolat lain yaitu S. cereisiae $T)) 3<;/, !. asahii TIMM /&&, C. neoformans $T)) 3&&/, C. albicans ar. stellatoidea TIMM&/3 dan C. dumbliniensis )% <38<. Ta2el -3 Prod/ P5R ITS-ITS< dari s0esies Candida se2el" dan sesdah 0e"oton&an "en&&na/an Ms0I (Mirhendi et al 37 +,,6)3 S0esies Candida
U/ran 0rod/ P5R U/ran 0rod/ ITS-ITS< restri/si Ms0I
Kode a/ses Gen2an/
C. albicans
4/4
-3<, -/8
!<&&&
C. glabrata
8<&
44<, /&
$&;<33/
C. tropicalis
4-
/, &8
!<&&-
C. krusei
4&
-;&, -3
!<&&/
C. guilliermondii
;8
/<&, &44, 8-
!<&&
C. parapsilosis
4-
4-
!<&3
"roduk ")R yang telah dipotong menggunakan MspI dianalisis menggunakan elektroforesis gel agarosa ditunjukkan pada 5ambar /. *asil analisis R!" menunjukkan ukuran fragmen hasil pemotongan yang berbeda' beda. *asil pemotongan MspI menghasilkan & pita (C. parapsilosis $T)) --&3#, - pita (C. albicans $T)) &-;&, C. glabrata $T)) 3/, C. tropicalis $T)) <4, C. krusei $T)) ;-48# dan / pita ( C. guilliermondii $T)) 348#. "ola & pita dipastikan tidak terpotong karena ukuran produk ")R dengan produk ")R yang telah dipotong tidak menunjukkan ukuran yang berbeda yaitu kurang lebih 4- bp. 1emudian - pita yang dihasilkan oleh C. krusei $T)) ;-48 dipastikan terpotong menghasilkan - pita ukuran yang berukuran berdekatan sama, sehingga dari hasil analisis elektroforesis hanya muncul & pita. $kan tetapi bila dilihat perkiraan ukuran pita hasil pemotongan yaitu kurang lebih -4 bp dengan ukuran pita sebelum dipotong kurang lebih 4& bp, maka apabila ukuran pita hasil pemotongan dikalikan - kali maka didapatkan ukuran kurang lebih 4 bp. %ehingga dapat dipastikan bahwa C. krusei $T)) ;-48 terpotong oleh en+im restriksi endonuklease MspI. *asil analisis ")R'R!" menggunakan en+im restriksi MspI menujukkan pola yang sama dengan hasil prediksi fragmen pemotongan yang menggunakan urutan D6$ dari genbank. "rediksi hasil
pemotongan menggunakan program D6$%I% menunukkan bahwa terdapat / pola pita yaitu & pita, - pita dan / pita (Tabel &#. %ehingga hasil analisis ")R'R!" menggunakan en+im resktriksi MspI pada ; strain standar dapat digunakan untuk identifikasi pada isolat klinik yang dimiliki.
Ga"2ar 93 (A) Prod/ P5R 1an& telah di0oton& "en&&na/an en%i" restri/si Ms0I3 "ar/er (M)7 C. albicans AT55 -,+6- (-)7 C. glabrata AT55 8,,9, (+)7 C. tropicalis AT55 ,., (9)7 C. krusei AT55 6+; (<)7 C. guilliermondii AT55 8,; () dan C. parapsilosi AT55 ++,-8 (6)3 (B) Prod/ P5R 1an& telah di0oton& "en&&na/an en%i" restri/si Ms0I3 S. cerevisiae AT55 8.69 (-)7 T. asahii TIMM 9<-- (+)7 C. neoformans AT55 8,--9 (9)7 C. albicans var. stellatoidea TIMM-9,8 (<)7 C. dumbliniensis 5BS .8;. ()3 "ar/er (M) ( Mirhendi et al 37 +,,6)3 Pe"2ahasan
$nalisis ")R'R!" pada daerah IT%&'IT% menggunakan en+im restriksi MspI sebagai standar untuk identifikasi isolat klinis. Isolat yang dianalisis digunakan dari ; spesies Candida yang telah diketahui jenis spesiesnya. "enggunaan ")R dalam analisis R!" adalah untuk membatasi daerah yang polimorfis untuk dipotong menggunakan en+im restriksi. ika tidak menggunakan kombinasi ")R maka diperlukan analisis lebih lanjut untuk mengetahui pita target hasil pemotongan en+im restriksi pada daerah yang polimorfis yaitu dengan analisis southern blot menggunakan probe tertentu. $nalisis ")R'R!" menggunakan sepasang primer uni:ersal pada daerah IT%&'IT% rD6$ dari berbagai strain Candida. "emilihan daerah IT%&'IT% karena mengandung beberapa daerah yang urutannya lestari, dapat digunakan sebagai alignmen urutan secara tepat namun daerah tersebut juga mengandung :ariabilitas urutan yang cukup sehingga urutan non'homolog dapat digunakan sebagai marker spesifik untuk identifikasi spesies menggunakan ")R'R!".
%ebelum memotong hasil produk ")R, maka dilakukan uji restriksi menggunakan program D6$%I% untuk memprediksi produk restriksi dengan en+im restriksi tertentu. Erutan D6$ didaerah IT%&'IT% diperoleh dari genbank yang dapat diakses secara umum, kemudian diprediksi ukuran fragmen jika dipotong menggunakan en+im restriksi tertentu. $nalisis ini dapat membantu dalam pemilihan en+im restriksi yang digunakan. "enelitian yang telah dilakukan Mirhendi et al ., (-# menunjukkan pemotongan
produk
")R
dengan
menggunakan
en+im
restriksi
MspI
menunjukkan fragmen hasil pemotongan yang sama yaitu sekitar -3
telah
diidentifikasi sebagai C. albicans atau C. dubliniensi. "adahal kedua spesies ini berbeda. C. dubliniensi merupakan spesies baru yang pertama kali ditemukan pada tahun &334 oleh %ulli:an et al ., (&334# yang berhubungan dengan penyakit )andidiasis pada human yang terinfeksi *IH. %edangkan C. albicans hanya -? ditemukan dalam kasus candidema. %elain itu C. albicans juga merupakan isolat yang sangat jarang ditemukan pada mikroflora pada human yang sehat. 1edua spesies yaitu C. albicans dan C. dubliniensis menunjukkan kesamaan yang tinggi pada fenotipnya karena keduanya mampu memproduksi germ tubes dan clamdyospore. 6amun, identifikasi untuk membedakan keduanya dapat dilakukan dengan akti:itas en+im beta'D'glucosidase intraselular dan karbohidrat asimilasi. $kan tetapi kedua metode ini memerlukan waktu dan biaya yang kurang efektif. 1emudian pada tahun -4, Mirhendi et al ., telah melaporkan dapat mengidentifikasi C. albicans dan C. dubliniensi dengan menggunakan analisis R!" menggunakan satu en+im restriksi pada daerah IT%&'IT% yaitu lnI. Mirhendi et al (-4# telah mampu menunjukkan atau membedakan isolat yang termasuk kedalam spesies C. albicans dan C. dubliniensi hanya dengan menggunakan en+im restriksi tunggal. *asil produk ")R dengan menggunakan primer yang didesain untuk mengamplifikasi daerah IT%&'IT% menghasilkan produk ")R dengan ukuran pita kurang lebih 4bp. Ekuran IT%&'IT% tersebut
sesuai dengan yang telah dilaporkan oleh Mirhendi et al ., (-# dalam penelitian sebelumnya. *asil restriksi produk ")R menggunakan en+im lnI menunjukkan pola pita yang terbentuk berbeda antara C. albicans dan C. dubliniensi yaitu pada produk ")R IT%&'IT% yang telah dipotong dengan lnI pada C. albicans terbentuk - pita dan C. dubliniensi & pita. *al ini menunjukkan bahwa pada daerah IT%&'IT% pada C. albicans dikenali oleh en+im restriksi lnI dengan hasil pita pemotongan ukurannya kurang lebih /bp dan -bp, berbeda halnya dengan C. dubliniensi yang menunjukkan tidak ada sisi yang dikenali dengan en+im restriksi lnI sehingga hasil analisis produk restriksi ditemukan pita dengan ukuran kurang lebih 4bp. Ekuran 4bp berukuran sama dengan ukuran produk ")R
yaitu
4bp.
%ehingga
Marhendi
et
al.,
(-4#
telah
berhasil
mengembangkan metode ")R'R!" menggunakan en+im restriksi tunggal untuk identifikasi C. albicans dan C. dubliniensi.
Kesi"0lan
Metode analisis ")R'R!" dapat digunakan untuk mendiagnosis spesies Candida yaitu C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. krusei, C. guilliermondii dan C. parapsilosi menggunakan en+im restriksi "sp# dan C. albicans dengan C. dubliniensis menggunakan en+im restriksi $ln# dengan satu pasang primer IT%&' IT% untuk dilakukan dilaboratorium kesehatan. a4tar Psta/a
Mousa:i, %. $. $., 1halesi, >., onjar, 5. *. %., $ghihhi, %., %harifi, ., $ram, $. -<. Ra0id Mole!lar ia&nosis 4or s0e!ies Usin& P5RRFLP . iotechnology ;(#=48/'48<. Mirhendi, *., Makimura, 1., 1horami+adeh, M., 9amagushi, *. -;. A One En%1"e P5RRFLP Assa1 4or Identi4i!ation o4 Si= Medi!all1 I"0ortant Candida S0e!ies. . Med. Mycol. Hol.<. --4'--3.
Reiss, >., Tanak, 1., ruker, 5., )ha+alet, H., )oleman, D., Debeaupuis, "., *ana+awa, R., !atge, "., !ortholary, ., Makimura, 1., Morrison, ).., Murayama, %.9., 6aoe, %., "aris, %., %arfati, ., %hibuya, 1., %ulli:an, D., Echida, 1., 9amaguchi, *. &338. Mole!lar dia&nosis and e0ide"iolo&1 o4 4n&al in4e!tion. Med Mycol /; (%uppl &#=-3'-4<. 9eo, %,., 2ong, ., 5rrent stats o4 non!ltre "ethods 4or dia&nosis o4 in$asi$e 4&al in4e!tion . )lin Microbiol Re:. &4=;4'8. Mirhendi, *., Makimura, 1., Jomorodian, 1., Maeda, 6., omoko, 7., 9amagushi, *. -4. i44erentiation o4 Candida albicans and Candida dubliniensis Usin& a Sin&elEn%1"e P5RRFLP Method. . Infect. Dis. 48=-/4'-/<. %ulli:an, D.., 2esterneng, T.., *aynes, 1.$., ennet, D.>., )oleman, D.). &334. Candida dubliniensis s03 no$3: 0henot10i! and "ole!lar !hara!teri%ation o4 a no$el s0e!ies asso!iated 'ith oral !andidosis in >I* in4e!ted indi$idals. Microbiology, &&=&4<'&4-&. 2arren, 6.5.M., *a+en, R.). &334. Candida, Cryptococus and other ?east o4 Medi!al I"0ortan!e3 In: Manal o4 5lini!al Mi!ro2iolo&1 . Murray, R."., aron, M.$."., aller, >.., Teno:er, .)., 9olen, 1.*, ; th., 2ashington D). $%M. autiste'Muno+, )., oldo, @.M., Tanaka, !.H. -/. Identi4i!ation o4 Candida s003 21 rando"l1 a"0li4ied 0ol1"o0hi! NA anal1sis and di44erentiation 2et'een Candida albicans and Candida dubliniensis 21 dire!t P5R "ethods . . )lin. Microbiol. &=&'-. )irak, M. 9., 1alkanci, $., 1ustimur, %. -/. Use o4 Mole!lar "ethods in identi4i!ation o4 Candida s0e!ies and e$oltion o4 4l!ona%ole resistan!e . Mem. Inst. 7swaldo )ru+. 38=&-<'&/-. Dendis, M., *or:ath, R., Michalek, ., Ru+icka, ., 5rijal:a, M., artos, M., enedik, . -/. P5RRFLP dete!tion and s0e!ies identi4i!ation o4 4n&al 0atho&ens in 0atients 'ith 4e2rile netro0enia . )lin. Microbiol. Infect. 3=&&3&' &--. 1arababa, M., )oste, $.T., Rognon, ., ille, ., %anglard, D. -. 5o"0arison o4 &ene e=0ression 0ro4ile o4 Candida albicans a%ole resistant !lini!al isolates and la2orator1 strains e=0osed to dr&s indsin& "ltidr& trans0orters . $ntimicrob. $gen. )hemother. 8=/;'/<3. 6eppelenbroek, 6.)., %polidorio, DM"., %polidorio, !.). -4. Mole!lar 4in&er0rintin& "ethods 4or the dis!ri"ination 2et'een C. albicans and C. dubliniensis. 7ral Dis., &-=--'-4/.
