BAB I PENDAHULUAN
1 . 1.
Latar Belakang Aplikasi Aplikasi penggunaan penggunaan teknologi teknologi genetika genetika merupakan merupakan suatu revolusi besar dalam ilmu forensik yang yan g telah berkembang sejak lebih dari dua puluh tahun tahun yang yang lalu. lalu. Sejara Sejarah h forens forensik ik moleku molekular lar modern modern berawa berawall dari dari kasus kasus pertama yang menggunakan hasil analisis DNA asam deoksiribonukleat! sebagai bukti. Analisis terhadap sifat polimorfisme DNA memun"ulkan suatu istilah baru yaitu # DNA Fingerprinting $ atau ‘DNA Sidik %ari’. Analis Analisis is DNA tidak tidak hanya hanya diguna digunakan kan dalam dalam bidang bidang ilmu ilmu forens forensik ik terutama untuk identifikasi& analisis DNA juga digunakan dalam bidang ilmu kedokteran kedokteran lainnya& lainnya& misalnya misalnya untuk diagnosis diagnosis antenatal terhadap terhadap penyakit penyakit herediter& uji 'igot kembar& deteksi perubahan genetika pada tumor& analisis marker untuk transplantasi sumsum tulang& uji paternitas& identifikasi patogen& uji kemungkinan adanya kontaminasi dari jaringan maternal terhadap fetus melalui analisis vilus plasenta dan lain sebagainya. Se"a Se"ara ra gari gariss besa besarr tuju tujuan an dari dari fore forens nsik ik gene geneti tik k adal adalah ah untu untuk k membedakan antar indivudu atau mempermudah identifikasi dengan membuat perbandingan yang fokus pada daerah genom yang sering berbeda antara masing masing(ma (masin sing g indivi individu& du& dengan dengan kata kata lain lain daerah daerah yang polimo polimorfi rfik. k. Ada
1
kesalahpahaman bahwa setiap orang memiliki rangkaian genetik yang seluruhnya berbeda& dalam kenyataannya sekitar ))* dari rangkaian nukleotida yang terdapat dalam DNA adalah sama pada semua individu. Apa yang penting dan menghasilkan keunikan pada masing(masing individu adalah wilayah yang relatif langka dan mengandung variabilitas. +ariabilitas tersebut dapat berupa penambahan& pengurangan ataupun penggantian nukleotida& daerah ini selanjutnya disebut sebagai daerah yang polimorfik dan perbedaan inilah yang menjadi dasar identifikasi DNA sidik jari. Sejumlah besar polimorfisme DNA ditemukan di seluruh genom. Syarat yang perlu diperhatikan dalam pengambilan sekuens DNA sebagai alat yang efektif dalam identifikasi forensik adalah bersifat sangat polimorfik bervariasi antar setiap individu!& mudah dan murah untuk dilakukan karakterisasi& sederhana untuk ditafsirkan& memiliki tingkat mutasi yang rendah dan mudah untuk dibandingkan.
,roses pemetaan DNA dapat
dilakukan melalui beberapa metode diantaranya Restriction Fragment Length Polymorphism -L,!& Variable Number Tandem Repeats +N/-s!& Short Tandem Repeats S/-s!& dan Polymerase Chain Reaction ,0-!. etode ,0-(-L, digunakan salah satunya pada penelitian mengamplifikasi DNA pada daerah 2/S DNA -ibosomal dengan en'im restriksi pada situs pemotongannya yang kemudian dianalisis menggunakan elektroforesis.
1.3.
-umusan asalah
2
1. Apa yang dimaksud dengan -estri"tion ragment Length ,olymorphisms -L,!4 3. Bagaimana proses pemeriksaan sidik jari DNA menggunakan teknik -estri"tion ragment Length ,olymorphisms -L,!4 5. Apa kelebihan dan kekurangan menggunakan teknik -estri"tion ragment Length ,olymorphisms -L,! dalam pemeriksaan sidik jari DNA4
1.5.
/ujuan 1. engetahui pengertian dari -estri"tion ragment Length ,olymorphisms -L,! 3. engetahui proses pemeriksaan sidik jari DNA menggunakan teknik -estri"tion ragment Length ,olymorphisms -L,! 5. engetahui kelebihan dan kekurangan menggunakan teknik -estri"tion ragment Length ,olymorphisms -L,! dalam pemeriksaan sidik jari DNA
BAB II PEMBAHASAN
3
3.1.
,engertian -estri"tion ragment Length ,olymorphisms -L,! -L, adalah salah satu aplikasi analisis DNA asli pada penelitian forensik. -estri"tion fragment length polymorphism -L,! adalah teknik dalam biologi molekuler yang digunakan untuk penandaan genetik berbasis hasil amplifikasi perbanyakan! ,0- terhadap potongan(potongan fragmen! DNA yang terbentuk akibat aktivitas en'im restriksi tertentu. 6n'im restriksi adalah en'im& molekul protein& yang memotong DNA pada area restriksi. 2ntinya& sampel DNA dipe"ah dan di"erna oleh en'im restriksi. ragmen yang dihasilkan dipisahkan menurut panjangnya dan pola ukuran fragmen akan berbeda untuk setiap individu yang diuji. -L, merupakan teknik sidik DNA berdasarkan deteksi fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Awalnya DNA diisolasi dari sampel yang kemudian dipotong dengan en'im khusus restriction endonuclease. 6n'im ini memotong DNA pada pola sekuen tertentu yang disebut restriction endonuclease recognition site sisi yang dikenali oleh en'im restriksi!. Ada atau tidaknya sisi yang dikenali ini di dalam sampel DNA menghasilkan fragmen DNA dengan panjang yang bervariasi. Selanjutnya potongan fragmen tersebut akan dipisahkan dengan elektroforesis pada gel agarose 7&8*. ragmen DNA kemudian dipindahkan dan difiksasi pada pada membran nilon dan dihibridisasi spesifik dengan pela"ak probe! DNA berlabel radioaktif yang akan berikatan dengan sekuen DNA komplementernya pada sampel.
4
etode ini akhirnya mun"ullah pita(pita yang unik untuk etiap individu arks dkk.& 1))9!. etode ,0-(-L, yang memanfaatkan amplifikasi dengan primer spesifik atau universal yang diikuti dengan pemotongan menggunakan en'im restriksi endonuklease dan dilanjutkan dengan analisis menggunakan elektroforesis telah banyak digunakan untuk penentuan filogeni tanaman. ,emanfaatan ,0-(-L, dalam identifikasi dan penentuan filogeni pada tanaman telah banyak dilakukan& antara lain pada ungi Nakamura et al 1)):!& ,haseolus ;avier et al 1)):! dan pisang 6kasari 3711!. Beberapa aplikasi untuk analisis -L, meliputi< a. Sidik jari DNA& 2lmuwan forensik dapat menggunakan analisis -L, untuk mengidentifikasi tersangka berdasarkan bukti yang dikumpulkan pada adegan kejahatan. b. =eturunan. -L, juga digunakan dalam penentuan paternitas atau untuk mela"ak keturunan. ". =eanekaragaman genetik. /eknik ini dapat digunakan dalam mempelajari evolusi dan migrasi satwa liar& mempelajari pola berkembang biak pada populasi hewan dan dalam pendeteksian dan diagnosis penyakit tertentu.
3.3.
,roses ,emeriksaan Sidik %ari DNA enggunakan /eknik -estri"tion ragment Length ,olymorphisms -L,!
5
3.3.1
2solasi DNA DNA harus diperoleh dari sel atau jaringan tubuh. >anya dalam jumlah sedikit jaringan seperti darah& rambut atau kulit yang bila perlu dapat dilakukan penggandaan dengan ?,olimerase 0hain -ea"tion@ ,0-!. ,roses selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau kontaminan yang tidak diinginkan. ,emisahan DNA dari komponen sel yang lain& termasuk debris sel& dilakukan dengan sentrifugasi. Supernatan dibuang& ditambahkan ethanol :7*
untuk
men"u"i DNA& residu potassium asetat menjadi larut. =ontaminan yang umum ditemukan adalah polisakarida yang dapat mengganggu proses ,0- dengan "ara menghambat aktivitas /a polymerase& atau poliphenol yang dalam bentuk teroksidasi akan mengikat DNA se"ara kovalen. ntuk menghindarkan hal ini jaringan yang digunakan dijaga tetap dingin sebelum dan selama proses ekstraksi. Selain itu dilakukan penambahan antioksidan seperti ,+,.
Cambar 3.1 2lustrasi >asil isolasi DNA
3.3.3
,emotongan dengan 6n'im -estriksi digesti restriksi! DNA hasil isolasi kemudian dipotong dengan en'im restriksi tertentu yang dipilih dengan hati(hati. Setiap en'im restriksi pada kondisi yang sesuai akan mengenali dan memotong DNA sehingga dihasilkan
fragmen(fragmen
6
DNA.
ragmen(fragmen
tersebut
selanjutnya dielektroforesis pada gel agarosa.
=arena fragmen(
fragmen tersebut tidak akan terlihat sebagai smear berkesinambungan bila diwarnai dengan ethidium bromide& maka pewarnaan saja umumnya tidak dapat mendeteksi adanya polimorfisme. 6n'im restriksi yang digunakan terdiri dari "ampuran 6"o-2 dan ,st2. 6n'im 6"o-2 berasal dari bakteri Eschericia coli& sedangkan en'im ,st2 berasal dari bakteri Proidencia stuartii! 6n'im 6"o-2 akan memotong pada sekuens CAA//0 . Didalam
sekuens
pengenal
tersebut&
6n'im
6"o-2
memotongnya tidak pada sembarang situs tetapi hanya memotong pada bagian atau situs antara C dan A. ,otongan(potongan DNA untai ganda yang dihasilkan akan memliki ujung beruntai tunggal. jung seperti ini yang dikenal dengan istilah stic"y end . Sedangkan en'im ,st2 akan memotong pada sekuens sebagai berikut < 8
( 0/C0AC (
5 5
( CA0C/0 (
8
8
( 0/C0A|C (
5 5
( C|A0C/0 (
8
8 (0/C0AC( 5 5 (CA0C/0( 8 3.3.5
/ransfer DNA /ransfer DNAdari gel agarose ke nilon berpori. /ransfer DNA disebut #Southern blotting. Cel didenaturasi dengan larutan dasar dan diletakkan pada suatu nampan.
Selanjutnya di atas gel hasil
elektroforesis diletakkan nilon berpori atau membrane nitroselulosa&
7
kemudian di atasnya diberi pemberat.
Semua fragment hasil
pemotongan dengan en'im restriksi yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer se"ara kapiler ke membrane tersebut dalam bentuk untai tunggal. ,ola fragmen akan sama dengan yang berada pada gel.
Cambar 3.3 ,emisahan fragmen DNA pada agarose menggunkan gel elektoforesa
Cambar 3.5 ,roses "apillary transfer DNA dari gel agarose ke membran. 3.3.E >ibridisasi dan +isualisasi DNA yang ditransfer pada nilon berpori atau membrane nitroselulosa
selanjutnya
dihibridisasi
dengan
probe.
Dengan
menambahkan radioaktiv atau pewarna probe pada sehelai nilon menghasilkan DNA fingerprint& Setiap probe seperti batang pendek pita! hanya 1 atau 3 tempat yang khas pada helaian nilon tersebut. %adi probe DNA akan mengenali hanya sekuen yang komplemen dan se"ara ideal homolog diantara beribu(ribu atau bahakan berjuta(juta fragmen yang bermigrasi sepanjang gel. ragmen yang diinginkan
8
dapat dideteksi setelah dilakukan pemaparan membrane yang telah mengalami hibridisasi pada film.
Cambar 3.E ,rosedur DNA hybridisasi dari membran hasil transfer dan diekspose dengan F(ray film. ,robe DNA juga dikonversi menjadi molekul untai tunggal dan dilabeli menggunakan metode standar seperti radioisotope dan digoFygenin& dan selanjutnya digunakan untuk hibridisasi. /ahapan akhir DNA fingerprint dibuat dengan menggunakan beberapa probe 8(17 atau lebih! Biasanya menyerupai pita(pita DNA.
Cambar 3.8 +isualisasi potongan DNA yang telah dipotong dengan en'im restriksi dan dilabel dengan marker spesifik. 3.3.8
,emba"aan >asil >asil pemeriksaan yang dihasilkan akan berbetuk pita G pita. =arena DNA itu unik bagi individu& kita bias menggunakan sidik jari untuk
9
men"o"okkan informasi genetik dengan orang darimana berasala keturunan!. /eknik -estri"tion ragment Length ,olymorphisms -L,! ini ?memotong@ gen yang mungkin menjadi faktor pembeda dengan menggunakan en'im restriksi. Lalu dipisahkan berdasarkan ukuran menggunakan gel elektroforesis. ,ola yang terbentuk akan sangat unik karena ada variabilitas yang lebih banyak pada gen yang diperiksa. Lihat Cambar 3.9 dan 3.:!
Cambar 3.9 >asil ba"a dari -L,
Cambar 3.: >asil pemeriksaan sidik jari DNA berupa pita(pita 3.5
=elebihan dan =ekurangan enggunakan /eknik -estri"tion ragment Length ,olymorphisms -L,! dalam ,emeriksaan Sidik %ari DNA 3.5.1 =elebihan /idak memerlukan pengetahuan atau data tentang sekuens DNA genom yang akan dianalisa& hanya memerlukan sampel DNA dalam jumlah yang sedikit& teknik ini dapat digunakan untuk berbagai jenis
10
sampel DNA& penanda yang dihasilkan lebih dapat diper"aya dan hasil pengulangan lebih baik jika dibandingkan dengan metode lain. empunyai akurasi yang tinggi dan mudah ditransfer antar laboratorium&
bersifat kodominan sehingga dapat mendeteksi
adanya hetero'igositas
3.5.3 =ekurangan ,enanda DNA yang dihasilkan hanya bersifat dominan& DNA dengan kemurnian tinggi dalam jumlah banyak& tidak mungkin dilakukan outomatisasi& pada beberapa spesies mempunyai level polimorfisme yang rendah& sedikit lokus yang terdeteksi& memerlukan perpustakaan probe yang sesuai& membutuhkan waktu yang banyak& membutuhkan biaya yang banyak a"htiyah&3779!.
BAB III KESIMPULAN 5.1.
=esimpulan
11
5.1.1
-estri"tion fragment length polymorphism -L,! adalah teknik dalam biologi molekuler yang digunakan untuk penandaan genetik berbasis hasil amplifikasi perbanyakan! ,0- terhadap potongan( potongan fragmen! DNA yang terbentuk akibat aktivitas en'im
5.1.3
restriksi tertentu. ,roses ,emeriksaan Sidik %ari DNA enggunakan /eknik -estri"tion ragment Length ,olymorphisms -L,!& yaitu 2solasi DNA& ,emotongan dengan 6n'im -estriksi digesti restriksi!& /ransfer DNA&
5.1.5
>ibridisasi dan +isualisasi. =elebihannya bersifat kodominan sehingga dapat mendeteksi adanya hetero'igositas& mempunyai akurasi yang tinggi. =ekurangannya membutuhkan waktu yang banyak& membutuhkan biaya yang banyak penanda DNA yang dihasilkan hanya bersifat dominan.
12
DAFTAR PUSTAKA
1.
Nurul&Andti Hratiwi&dkk.3715.Sidik %ari DNA
3.
swahdani& -ohati.3715.=6AN6=A-ACAAN HL6=L6- D-2AN B6-DASA-=AN -AC6N 2N/6-NAL /-ANS0-2B6D S,A06-S 2/S! DNA -2BHSHAL 6LAL2 ANAL2S2S ,0-(-L,. neversitas Negeri Semarang
5.
arks& D.B.& arks& A.D.& Smith& 0.. 1))9. #asic $edical #iochemistry. Iilliams J Iilkins. Baltimore
E.
6kasari /ID. 3711. Analisis =eanekaragaman Cenetika =ultivar ,isang enggunakan ,enanda ,0-(-L, pada 2nternal /rans"ribed Spa"er 2/S! DNA -ibosomal. Skripsi!. Semarang< niversitas Negeri Semarang.
8.
-atna& =artika ,ertiwi. ,enerapan /eknologi DNA dalam 2dentifikasi orensik.
9.
A.=resna dan Stephanie L. 3779. Pra"ti"um Te"ni" Analisa Dna %p # Dna Finger Printing . akultas /eknobiologi. niversitas Surabaya
:.
Davidson. 377). RFLP $ethods. http
.
-estri"tion ragment Length ,olymorphism -L,!. https
).
a"htiyah dan Laras Arumingtyas. 3779. $anipulasi &en ' RFLP Analysis! Laboratorium #iologi $ole"uler dan Seluler . (niersitas #ra)i*aya < alang.
13
17. ,hilips& /heresa.371:.Learn About -L, and /he DNA Analysis Appli"ations. ttps
14
