UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DEL ESTADO DE MÉXICO FACULTAD DE QUÍMICA QUÍMICO FARMACÉUTICO BIÓLOGO LABORATORIO DE BIOFARMACIA REPORTE DE LA PRÁCTICA NO. 1 VALIDACIÓN DE UN MÉTODO BIONALÍTICO
“
”
INTEGRANTES: LILIAN
GALINDO GÓMEZ YUNUEN GAMA DOMINGUEZ EDUARDO GÓMEZ RUIZ MARIAN JERUSALEN SANCHEZ VEGA
EQUIPO:
GRUPO: 82
1/MARZO/2013
PRÁCTICA NO. 1: “VALIDACIÓN DE UN MÉTODO BIONALÍTICO” BIONALÍTICO” OBJETIVO Validar un método espectrofotométrico, mediante la concentración de salicilatos salicilatos existentes en la orina.
HIPÓTESIS El método bionalítico que utilizaremos para la determinación de salicilatos en orina, cumple con los requisitos.
MARCO TEÓRICO La validación de un método es un requisito importante en la práctica de los análisis químicos. Sin embargo, se suele considerar a la validación de un método como algo que solamente se puede hacer en colaboración con otros laboratorios y en consecuencia, no se hace.
Método bionalítico: conjunto de todos los procedimientos involucrados en la obtención, tratamiento, almacenamiento y análisis de muestras (especímenes) biológicas para la determinación cuantitativa de una sustancia en una matriz biológicas determinada.
Validación de métodos bionalíticos: establecimiento de la evidencia documentada de que un método bionalítico es lo suficientemente fiable para la obtención de resultados precisos y exactos dentro de las especificaciones de calidad establecidas previamente. La validación de los métodos se realiza cuando:
*La medición analítica es importante (costo, salud, remediación) *Por la obligación profesional del analista: el cliente espera confiar en los resultados informados y generalmente los cuestiona cuando aparece algún conflicto.
*Se desarrolla un nuevo método *Se revisa un método ya establecido para me jorar o extender a uno nuevo Los diferentes parámetros que se miden para saber cual es el desempeño de los trabajadores son:
Linealidad: denominada normalmente como curva patrón o curva de calibración. La linealidad del método es su capacidad para obtener (dentro de cierto intervalo) resultados que son directamente proporcionales a la concentración en la muestra de la sustancia que se pretende analizar.
Intervalo: el intervalo de un método bioanalítico está definido por las concentraciones comprendidas entre los niveles de concentración superior e inferior de la sustancia, en el cual se ha demostrado que el método es preciso, exacto y lineal.
Exactitud: capacidad de un métodos para producir resultados lo más próximos posibles a los valores que son aceptados convencionalmente como verdaderos o r eales.
Precisión: grado de dispersión de los resultados analíticos a su valor medio. Es una medida de cuán cerca están los resultados unos de otros, generalmente se expresa por medidas como la desviación estándar. Las dos medidas más comunes son repetibilidad y reproducibilidad.
Repetibilidad: da una idea del tipo de variabilidad que se puede esperar cuando el método es desarrollado por un mismo analista en un mismo equipo a los largo de un periodo de tiempo corto. Ej., la variabilidad esperada entre los resultados cuando la muestra es analizada por duplicado.
Limite de repetibilidad “r ”: el cual le permite al analista decidir si es significativa la diferencia entre análisis duplicados de una muestra, realizados en condiciones de repetibilidad.
Reproducibilidad: la precisión más grande esperada. Una muestra analizada por varios laboratorios. Formalmente, excluye la variación respecto al tiempo.
Límite de reproducibilidad “R”: el cual le permite al analista decidir si es significativa la diferencia entre análisis duplicados de una muestra, realizados en condiciones de re producibilidad.
La repetibilidad y la reproducibilidad, dependen de la concentración del analito y en consecuencia, deberían determinarse para varias concentraciones.
Para evaluar la ejecución de la validación del método en 1991 Lang y Bolton proporcionaron la primera estrategia global de validación que aun se acepta y se compone de cuatro elementos:
Calificación del personal: antes de iniciar la validación del método, se efectúa una pre-validación por un analista primario. Esto provee al analista la oportunidad de obtener experiencia práctica con el método ayudándole a identificar las condiciones críticas. En este punto se recomienda establecer el rango óptimo de la curva estándar y numero de calibradores, así como de optimizar el esquema de extracción y recobro, para que los datos entren en los límites de cuantificación y para ayudarle a determinar si el procedimiento de extracción es reproducible.
Validación prospectiva: este paso consta de cuatro ensayos analíticos generados por dos analistas en dos días diferentes. Cada ensayo imita las condiciones analíticas del estudio prospectivo y las expectaciones del tiempo de corrida. Esa estrategia ayuda al analista primario a desarrollar una rutina diaria usada durante el estudio y anticipar problemas potenciales en el ensayo.
Estudio prospectivo: una vez que se ha determinado por las dos etapas anteriores que el método cumple con los parámetros de validación, se generarán curvas
estándar para determinar las concentraciones de fármaco en las muestras cada vez que se requiera.
Análisis estadísticos: el diseño estadístico permite revelar que los datos bioanalíticos obtenidos a partir del método son reproducibles y están dentro de una rutina básica.
Los salicilatos son fármacos con propiedades antiinflamatorias, analgésicas y antipiréticas como resultado de la inhibición de la enzima ciclooxigenasa (COX), que posibilita la síntesis de prostaglandinas y, mediadores de la inflamación. Constituyen un grupo de compuestos derivados del ácido salicílico. P. Trinder en 1954 desarrolló un método rápido para determinar la presencia de salicilatos en fluidos humanos empleando 1 ml (mililitro) de suero sanguíneo. El método se basó en la precipitación de las proteínas del suero al adicionar cloruro mercúrico y luego nitrato férrico para crear un compuesto coloreado, midiendo posteriormente la absorbancia por espectrofotometría. La reacción cuantitativa para la determinación de salicilatos es por medio del método de Trinder, este se puede aplicar a muestras m uestras como son orina, suero o plasma. **Método de Trinder: precipita las proteínas con HgCI2 y el color que aparece con el salicilato es +3 acomplejado por el ión Fe como nitrato férrico.
MATERIALES Y REACTIVOS
MATERIALES Pipetas graduadas de 1, 2 y 5 ml. Pizeta y pañuelos desechables Matraces volumétricos de 10 ml. Tubos de ensaye de 16x150 ó 13x100 13 x100 Espectrofotómetro Centrífuga
Material biológico:
Orina. 1 L por equipo
REACTIVOS Agua destilada Reactivo de Trinder Salicilato de sodio
METODOLOGÍA
RESULTADOS EXPERIMENTALES
Primer Análisis de Exactitud y Precisión
Datos del químico: Lilian Galindo Gómez
Datos de las técnicas: Marian Jerusalén Sánchez Veg a/ Yunuén Gama Domínguez
Determinación de la Longitud de onda a la cuál se da una máxima absorbancia Se realizo un barrido entre 500 y 600 nm utilizando el blanco y la muestra de menor concentración (Ver tabla 1) utilizando un equipo espectrofotométrico con numero de serie 0249998, dando un resultado de 521nm. La cantidad de analito (Salicilato de sodio) pesada en la balanza analítica (número de serie 0327505) fue:
Para la primera curva: 0.0036g (Ver tabla 1)
Para la segunda curva: 0.0031g (Ver tabla 2)
Tabla 1. Absorbancias (medidas a 521nm) y concentraciones para la primera curva analítica Tubo
Absorbancia
Concentración (mg/mL)
1 (Blanco=orina) 2 (5mL+1) 3 (4mL+1) 4 (3mL+1) 5 (2mL+1)
0.0 0.797 0.522 0. 428 0.314
0.0 0.3 0.24 0.18 0.12
Gráfica 1. Absorbancia vs concentración. Primera curva analítica
Curva 1 Absorbancia vs Concentración 1 0.8 a i c n a b r o s b A
0.6 0.4 0.2 0
-0.2
0
0.05
0.1
0 .1 5
0 .2
Concentración mg/mL
0.25
0.3
0 .3 5
Tabla 2. Absorbancias (medidas a 521nm) y concentraciones para la primera curva analítica Tubo
Absorbancia
Concentración (mg/mL)
1 (Blanco=orina) 2 (5mL+1) 3 (4mL+1) 4 (3mL+1) 5 (2mL+1)
0.0 0.419 0.321 0.249 0.163
0.0 0.258 0.20 0.15 0.1
Gráfica 1. Absorbancia vs concentración. Segunda curva analítica
Curva 2 Absorbancia vs Concentración 0.5 0.4
a i c n 0.3 a b r o 0.2 s b A
0.1 0 0
0.05
0 .1
0 .1 5
0.2
0.25
Concentración mg/mL
Tabla 3 Comparación entre la curva 1 y la curva c urva 2 por medio de métodos estadísticos
Pendiente Ordenada al origen Desviación estándar r 2 r Media C.V.
Curva 1
Curva 2
2.571 -0.025 0.067 0.966 0.933 0.21 31.9%
1.60 0.004 0.058 0.999 0.998 0.177 32.76%
Interpretación de las gráficas y de los análisis estadísticos para el primer análisis:
0.3
Linealidad: Debido a que los valores de r y r 2 para ambos casos son mayores que 0.9 se considera que el método es lineal.
Proporcionalidad: Debido a que los valores para la ordenada al origen son diferentes de cero, el método se considera no proporcional; aunque es necesario confirmar con un análisis estadístico de T de student (Ver tabla 7).
Precisión y repetitividad: Debido a que los resultados determinados en ambos casos para el coeficiente de variación son mayores de 3% no se puede considerar al método como preciso, ni como repetitivo.
Precisión y reproducibilidad: Ver tabla 8 para el contraste entre las curvas para el primer y el segundo análisis.
Segundo análisis de exactitud y precisión
Datos del químico: Angel Omar Vilchis Rito
Datos del técnico: Eduardo Gómez Ruiz
Determinación de la Longitud de onda a la cuál se da una máxima absorbancia Se realizo un barrido entre 500 y 600 nm utilizando el blanco y la muestra de menor concentración (Ver tabla 4) utilizando un equipo espectrofotométrico con numero de serie 0257130, dando un resultado de 515nm. Nota: para unificar los valores de absorbancias absorbancias a nivel grupal grupal se acordó medir las muestras a 520nm para ambas curvas La cantidad de analito analito (Salicilato de de sodio) pesada en la balanza analítica (número de serie 0327505) fue:
Para la primera curva: 0.0033g (Ver tabla 4)
Para la segunda curva: 0.0033g (Ver tabla 5)
Tabla 4. Absorbancias (medidas a 520nm) y concentraciones para la primera curva analítica (Segundo análisis) Tubo
Absorbancia
Concentración (mg/mL)
1 (Blanco=orina) 2 (5mL+1) 3 (4mL+1) 4 (3mL+1) 5 (2mL+1)
0.0 0. 492 0.398 0.300 0.187
0.0 0.275 0.22 0.165 0.11
Gráfica 3. Absorbancia vs concentración. Primera curva analítica (Segundo análisis)
Curva 1 Absorbancia vs Concentración 0.6 0.5 a i c n a b r o s b A
0.4 0.3 0.2 0.1 0
-0.1 0
0 .0 5
0.1
0.15
0.2
0 .2 5
0 .3
Concentración mg/mL
Tabla 5. Absorbancias (medidas a 520nm) y concentraciones para la segunda curva analítica (segundo análisis) Tubo
Absorbancia
Concentración (mg/mL)
1 (Blanco=orina) 2 (5mL+1) 3 (4mL+1) 4 (3mL+1) 5 (2mL+1)
0.0 0.505 0.415 0.318 0.225
0.0 0.275 0.22 0.165 0.11
Gráfica 4. Absorbancia vs concentración. Segunda curva analítica (Segundo análisis)
Curva 2 Absorbancia vs Concentración 0.6 0.5
a i c 0.4 n a b 0.3 r o s b 0.2 A
0.1 0 0
0.05
0.1
0 .1 5
Concentración mg/mL
0 .2
0 .2 5
0 .3
Tabla 6 Comparación entre la curva 1 y la curva 2 por medio de métodos estadísticos (Segundo análisis)
Pendiente Ordenada al origen Desviación estándar r 2 r Media C.V.
Curva 1
Curva 2
1.841 -0.010 0.061 0.999 0.999 0.192 31.77%
1.703 0.037 0.061 0.999 0.999 0.192 31.77%
Interpretación de las gráficas y de los análisis estadísticos para el primer análisis:
Linealidad: Debido a que los valores de r y r 2 para ambos casos son mayores que 0.9 se considera que el método es lineal.
Proporcionalidad: Debido a que los valores para la ordenada al origen son diferentes de cero, el método se considera no proporcional; aunque es necesario confirmar con un análisis estadístico de T de student (Ver t abla 7).
Precisión y repetitividad: Debido a que los resultados determinados en ambos casos para el coeficiente de variación son mayores de 3% no se puede considerar al método como preciso, ni como repetitivo.
Precisión y reproducibilidad: Ver tabla 8 para el contraste entre las curvas para el primer y el segundo análisis.
Tabla 7 Confirmación de la proporcionalidad de ambos procesos por medio de un análisis estadístico de T de student. Se realizo el análisis estadístico de T de student en Excel 2010 con los valores de ordena al origen de las cuatro curvas experimentales representativas para los dos análisis realizados. Se hizo la prueba con una significancia del 0.05% (teniendo así un 95% de certeza en la interpretación de nuestros resultados) obteniendo los siguientes datos:
Prueba t para medias de dos muestras emparejadas Variable 1
Media Varianza Observaciones Coeficiente de correlación de Pearson Diferencia hipotética de las medias Grados de libertad Estadístico t P(T<=t) una cola Valor crítico de t (una cola) P(T<=t) dos colas Valor crítico de t (dos colas)
-0.0105 0.0004205 2 1 0 1 -2.66666667 0.11420025 6.31375151 0.2284005 12.7062047
Variable 2
0.0135 0.0011045 2
Interpretación del análisis estadístico de t de student: Debido a que el valor estadístico de t es menor que el valor crítico de t podemos decir que hay evidencia suficiente para asegurar que el proceso si es proporcional para un porcentaje de confianza del 95%.
Tabla 7 Determinación de precisión y reproducibilidad, relación entre ambos análisis experimentales.
Análisis 1, curva 1 Análisis 1, curva 2 Análisis 2, curva 1 Análisis 2, curva 2 Promedio total
Media
Desviación estándar
Coeficiente de variación
0.21 0.177 0.192 0.192 0.192
0.067 0.058 0.061 0.061 0.061
31.9% 32.76% 31.77% 31.77% 32.05%
Interpretación de los resultados: Debido a que el coeficiente de variación de los datos es demasiado alto no podemos considerar al método como preciso, ni como r eproducible.
CONCLUSIONES Una vez hechas las interpretaciones de los gráficos y cálculos de los parámetros matemáticosestadísticos, se llego a la conclusión de que nuestro método espectrofotométrico para la determinación de salicilatos en orina es lineal y proporcional, mientras que los analistas tienen un buen grado de exactitud durante una prueba individual (realizada en un único día), ya que ambas gráficas muestran un comportamiento semejante para ambos análisis, análisis, efectuados cada uno por duplicado. Sin embargo una vez que se hacen los contrastes entre ambos análisis, realizados de manera independiente (en días diferentes) se tienen resultados que determinan que el método no puede ser considerado preciso, ni repetitivo, ni reproducible. Esto se puede deber a un error sistemático, incluso propio de los analistas, es difícil hablar acerca del uso de equipos y materiales diferentes, ya que aunque fue el caso en la práctica; por concepto el grado de precisión y reproducibilidad se maneja por la concordancia entre determinaciones independientes realizadas bajo condiciones diferentes. Aunque los analistas cumplen con exactitud, y el método fue evaluado como lineal y proporcional; no se puede validar el proceso del todo ya que es necesaria una mejora en la precisión; o bien repetir la validación del método para evaluar el grado de repetitividad de cada uno de los analistas identificando si hay una concordancia entre los resultados obtenidos para evaluar la posibilidad de establecer un margen de error interno.
CUESTIONARIO: Referencias:
http://www.plataformadeoncologia.com/imagenes/Dra_%20Leal.pdf http://www.suelos.org.ar/adjuntos/validacion_metodos_analiticos.pdf http://www.bvsde.paho.org/bvstox/e/fulltext/marcha_toxicologica.pdf
