UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS QUÍMICA DE ALIMENTOS MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
TEMA: Producción de un Biofertilizante a partir de cepas Azotobacter spp. Aisladas de plantaciones de Stevia Rebaudiana Realizado por:
Andrade Ma. José Correa Carina Cueva Patricia Simba Saskia
2009
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INDICE
Páginas 1. Antecedentes 2. Justificación 3. Problema
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4. Objetivos
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4.1 Objetivo general 4.2 Objetivos específicos
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5. Fundamento teórico
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6. Marco metodológico
8 - 15
7. Bibliografía
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8. Anexos
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1. ANTECEDENTES
Fritz Haber (1913) descubrió un proceso para la síntesis de amoniaco por combinación directa de nitrógeno e hidrogeno, y Carl Bosch (1930) lo adoptó en forma comercial. El proceso actual de producción de fertilizantes nitrogenados se conoce como HaberBosch y se caracteriza por requerir grandes cantidades de energía. Este fertilizante químico tiene un rendimiento del 50% de absorción por parte de la planta. En los últimos años se han venido produciendo biofertilizante a base de microorganismos fijadores de nitrógeno, de la siguiente manera: Burdmann (2000) experimentó con Azospirillum brasilense , demostrando un incremento en los rendimientos de las leguminosas con un 71% al permanecer en la zona de crecimiento de las raíces. En México los estudios realizados con Rhizobium , bacterias que se utilizan para infectar las semillas de leguminosas, según datos de la UNAM (2005-2006) aumento la absorción de nitrógeno hasta en un 81% en las leguminosas. Algunas empresas producen biofertilizantes que se componen de múltiples microorganismos con lo cual se fija además de nitrógeno, fósforo, hierro, boro, molibdeno y otros nutrientes importantes para el desarrollo de los cultivos aumentando el rendimiento en un 63% de absorción por parte de la planta. El Azotobacter es el género que según estudios realizados ha demostrado tener el rendimiento de absorción a nivel de la rizosfera más alto que los otros microorganismos analizados para la elaboración de biofertilizantes. En publicaciones científicas se encontró que en la universidad Javeriana realizó aislamientos de bacterias fijadoras de nitrógeno para emplearlas en un programa de fertilización bajo un esquema de agricultura orgánica. El aislamiento se realizó a partir del suelo de un cultivo de Stevia rebaudiana. Las bacterias encontradas fueron de diversos géneros presentando fijación de nitrógeno. Entre las más efectivas fueron la Azotobacter, Rhizobium y Azospillum Brasilense. Las mismas que fueron evaluadas mediante una cinética de crecimiento y se tomo de cada una la cepa con mayor velocidad. El rendimiento las bacterias se determino con base en la producción de biomasa y concentración de glucósidos en la planta siendo la de mayor productividad el Genero Azotobacter presentando mejor estabilidad, pigmentación, mayor velocidad de crecimiento 0,1405 h-1 fase exponencial de 18 horas y una producción de AIA promedio de 38,4 mg/ml a las 150 horas. (1) En otras publicaciones realizadas en la universidad Nacional de Colombia, se aisló Azotobacter spp a partir de Caña de azúcar, el resultado de dicho biofertilizante fue un crecimiento de la planta mas no lograron una acumulación de glucósidos. (2)
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2. JUSTIFICACIÓN
Las bacterias azotobacter son capaces de fijar el nitrógeno atmosférico en el suelo, fijan aproximadamente 20 mg N/g de azúcar en cultivo puro en un medio libre de nitrógeno, siendo una gran fuente para obtener un biofertilizante natural que puede ser utilizado en la mayoría de cultivos, reduciendo el uso de los fertilizantes químicos nitrogenados. Las azotobacter proporcionan muchas ventajas como regular el crecimiento de las plantas, promueve el crecimiento de raíces lo que conlleva a un aumento en la concentración de materia seca, producción de fitohormonas, sideróforos y sustancias antifúngicas y genera enzimas que favorecen a la solubilización de fosfatos y oligoelementos, facilitando la asimilación de estos compuestos. El costo de un biofertilizante disminuye considerablemente en relación a un fertilizante químico, ya que el precio del gas combustible utilizado en la producción de fertilizantes nitrogenados representa del 70-80% del costo total. Para la producción de 1 tonelada de amoniaco anhidro se necesitan 33.5 MBtu 1. En los últimos 15 - 20 años el precio promedio de 1 MBtu fue de $ 2.20, pero ese precio ha incrementado hasta llegar a $5.00. El costo de producción de 1 tonelada de amoníaco anhidro llega a ser de $200. Actualmente un fertilizante químico nitrogenado se comercializa en $380 por sacos de 19Kg. 1.
35320725000 Joules. 1 BTU= 1054.35 Joules
Las cepas Azotobacter aisladas en el cultivo de stevia tienen una mayor velocidad de crecimiento que otras cepas aisladas de cultivos diferentes ofreciendo una mayor productividad. 3. PROBLEMA
El uso de fertilizantes químicos constituye un daño biológico a los suelos deteriorando la calidad de los mismos: inducen el aumento de acidez y salinidad eliminando el humus y suavizando los tejidos de la planta, provocando que ésta sea menos resistente y saludable; eliminan el ecosistema natural de suelo, desarrollando plantas más vulnerables. La salud y calidad del cultivo disminuye. Además la absorción del fertilizante es menor, es decir antes de que la planta tenga tiempo de absorberlos, sus componentes se evaporan, ejemplo la urea puede perder un 80% de su contenido de nitrógeno. La tierra se vuele dependiente a los químicos incrementando los daños al suelo y los costos de fertilización. Estos reducen la colonización de las raíces con rhizobia responsables de fijar nitrógeno atmosférico previniendo la asimilación natural de estos elementos. Por todos estos motivos antes mencionados es que se pretende producir un fertilizante natural que detenga o evite estos factores que de otra forma deterioran el medio ambiente.
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4. OBJETIVOS 4.1 GENERAL:
Producir un biofertilizante con cepas Azotobacter spp aisladas de cultivos de Stevia Rebaudiana mediante fermentación discontinua. 4.2 ESPECIFICO
Aislar, seleccionar y preservar la bacteria Azotobacter spp de muestras de cultivos de Stevia Rebaudiana proveniente de la agrícola El Edén, en el agar ashby. Evaluar el crecimiento de Azotobacter spp en caldo pikovskaya modificado y caldo alternativo con melaza y establecer el más adecuado para una producción a nivel industrial. Producir biomasa de la cepa escogida de Azotobacter spp ofreciéndoles las condiciones óptimas para su crecimiento. Elaborar un bioreactor para la producción del biofertilizante utilizando fermentación discontinua. Controlar el desarrollo del bioproceso mediante los parámetros: pH, temperatura y concentración de oxígeno.
5. MARCO TEORICO 5.1 Stevia:
asteráceas.
es un género de plantas fanerógamas perteneciente a la familia de las
Son hierbas y arbustos de la familia del girasol (Asteraceae), nativa de regiones subtropicales y tropicales de América del Sur y América Central. La especie Stevia rebaudiana Bertoni, conocida comúnmente como dulce hoja, o, simplemente, stevia, es ampliamente cultivada por sus hojas dulces. Como un sustituto del azúcar. 5.2 Biofetilizante:
Los biofertilizantes se caracterizan por la presencia de microorganismos vivos que no causan daño o enfermedad al hombre, a los animales ni a las plantas. Pueden emplearse bacterias u hongos microscópicos, llamados micorrízicos, que se asocian en forma natural con las raíces de las plantas, beneficiando su crecimiento y el rendimiento de los cultivos. Los microorganismos contribuyen con el crecimiento de las plantas y el rendimiento de los cultivos, pero para que éstos sean beneficiados es indispensable que las bacterias u hongos se encuentren vivos. El biofertilizante debe contener varios millones de bacterias por gramo de soporte sólido o por mililitro, en caso de ser acuoso. Una vez que la semilla germina y las raíces empiezan a desarrollarse, las bacterias se multiplicarán y colonizarán la superficie de las raíces y promoverán el crecimiento de las plantas. 5
5.3 Fermentación discontinua
Una fermentación discontinua (en batch) puede ser considerada como un "sistema cerrado". Al inicio de la operación se añade la solución esterilizada de nutrientes y se inocula con el microorganismo, permitiendo que se lleve a cabo la incubación en condiciones óptimas de fermentación. A lo largo de toda la fermentación no se añade nada, excepto oxígeno (en forma de aire), un agente antiespumante y ácidos o bases para controlar el pH. La composición del medio de cultivo, la concentración de la biomasa y la concentración de metabolitos cambia generalmente como resultado del metabolismo de las células observándose las cuatro fases típicas de crecimiento: fase de latencia, fase logarítmica, fase estacionaria y fase de muerte. En los procesos comerciales la fermentación frecuentemente se interrumpe al final de la fase logarítmica (metabolitos primarios) o antes de que comience la fase de muerte (metabolitos secundarios). 1.
Oxígeno
El oxígeno es el sustrato gaseoso más importante para el metabolismo microbiano y el anhídrido carbónico es el producto metabólico más importante. El oxígeno no es un gas muy soluble ya que una solución saturada de oxígeno contiene aproximadamente 9 mg / L de este gas en agua. Debido a la influencia de los ingredientes del cultivo, el contenido máximo de oxígeno realmente es más bajo de lo que debería ser en agua pura. El suministro se logra pulverizando aire en el fermentador durante el proceso. Una vez disuelto el O 2 éste tiene que transferirse desde la burbuja de gas a cada célula individual. 2.- Temperatura
Los microorganismos que crecen a una temperatura inferior a la óptima tienen retardado su crecimiento y por lo tanto reducida la producción celular, es decir su productividad. Por otro lado, si la temperatura es demasiado alta, pero no letal, se puede inducir una respuesta de estrés al choque térmico con la consiguiente producción de proteasas celulares que ocasionan una disminución en el rendimiento de los productos proteicos. 3.- pH
La mayor parte de los microorganismos crecen óptimamente entre pH 5,5 y 8,5. Pero durante el crecimiento en un fermentador, los metabolitos celulares son liberados al medio, lo que puede originar un cambio del pH del medio de cultivo. Por lo tanto se debe controlar el pH del medio de cultivo y añadir un ácido o una base cuando se necesite para mantener constante el pH. Por supuesto que esta adición del ácido o base debe ser mezclada rápidamente de tal manera que el pH del medio de cultivo sea el mismo en todo el fermentador. 5.4 Bacterias fijadoras de nitrógeno 6
Las bacterias fijadoras de nitrógeno son componentes muy importantes del suelo. Para desarrollar la fertilidad del suelo, debe aumentar el contenido de nitrógeno. En las condiciones medioambientales adecuadas, las bacterias fijadoras de nitrógeno producen enzimas que toman el nitrógeno en su forma gaseosa de la atmósfera, y, con los azúcares que obtienen de la planta, fijan el nitrógeno dentro de la biomasa bacteriana. Si las bacterias satisfacen sus necesidades de nitrógeno, entonces, el nitrógeno pasa a la planta, y pueden observarse niveles elevados de proteína en la planta. Este nitrógeno elevado no se libera al suelo hasta que muere parte de la planta, o se exuda al suelo en la rizósfera. Se dividen en dos grandes grupos: Las simbióticas, especificas de las leguminosas, como el Rhizobium, y las libres, que viven en el suelo y no necesitan la planta para su reproducción, como el Azotobacter y el Azospirillum, entre los más importantes en agricultura. El Azotobacter y el Azospirillum, en concentraciones adecuadas, pueden sustituir al nitrógeno químico(Urea, amoníaco...)sin merma de la producción y a menor coste. Otras ventajas comprobadas del uso de estas bacterias como biofertilizante son: a) Producen fitohormonas, como el ácido indolacètico y las citoquininas, capaces de acelerar y potenciar el crecimiento de las plantas. b) Al permanecer vivas durante años y reproducirse en el suelo, no sólo no lo degradan sino que contribuyen a su enriquecimiento en nitrógeno y a su regeneración de forma ecológica y gradual, incluso en terrenos de alta concentración salina. c) Se ha comprobado que fertilizando los cultivos con estas bacterias y con nitrógeno químico en un porcentaje entre el 20 y 50% del utilizado normalmente, se consigue un aumento de producción sobre las cosechas obtenidas únicamente con fertilizante químico al 100%. Esto es debido a que, al liberarse la bacteria de su función fijadora de nitrógeno, produce más factores de crecimiento vegetal, En cereales de secano, esto puede suponer el ahorro del abonado de cobertera. d) Crea una barrera protectora contra hongos y bacterias patógenas en la raíz de la planta, por lo que ésta crece más sana y fortalecida. e) Producen enzimas que solubilizan los fosfatos y los hacen más accesibles a la planta, así como factores que facilitan la absorción de oligoelementos. f) Se ha demostrado que resisten mejor las condiciones de sequía y los climas áridos ya que se forman alginatos en las raíces de las plantas. g) Como consecuencia de todo lo anterior, es un mayor desarrollo de las raíces de las plantas, con el consiguiente beneficio general para ésta, así como el peso de los frutos. h) También se ha comprobado un mayor índice de germinación de semillas comparada con otros sistemas de abonado. 7
i) Las nuevas estirpes de Azotobacter y Azospirillum son capaces de fijar un 72,64% más de nitrógeno atmosférico, que las estirpes originales.
Hay pues un cúmulo de ventajas para el usuario, económicas, ecológicas, A corto, medio y largo plazo en la progresiva sustitución de la fertilización química por las bacterias naturales, totalmente inofensivas para el medio y el ser humano. La N2 + 16 ATP + 8e-+ 8H+ nitrogenasa 2NH3 + 8H2 + 16 ADP+ 16 P
6. MARCO METODOLOGICO 6.1. MUESTREO DEL SUELO
De cada cultivo de Stevia se toman cinco muestras de 500g a una profundidad de 10 a 15 cm, el muestreo se realiza en forma de zig –zag a lo largo del cultivo. Las muestras se empacan en bolsas de papel que se colocan dentro de bolsas de plásticos herméticas y posteriormente se transportan en coolers. 6.1.1. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS
Una vez en el laboratorio, las muestras de suelo se tamizan en un tamiz estándar de 4.75 mm, con el fin de obtener gránulos uniformes, para realizar el aislamiento primario. 6.1.2. MEDICIÓN DE pH DE LAS MUESTRAS DEL SUELO
La medición del pH se realizan siguiendo el protocolo descrito por Van Lierop, 1981; se coloca en un frasco de vidrio limpio suelo tamizado y agua destilada en proporción 1:1 p/v. Posteriormente, la suspensión se deja precipitar durante 5 min y se toma el valor de pH del sobrenadante con un potenciómetro. Los valores de pH del sobrenadante a partir de cuatro mediciones en cada cultivo. 6.2. AISLAMIENTO 6.2.1. AISLAMIENTO PRIMARIA
A partir de cada muestra de suelo obtenida en los diferentes cultivos, se realiza el aislamiento primario por triplicado, empleando la técnica de gránulos de suelo; que consiste en colocar 20 gránulos en cajas de Agar Ashby – Sacarosa (medio especifico para Azotobacter spp) a una distancia aproximada de 1 cm. Las cajas se incuban a 28°C por 7 días hasta observar alrededor de los gránulos colonias translucidas y mucilaginosas. Se realiza el recuento de gránulos con colonias, con el fin de obtener el porcentaje de recuperación de bacterias diazótrofas aerobias asimbioticas para cada cultivo (% de recuperación = No. de gránulos con colonias mucilaginosas/total de gránulos sembrados x100) y se realiza coloración de gram. 8
6.2.2. AISLAMIENTO SECUNDARIO
El aislamiento secundario se realiza mediante siembra por agotamiento en cajas con Agar Ashby – Sacarosa a partir de las colonias obtenidas en el aislamiento primario. Las cajas son incubadas por 7 días a 28°C, posteriormente se observa el crecimiento en el medio selectivo Ashby – Sacarosa, la morfología de la colonia y de las células por medio de la coloración de Gram. Las cepas aisladas que presenten crecimiento en el segundo aislamiento se codifican de acuerdo al cultivo de donde fueron aisladas . 6.2.3. PIGMENTACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS
Con el fin de observar la producción de pigmentos en medio solido, de cada aislamiento se realiza una siembra en agar diferencial Ashby con 5 g/l de benzoato, remplazando la fuente de carbono (sacarosa) en cajas petri para observar la pigmentación en las colonias. La siembra se realiza tomando una colonia de cada aislamiento y realizando un estria en toda la caja, se incuba a 28°C por 7 días y se observa pigmentación
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6.3. IDENTIFICACIÓN BIOQUÍMICA
A cada aislamiento se le realiza una caracterización con base en el comportamiento bioquímico frente a la fermentación de glucosa, maltosa, manitol y ramnosa también se realiza una prueba de asimilación y crecimiento en benzoato como fuente de carbono, test de catalasa, oxidasa y desnitrificación en caldo nitrato. La bacteria de azucares se siembra con una colonia de cada cepa, se lleva a incubar a 28°C por 24 horas. Posteriormente se verifica la acidificación del medio como indicativo de la fermentación de azúcares y benzoato. Finalmente se realiza la prueba de Nessler para determinar la desnitrificación, y las pruebas de catalasa y oxidasa a partir de las colonias. Todas las pruebas bioquímicas se realizaron por triplicado.
6.4. CONSERVACIÓN DE LOS AISLAMIENTOS MEDIANTE LA TÉCNICA DE CRIO PRESERVACIÓN EN GLICEROL AL 50% (V/V)
A partir de las cepas aisladas y evaluadas se realizan cultivos en erlenmeyer de 100 ml con 50 ml de caldo nutritivo, el cual se incuba a 28°C por 24 Horas con agitación de 150 rpm. El cultivo se deposita en 10 viales de 1.5 ml de 50 % V/V de glicerol puro esteril. Luego se mantiene en congelación a -80°C. 6.5 SELECCIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO
En el caso de Azotobacter, existen una variedad de medio de cultivo químicamente definidos, recomendados por la literatura entre ellos se encuentra además del agar Ashby el caldo Pikovkaya modificado; sin embargo, el medio de cultivo que se utilice en la fermentación no solo debe cumplir con las necesidades nutritivas del microorganismos en cuestión, sino también con las exigencias del proceso de producción (costo y eficiencia) del mismo. El caldo Ashby es un medio de cultivo selectivo para Azotobacter debido a que no contiene nitrógeno. Su ventaja es que al ser un medio selectivo el crecimiento es lento, es observable a partir de los 3 – 5 días de realizada la siembra lo que implica un mayor gasto de energía para la producción. 10
El caldo Pikovskaya modificado es un medio no selectivo pero permite el crecimiento rápido de las bacterias y requiere un gasto de energía menor En ambos casos se necesitan reactivos químicos que implican un costo alto adecuado solo para producciones pequeñas a escala de laboratorio, por este motivo se formula un medio de cultivo alternativo a base de melaza tomando al caldo Pikovskaya modificado como patrón. 6.5.1. FORMULACIÓN DEL MEDIO DE CULTIVO ALTERNATIVO (CA)
Se partió de un estudio químico de la composición de la melaza y se procedió a sustituir los componentes del medio químicamente definido (CPM), por el medio natural, que constituye un medio adecuado para el crecimiento de microorganismos. Se toma como base la fuente de carbohidratos y proteínas (carbono y nitrógeno), garantizando el contenido requerido por la bacteria, según el caldo Pikovskaya modificado. Una vez obtenida la concentración teórica de melaza necesaria para sustituir los componentes del medio químico se realizan pruebas de crecimiento a nivel laboratorio, para ello se siembran cepas de Azotobacter spp en CA sólido utilizando concentraciones menores y mayores a la obtenida teóricamente. Las siembras se realizan por triplicado. 6.6. PRODUCCIÓN DE BIOFERTILIZANTE A NIVEL DE LABORATORIO 6.6.1. REACTIVACIÓN DE LAS CEPAS BACTERIANAS
Para reactivar a las bacterias se utiliza el caldo Pikosvscaya modificado liquido, ideal para el crecimiento de Azotobacter spp. El caldo correctamente preparado se vierte en tubos de ensayo (5 ml/tubo) y se esteriliza. Luego se inocula cada tubo con la cepa madre bajo condiciones de esterilidad y se incuba a 30°C por 24 horas. 6.6.2. OBTENCIÓN DEL PRE INOCULÓ
Para la preparación del pre inoculó se toman en cuenta los siguientes requisitos: 1.- El cultivo debe estar metabólicamente activo y libre de contaminantes. Para ello se trabaja bajo normas estrictas de esterilidad y se realiza un control permanente de cultivo mediante la observación directa al microscopio de las características del microorganismo utilizando técnicas microbiológicas. 2.- El inoculo debe estar en su fase exponencial (grado máximo de desarrollo). Para ello se evalua el crecimiento bacteriano durante 30 horas que es el tiempo estimado que tarda en alcanzar la fase exponencial. Se procura obtener preinóculos con una concentración de biomasa del orden de 108-109 células/ml.
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3.- Se debe dispones de una cantidad de cultivo suficiente para inocular el volumen de medio liquido a utilizar en la fermentación, el cual debe estar entre el 3 – 10 % del volumen total a fermentar. En este caso se trabaja con un volumen equivalente al 10% del volumen total a fermentar. PROCEDIMIENTO
Con las cepas reactivadas anteriormente se realiza un pool bacteriano. 10 ml de poll se inoculan en 90 ml de caldo Pikovskaya modificado (10% de volumen total a fermentar) y otros 10 ml en 90 ml de caldo alternativo, obteniéndose un volumen final de 100 ml de cultivo por cada caldo de fermentación. Posteriormente se incuban a 30°C por 24 horas y 150 rpm en matraces de 250 ml. 6.6.3. FERMENTACIÓN DISCONTINUA
Una vez obtenidos los preinoculos, estos se inoculan en 900 ml de CPM y 900 de CA. Luego , son incubados a una temperatura promedio de 28°C por 72 horas. El oxigeno se suministra utilizando un aireador para pecera con un flujo de aire aproximado de 1 m3 /h en matraces de 2000 ml.
El esquema del proceso global de producción de Azotobacter spp a nivel de laboratorio
Inóculo Preinóculo O2 10ml
CO2
100ml 1000ml de biofertilizante
Cepas
90 ml de caldo de cultivo.
90 ml de caldo de cultivo.
reactivadas
Se incuban con agitación
Se incuban con aireación
de 150 rpm a 30 ºC por
aprox. De 1 m3 / h a
24 horas en un matraz de
28ºC por 72 Horas
250 ml.
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6.7 EVALUACIÓN DEL CRECIMIENTO BACTERIANO
Se ha realizan una serie de corridas cinéticas en las que se evalúa la variación de pH, la temperatura del caldo de cultivo y la concentración de biomasa. Además se evalúa el consumo de sustrato en CPM con lo que se puede obtener las variaciones cinéticas de crecimiento. Las muestras se toman casa tres horas durante las 72 horas que dura la fermentación. Este procedimiento se realiza tres veces. 6.7.1. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BIOMASA
Se utiliza la técnica de determinación de biomasa por densidad óptica para el CPM y la determinación del Peso seco para el CA, debido a que por el color de la melaza es imposible de medir la absorbancia. Además se realizan conteos de colonias en caja para determinar las unidades formadores de colonias por litro. Se mide la absorbancia de cada muestra a 540 nm y luego se obtiene la concentración de biomasa en gramos por litro utilizando la curva de calibración de absorbancia en función de peso seco para Azotobacter. Se utiliza medio estéril como blanco. Para el conteo de bacterias en caja se realizan diluciones de 10-1 a 10-9 y se siembran en CPM sólido. Cada dilución se realiza por duplicado. 6.7.2. EVALUAR DEL CONSUMO DE GLUCOSA
Para determinar el uso de glucosa se utilizo la técnica de DNS que se basa en el uso de 3,5 – dinitrosalicilico para provocar la oxidación de los azucares y, al mismo tiempo, se propia reducción, desarrollándose la siguiente reacción:
Según lo anterior, una mole de azúcar reacciona con una mol de acido dinitrosalicilico, dando lugar a una relación estequiométrica que permite conocer cantidad de azucares reductores presentes en la muestra. Esta reacción además puede ser leída fácilmente al espectrofotómetro ya que da lugar a una reacción colometricas el acido 3,5 – dinitrosalicilico de color amarillo cambia al acido 3 – amino, 5 – nitro salicílico de un color pardo oscuro – marrón, cuya intensidad es proporcional a la cantidad de azucares reductores PROCEDIMIENTO
Se centrifuga cada muestra por 10 min a 5000rpm. Posteriormente se recupera el sobrenadante en tubos limpios. Se preparan tubos de ensayos forrados con aluminio para proteger de la luz y se coloca 0.25 ml de sobrenadante con 0.25 ml de reactivo 3,5 DNS en cada uno. Además se prepara un blanco al que se le coloca únicamente el reactivo. Se 13
llevaron los tubos a ebullición por 5 minutos y posteriormente se frena la reacción con hielo. Finalmente se agregan 2.25ml de agua destilada en cada tubo y se lee la absorbancia a 546 nm ajustando a cero con el blanco. El blanco se coloca 2.75 ml de agua para completar el volumen. Se utiliza la curva de calibración de absorbancia en función de glucosa para obtener concentración residual de sustrato en gramos por litro. 6.7.3 EVALUACIÓN DE LA VARIACIÓN DE pH
De cada muestra tomada se mide el pH para determinar la variación del mismo durante la fermentación, para ello se utilizo un pH metro previamente calibrado. 6.7.4 EVALUACIÓN DE LA TEMPERATURA DEL CALDO DE CULTIVO
La temperatura del caldo de cultivo se mide durante todo el proceso de producción del biofertilizante utilizando para ello un termómetro acoplado al equipo de fermentación. 6.8. VIABILIDAD DEL PRODUCTO EN CONDICIONES DE LABORATORIO
Para determinar la viabilidad del producto se almaceno el producto terminado en envases plásticos cerrados y se los coloca en refrigeración (4ºC) bajo condiciones higiénicas para evitar la contaminación Cada semana se evalúa el estado del producto mediante observación directa al microscopio. Se evalúa la población microbiana, la actividad y la contaminación por un periodo establecido de tiempo. Además se deben realizar conteos de colonias en caja con el medio Ashby como medio de cultivo selectivo, 6.9. TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS 6.9.1. TINCIÓN GRAM
- Se preparan frotis del cultivo. Se secan al aire y se fijan al calor. - Se cubre el frotis con el reactivo cristal violeta durante un minuto. - Se lava el frotis con agua durante 5 segundos, y luego se aplica el reactivo yodo de Lugol durante un minuto. - Se lava y se aplica el decolorante. - Se lava y se cubre con el reactivo de Safranina durante 30 segundos. - Se lava, se seca y se coloca en el microscopio.
6.9.2. PRUEBA DE QUISTE
- Se coloca un asas del cultivo en un portaobjetos, emulsionado con agua esteril - Se agrega una o dos gotas de Yodo Lugol y se fija al aire. - Se coloca al microscopio con aceite de inmersión. 14
6.9.3. PESO SECO CELULAR (PCS g/ml)
- Se toma 5 ml de cada dilución y de elimina en el horno el sobrenadante. - Se pesa la biomasa seca y se obtiene el PCS en gr/ml. 6.10. ANÁLISIS DE DATOS
Para analizar los datos obtenidos se utilizan regresiones lineales con el objetivo de determinar la tendencia del crecimiento bacteriano en ambos medios de cultivo.
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7. BIBLIOGRAFIA
http://images.google.com.ec/imgres?imgurl=http://www.ilustrados.com/publicacione s/multimedia/prueba82.gif&imgrefurl=http://www.ilustrados.com/publicaciones/EpZ ZEulkpZIRIfNgKg.php&usg=__Iv35frRIt9Uo _xtbyUixpQoDaE=&h=260&w=297&sz=5&hl=es&start=11&sig2=uynkQHRvUq7ml 4qdFlljg&um=1&tbnid=lehf8BEf_ZInlM:&tbnh=102&tbnw=116&prev=/images%3Fq% 3Dbiofertilizante%2Bcon%2Bazotobacter%26hl%3Des%26rlz%3D1W1ADBF_es% 26sa%3DX%26um%3D1&ei=ggcIS7nDMISVtgfnnqiXCA http://journalmex.wordpress.com/2009/03/02/biofertilizante-para-aumentar-laproduccion-de-plantas-agricolas/ http://www.controlbiologico.com/mejorador_suelo.htm http://nostoc.usal.es/sefin/MI/tema12MI.html http://www.google.com.ec/search?hl=es&rlz=1R2ADBF_es&q=bacterias+fijadoras+ de+nitrogeno&meta=&aq=0&oq=bacterias+fijadoras + http://es.wikipedia.org/wiki/Stevia
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ANEXOS 1. Diagrama de flujo del proceso de producción del biofertilizante
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2.
3. Ciclo del nitrógeno
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