Rodriguez LEC, et al • Factores de virulencia en cepas de
Aenomonas
spp...
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Factores de virulencia en cepas de Aeromonas spp aisladas de pacientes con bacteriemia Virulence factors in strains of Aeromonas sp isolated of patients with bacteremia Luis Enrique Cabrera Rodríguez1 Laura Bravo Fariñas2 Maria Margarita Ramírez2 Alina Llop Hernández2 Anabel Fernández Abreu2 Luis Morier2 Graciela Borrego3 1
Laboratorio de Microbiología Clínica. Centro Municipal de Higiene y Epidemiología de Güi nes, Ciudad de la Habana, Cuba. 2 Laboratorio Nacional de Referencia de En fermedades Diarreicas Agudas. Instituto de Medicina Tropical Tropical “Pedro Kourí”, Ciudad de la Habana, Cuba. 3 Holguín. Laboratorio de Microbiología Clínica. Centro Provincial de Higiene y Epidemiología de Holguín, Ciudad de la Habana, Cuba.
Rev Panam Inectol 2007;9(4):19-23 Conicto de intereses: ninguno
Recibido en 20/4/2007. Aceptado para publicación en 26/6/2007.
Resumen Los microorganismos incluidos dentro del género Aeromonas se aíslan cada vez más recuentemente en inecciones extraintestinales. En el período comprendido de enero del 2005 hasta diciembre del 2006, se estudiaron en el Laboratorio Nacional de Reerencia de Enermedades Diarreicas Agudas del Instituto de Medicina Tropical Tropical “Pedro Kourí” 44 cepas pertenecientes al género Aeromonas , aisladas de muestras de sangre, procedentes de 5 Centros Provinciales de Higiene, Epidemiología y Microbiología del país. En la totalidad de las cepas se realizó la identifcación en especies y la determinación de la presencia de algunos actores de virulencia como: la producción de enzimas extracelulares (DNasa, gelatinasa, elastasa, lecitinasa y hemolisina), citotoxicidad en células Vero y presencia de fmbrias. Se identifcaron 5 especies, resultando Aeromonas jandaei la especie aislada con mayor recuencia. recuen cia. Todas Todas las cepas presentaron al menos meno s un actor de virulencia de los investigados. , actores de virulencia. Palabras clave: Bacteriemia, Aeromonas Abstract The microorganisms pertaining genus Aeromonas isolated more and more requently in the extraintestinal inection. In the period at rom January 2005 to December 2006, have been studied in the National Reerence Laboratory or Acute Diarrhoeal Diseases o the “Pedro Kourí” Tropical Medicine Institute 44 strains pertaining to the genus Aeromonas isolated o samples o blood sent by 5 provincial microbiology laboratories o the country. country. In the total strains was made the identifcation in species and the determination o the presence o some virulence actors like the extracelular production o enzyme (lecithinase, gelatinase, Dnase, elastase and hemolisin) citotoxity in Vero cells and fmbria presence. Five species have been identiy, Aeromonas jandaei was the specie most requently ound. Every strains showed at least one o the virulence actor o the ones that were investigated. Key words: Aeromonas, virulence actors, bacteremia. Introducción Los microorganismos miembros del género Aeromonas son ba19
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cilos Gram negativos, anaerobios acultativos, oxidasa positiva, pertenecientes a la amilia Aeromonadaceae. (1) Los mismos tienen una distribución mundial y se han aislado e identifcado en humanos, animales, agua y alimentos.(2) La diarrea es la aección clínica que con mayor recuencia producen las especies del género Aero . En individuos sanos o con actores predismonas ponentes como Diabetes Mellitus, Inmunodepresión, Neoplasias, entre otros, estos microorganismos pueden pasar al torrente sanguíneo, produciendo bacteriemias y procesos inecciosos en dierentes órganos y sistemas, por ejemplo: meningoencealitis, neumonía, inecciones hepato-biliares, las que en ocasiones pueden comprometer la vida al paciente.(3,4) Estas inecciones se pueden adquirir en la comunidad o en el ambiente hospitalario, a través de la ingestión de alimentos, agua, contacto con suelo y por el uso de dispositivos intravenosos. (5) Se han descrito numerosos actores de virulencia asociados a la enteropatogenicidad en las especies del género Aeromonas, entre los que se pueden mencionar: la producción de enzimas extracelulares (DNasa, gelatinasa, proteasas, hemolisinas), citotoxinas, enterotoxinas, hemaglutininas, entre otros, haciendo más complejo el cuadro clínico al paciente.(5,6) A pesar de los adelantos en el control de las enermedades inecciosas, las inecciones extraintestinales y nosocomiales por los microorganismos antes mencionados son cada día más recuentes y constituyen una amenaza grave para la salud de la población mundial. (3,7,8) Por la antes expuesto se decidió realizar la identifcación en especies y determinar la presencia de algunos actores de virulencia en 44 cepas de Aeromonas aisladas de pacientes con bacteriemias en dierentes centros de salud del país. Materiales y métodos En el período comprendido de enero del 2005 hasta diciembre del 2006 se estudiaron en el Laboratorio Nacional de Reerencia de Enermedades Diarreicas Agudas del Instituto de Medicina Tropical “Pedro Kourí” (IPK) 44 cepas de Aeromonas spp aisladas de muestras de sangre, procedentes de 5 laboratorios de Microbiología clínica de los Centros Provinciales de Higiene y Epidemiología del país que incluyeron Pinar del Río, Ciudad de la Habana, Camagüey, Holguín y Santiago de Cuba. Estos microorganismos ueron aislados e identifcados como patógenos únicos de hemocultivos. Las 44 cepas mantenidas en medio de con20
servación de Pasteur ueron inoculadas en Caldo Cerebro-Corazón, e incubadas a 37°C durante 18 a 24 horas en condiciones de aerobiosis. Para la conirmación de género las cepas ueron sembradas en placas de Agar Mac Conkey y en Agar Triptona – Soya suplementado con sangre de carnero al 5%, e incubadas en las mismas condiciones de temperatura, aireación y tiempo antes mencionadas, al cabo del cual se seleccionaron al menos 3 colonias por placas, las cuales ueron inoculadas en los medios de dierenciación primaria Agar Hierro y dos azúcares de Kligler (AHK) y Agar Hierro Lisina (AHL). Se escogieron aquellas colonias que después del crecimiento durante 18 a 24 horas las cepas presentaron codiicación genética para la enzima citocromo oxidasa. A las cuales se les realizó el estudio isiológico correspondiente para ubicarlas en el género Aeromonas .(1) Para la identifcación en especies se aplicaron los esquemas Aerokey ll (9) (hidrólisis de esculina, producción de indol y ermentación de la sacarosa) y el Aerosquema (10) (ermentación de la arabinosa, producción de gas de glucosa y resistencia a la cealotina). A las cepas en estudio se le determinaron los siguientes actores de virulencia: la producción de enzimas extracelulares (DNasa, gelatinasa, elastasa, lecitinasa y hemolisina), citotoxicidad en células Vero y presencia de fmbrias. La actividad DNasa ue investigada según Blazevic. (11) Un halo rozado alrededor de las colonias en Agar DNasa con 0.01% de azul de toluidina indico actividad de nucleasa. La enzima elastasa se determinó por la metodología establecida por Scharmann.(12) Se inoculó por punteo en la superfcie del medio Agar elastina, incubándose hasta 7 días a 37 0C. Un halo transparente alrededor de la colonia indico la presencia de la enzima elastasa. (12) El estudio de la enzima gelatinasa se realizó por la técnica de Blazevic. (11) Se inoculo por punteo en la superfcie del medio Agar gelatina, incubandose 24 horas a 370C. Una opacidad alrededor de la colonia indico producción de la enzima gelatinasa. La presencia de la enzima lecitinasa se determino por el protocolo recomendado por Blazevic. (11) Se inoculó por punteo en la superfcie del medio Agar lecitina, incubandose 48 horas a 37 0C. Un halo transparente alrededor de la colonia indico la presencia de la enzima. Para la actividad hemolítica (ß hemolisina), se siguió la técnica descrita por Robinsón. (13) Se tomo una asada y se inoculó en estría por agotamiento en Agar Triptona – Soya suplementada con sangre de
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carnero al 5%, incubándose 24 horas a 370C. Un halo transparente alrededor de la colonia indico la presencia de la enzima beta hemolisina. Para la actividad citotóxica, se utilizó la línea celular Vero ATCC-CCL 81, procedentes del Laboratorio de Cultivo de Células del IPK. Se realizó por la técnica propuesta por Ljungh.(14) La observación de redondeamiento, vacuolización y degeneración de igual o más del 50% de las células indicó citotoxicidad. Para realizar la determinación de la presencia de fmbrias se procedió según el método de Nishikawa.(15) Se preparo una suspensión bacteriana y una de glóbulos rojos humanos grupo O al 3% de varios donantes. Se mezclo 20µl de ambas en una lámina portaobjeto. Se agitó durante 5 minutos. Como resultado positivo se observa aglutinación de los glóbulos rojos.
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Discusión
Resultados De las 44 cepas en estudio, en 35 (79.5%) se identiicaron 5 especies, Aeromonas jandaei 12 (27.2%), Aeromonas veronii bv sobria 8 (18.1%), Aeromonas trota 6 (13.6%), Aeromonas caviae 5 (11.3%), Aeromonas hydrophila 4 (9.0%), 9 (20.3%) no pudieron ser identiicadas en especies por lo que se clasiicaron como Aeromonas spp. En la tabla 1 se observa el resultado de la presencia de los actores de virulencia de las cepas de estudiadas. Todas las cepas presentaron Aeromonas al menos un actor de virulencia de los investigados. La enzima lecitinasa estuvo presente en 39 cepas (88.6%), seguido de la enzima gelatinasa en 37 cepas (84.0%). Aeromonas hydrophila y ueron las especies que presenAeromonas jandaei taron mayor positividad a los actores de virulencia estudiados.
Los microorganismos incluidos dentro del género se aíslan cada vez más recuentemente Aeromonas en inecciones extraintestinales. Esto se debe, en gran medida, a una mayor supervivencia de los pacientes con enermedades graves y al reconocimiento de estos agentes como patógenos humanos. (3,6,7) Desde 1987 han sido reconocidas Aeromonas , Aeromonas schubertii , Aeromonas jandaei , veronii , Aeromonas , Aero Aeromonas trota allosaccharophila y Aeromonas bestiarum como causa monas encheleia de inecciones intestinales y extraintestinales.(16,17) En la actualidad se reconocen cuatro especies del genero Aeromonas como causa de septicemia: Aeromonas , Aeromonas ambos biotipos) , Ae hydrophila veronii ( (18,19,20) , y Aeromonas . Aunque romonas caviae jandaei cuando se revisa la literatura médica Aeromonas hydro es la especie que con mayor recuencia es aislada phila de hemocultivos.(20,22) Los resultados en relación a la identifcación en especie de la presente investigación son similares a los obtenidos en los estudios antes mencionados. En América Latina y el Caribe son escasos los estudios sobre actores de virulencia (producción de enzimas extracelulares, citotoxicidad en células Vero y presencia de fmbrias) realizados en los microorganismos pertenecientes al género Aeromonas aislados (23) de muestras de sangre. En relación a la producción de las enzimas extracelulares, las cepas de Aeromonas hydrophila del presente estudio evidenciaron la producción de la enzima ß hemolisina y DNasa. Nuestros datos son semejantes a los obtenidos en un estudio relacionado con los posibles actores de virulencia implicados en la patogenicidad de cepas de Aeromonas hydrophila aisladas de bacteriemias realizado en Malasia, quienes encontraron la enzima DNasa en las 18 cepas estudia-
Tabla 1. Presencia de los actores de virulencia estudiados en las cepas de Aeromonas Producción de enzimas extracelulares Especies
No DNasa
Elastasa
Gelatinasa Lecitinasa
Beta hemolisina
Citotoxicidad Presencia en células Vero de fmbrias
Aeromonas hydrophila
4
4
4
3
3
4
4
1
Aeromonas caviae
5
5
-
4
5
5
-
5
Aeromonas trota
6
6
-
6
6
-
-
5
Aeromonas veronii bv sobria
8
-
-
8
8
8
8
4
sp Aeromonas
9
6
4
8
7
1
5
3
Aeromonas jandaei
12
4
-
8
10
12
12
10
Total %
44 100
25 56.8
8 18.1
37 84.0
39 88.6
30 68.1
29 65.9
28 63.6
Fuente: Protocolo de trabajo. IPK. 2002-2003.
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das y con los de una investigación realizada en España en el año 2003, sobre determinación y expresión de genes de virulencia, que incluyo las siguientes especie: , Aeromonas caviae , y Aeromonas Aeromonas hydrophila donde los autores demostraron la presencia jandaei de estas enzimas en la totalidad de las cepas antes citadas aisladas de muestras clínicas. (21,24) En las cepas de Aeromonas veronii bv sobria, se observó la presencia de la enzima beta hemolisina y gelatinasa. Resultado que coincide con el publicado por Mayoral, quien demostró la presencia de estas enzimas, en la misma especie aislada de un paciente con celulitis con gran secreción de pus, y diseminación al torrente sanguíneo.(4) Varios autores han propuesto la existencia de complejos mecanismos de patogenicidad en el género , que pueden ser usados como marcadores Aeromonas de virulencia, entre los que se pueden mencionar: osolipasas, proteasas, hemolisina, enterotoxina y citotoxina avoreciendo la invasividad, la actividad citolítica y la adherencia.(25,27) Las cepas de Aeromonas hydrophila de la presente investigación presentaron signos de citotoxicidad. Resultado que esta acorde con el obtenido por Vadivelu J y cols., 1995, los cuales encontraron la presencia de este marcador de virulencia en la cepas que ueron objetos de estudio, además Bauab TM y cols., 2003, de las 39 cepas de Aeromonas hydrophila aislada de muestras extraintestinales el (43.6%) de las cepas presentaron citotoxicidad en la línea celular Vero. (16,21) En un estudio realizado por Wilcox relacionado con la presencia de citotoxinas en células Vero por encontró que esta especie no resultó Aeromonas caviae (25) citotoxica. Resultado similar ue obtenido en este trabajo. Sin embargo en una investigación realizada por Krzyminska en Polonia relacionada con la actividad enteropatogénica de Aeromonas caviae aisladas en muestras de diarreas encontró que la mayoría de las cepas ueron citotoxicas en células Vero. (26) Resultado que discrepa con el nuestro. La adherencia bacteriana a las células del huésped susceptible representa un paso importante para la colonización tisular y es mediada por moléculas llamadas adhesinas. Numerosas investigaciones sugieren que la adhesión es probablemente mediada por una variedad de pilis u otros actores de colonización los cuales pueden estar o no relacionados con la hemaglutinación.(27,28) Analizando la presencia de fmbrias a través de la técnica de hemaglutinación, se observa baja positividad en las cepas de Aeromonas hydrophila a este actor, coincidiendo con los resultados de un estudio relacionado sobre patrones de adherencia realizado en la República de Eslovaquia, donde los autores no 22
encontraron la presencia de fmbrias en las cepas de Aeromonas hydrophila estudiadas. Sin embargo en un investigación sobre prevalencia y propiedades de virulencia en cepas de Aeromonas llevada a cabo en Brazil, los autores encontraron la presencia de fmbrias en todas las cepas de Aeromonas hydrophila aisladas (27,28) de muestras intestinales y extraintestinales. La identifcación en especies del género Aero , así como sus atributos de patogenicidad monas demostrados en los aislamientos que ormaron parte de este estudio, pusieron en evidencia la circulación en Cuba de este microorganismo aislado de pacientes con bacteriemias. Referencias 1. Garrity GM, Bell JA, Lilburm TG. Taxonomic outline o the prokaryotes. En: Bergey’s Manual o Systematic Bacteriology. 2nd ed. Release 4.0;Oct 2003. [Citado el 10 de ebrero del 2004]. Disponible en: URL:http:// dx.doi.org/10.1007/bergeysoutline200310 2. Sharon LA, Wendy K, Cheung W, Janda JM. The Genus : biochemical characteristics, atypical reacAeromonas tions, and phenotypic identifcation schemes. J Clin Microbiol. 2003;79(6):2348-57. 3. Clark NM, Chenoweth CE. Aeromonas inection o the hepatobiliary system: Report o 15 cases and review o the literature. Clin Inect Dis. 2003;37:506-13. 4. Mayora l C, Gómez M, Schmeling MF, Peirano S. Celulitis y bacteriemia por Aeromonas veronii biovar sobria, presentación de un caso. Inect Microbiol Clin. 2000;12(2):71-3. 5. Soler L, Figueras MJ, Chacón MR, Vila J, Marco F, Martínez–Murcia A J et al. Potential virulence and antimicrobial susceptibility o Aeromonas popof recovered rom reshwater and seawater. FEMS Immunol Med Microbiol. 2002;32(3):243-7. 6. Sechi LA, Deriu A, Falchi MP, Fadda G, Zanetti S. Distribution o virulence genes in Aeromonas spp. Isolated rom Sardinian waters and rom patients with diarrhoea. J Appl Microbiol. 2002;92(2):221-7 7. Bravo Fariñas L, Morier L, Castañeda N, Ramírez M, Silva M, Castro- Escarpulli G. Aeromonas : an emerging pathogen associated with extraintestinal inection in Cuba. Rev Cubana Med Trop. 2003;55(3):208-9. 8. Castro-Escarpulli G, Aguilera Arreola GM, Giono Cerezo S, Hernández-Rodríguez C, Rodríguez Chacon M, Soler Falgás L. El género Aeromonas: ¿Un patógeno importante en México? En Inecc Microbiol. 2002;22(4):206-16. 9. .Carnahan A, Behran S, Joseph S. Aerokey ll: a exible key or identiying clinical Aeromonas species. J Clin Microbiol. 1991;29:2843-9. 10. Furuwatari CH, Kawakami Y, Akahame T, Hidaka E, Okimura Y, Nakayama J et al. Proposal or an Aeroscheme (modifed Aerokey ll) or the identifcation o clinical species. Med Sci Res. 1994;22:617-9. Aeromonas 11. Blazevic DJ, Ederer GM. Principles o biochemical test in diagnostic microbiology. New York, J. Wiley. 1975.
Rodriguez LEC, et al • Factores de virulencia en cepas de
12. Scharmann W. Elastase in Pseudomonas and Aeromonas Zentralbl Bakteriol 1972;220(1):435-42. 13. Robinson J. Comparison o direct plating with the use o enrichment culture o isolating o Aeromonas spp rom aeces. J Med Microbiol. 1986;22:315-7. 14. Ljung A, Eneroth P, Wadstrom T. Cytotonic enterotoxin hydrophila rom Aeromonas . Toxin 1982;20:787-94. 15. Nishikawa Y, Kimiura T, Kishi T. Mannose-resistant adhesion o motile Aeromonas to INT 407 cells and the dierences among isolates rom humans ood and water. Epidemiol Inect. 1991;107:171-9. 16. Hickman-Brenner FW, MacDonald KL, Steigerwalt AG, Fanning GR, Brenner DJ, Farmer JJ III. Aeromo , a new ornithine decarboxylase-positive nas veronii species that may cause diarrhea. J Med Microbiol. 1987;25:900-6. 17. Carnahan AM, Chakraborty T, Fanning, GR. Aeromo nas trota sp. nov., an ampicillin-susceptible species isolated rom clinical specimens. J Med Microbiol. 1991;29:1206-10. 18. Janda JM, Guthertz LS, Kokka RP, Shimada T. Aeromo nas species in septicemia: laboratory characteristics and clinical observations. Clin Inect Dis. 1994;19:77-83. 19. Duthie R, Ling TW, Cheng, AFB, French GL. Aeromonas septicaemia in Hong Kong: species distribution and associated diseases. J Inect. 1995;30:241-4. 20. Cigni A, Tomasi PA, Pais A, Cossellu S, Faedda R, Satta AE. Fatal Aeromonas hydrophila septicemia in a 16-yearold patient with thalassemia. J Pediatr Hematol Oncol. 2003;25(8):674-5. 21. Vadivelu J, Puthucheary SD, Phipps M, Chee YW. Possible virulence actors involved in bacteraemia caused by Aeromonas hydrophila . J Med Microbiol. 1995;42(3):171-4. 22. Pérez Peña S, Tamayo Curro E, Díaz García ME, Pérez Rodríguez JM. Primer reporte en Cuba de aislamiento de Aeromonas en muestras extraintestinales. Rev Cubana Med Milit. 1997;26(1):50-4.
Aenomonas
spp...
23. Bauab TM, Levy CE, Rodríguez J, Pasetto Falcao D. Niche-specifc association o Aeromonas ribotypes rom human and environmental origen. Microbiol Immunol. 2003;47(1):7-16. 24. Chacon MR, Figueras MJ, Castro-Escarpulli G, Soler L, Guarro J. Distribution o virulence genes in clinical and environmental isolates o Aeromonas spp. Antonie Van Leeuwenhoek 2003;84(4):269-78. 25. Wilcox MH, Cook A, Geary I, Eley A. Toxin production, adherence and protein expression by clinical Aeromonas spp. Isolates in broth and human pooled ileostomy uid. Epidemiol Inect. 1994;113(2):235-45. 26. Krzyminska S, Kaznowski A, Lindner K, Mnichowska M. Enteropathogenic activity and invasion o Hep-2 cells by Aeromonas caviae clinicl isolates. Acta Microbiol Pol. 2003;52(3):277-83 27. Bartkova G, Ciznar I. Adherence pattern o non-pilated Aeromonas hydrophila strains to tissue cultures. Microbios 1994;77(310):47-55. 28. Gibotti A, Saridakis HO, Pelayo JS, Tagliari KC, Paseto Falcão D. Prevalence and virulence properties o Vibrio cholerae non-01, Aeromonas spp. and Plesiomonas shi isolated rom Cambé Stream (State o Paraná, gelloides Brazil). J Appl Microbiol. 2000;89:70-5.
Correspondencia: Dra. Laura Bravo Fariñas
Instituto de Medicina Tropical Pedro Kourí. Autopista Novia del Mediodía km 6. La Lisa. Ciudad de La Habana, Cuba. email:
[email protected]
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