Primer Pada Pcr Elisabeth 130631035

Rekayasa Genetika Elisabeth 1306371035

CARA MEMBUAT PRIMER Primer Primer yaitu yaitu suatu suatu polimer polimer asam asam nukleat nukleat pendek pendek (oligonukleotida) oligonukleotida ) yang mempunyai urutan nukleotida yang komplementer dengan urutan nukleotida !" templat# d!$Ps (Deoxyn (Deoxynucleotid ucleotide e triphosphates triphosphates)# )# bu%%er P&R# dan en'im !" polimerase (Reee 00*+ 153), Primer ber%ungsi sebagai pembatas %ragmen !" target yang akan diampli%ikasi dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-./) pada uung 3 yang diperlukan untuk proses eksistensi !", Pemilihan primer  yang tidak sesuai dapat menyebabkan tidak teradinya reaksi polimerasi antara gen target target dengan dengan primer, primer, $erdapat rdapat dua dua enis enis primer primer dalam dalam suatu suatu reaksi reaksi P&R P&R yait yaitu u prim primer er reverse dan reverse  dan forward ya forward  yang ng beke bekera ra pada pada dua dua untai untai berbe berbeda da (sense dan sense  dan antisense) antisense ) dalam satu !" (!iholl 00+ 11),

2angkah umum membuat primer+ 1, engetahui engetahui untai untai !" !" yang akan kita ampli%ikas ampli%ikasi, i, , embuat embuat dua enis enis primer# primer# yaitu primer primer %or4ard %or4ard dan reerse, 3, enentuk enentukan an primer berdasark berdasarkan an syarat-sy syarat-syarat arat membuat membuat primer yang ideal (dibahas diba4ah), embuat desain primer menggunakan aplikasi# sbb,

Primer merupakan komponen P&R yang sangat menentukan akurasi sekuen !" yang yang ingin ingin diampl diampli%ik i%ikasi asi,, rutan rutan nukleo nukleotid tida a primer primer akan akan menad menadii penent penentu u pada pada bag bagian ian man mana prime rimerr aka akan men menempe mpel (an (annea neal) pada pada geno enom, ika ika urut urutan an nukleotidanya tidak sesuai dengan kode gen yang kita inginkan# dapat dipastikan produk P&R yang dihasilkan akan keliru, .leh sebab itu# sebelum melangkah pada tahap ampli%ikasi dengan P&R# primer yang akan digunakan harus dipastikan dahulu spesi%itasnya, &aranya ialah dengan membuat desain primer,

Primer yang digunakan dalam ampli%ikasi umumnya terdiri dari dua enis# yakni %or4ard dan reerse, 8or4ard primer bergerak dengan arah 59 :; 39 untai !" template, ?.E?$# GE!"?&< E@PRE<?.E?$, 3, emilih en'im restriksi yang akan digunakan untuk insersi gen dengan mempelaari peta sirkuler dan situs pemotongan pE$-1b, Restriksi yang sesuai dengan pE$-1 ialah Nde?# Nhe?# Bam/?# EcoR?# Sac ?# Sal ?# Hind ???#Not ?# ho?# Eag ?# !va?# *, enentukan posisi forward primer  dan reverse primer dengan Genamis EApresion, Posisi primer diupayakan berdekatan dengan start dan stop kodon serta mengarah ke situs pemotongan en'im restriksi, Keterangan: ata sumber gen selulase diperoleh B"subtilis str, 2G

5, ika situs pemotongan en'im restriksi di dekat start dan stop kodon sulit disesuaikan dengan posisi primer# dapat dilakukan mutasi situs pemotongan pada -3 nukleotida, utasi -3 nukleotida pada sekuen gen selulase tidak akan mengurangi daya lekat primer terhadap untai !" asalkan presentase Guanin (G) dan
6, engeek desain primer dengan Primer &alulator (pada Genamis EApression) dan atau dengan .ligoalulator, ontoh tampilan+

/asil oligo shelf complimentary  untuk reerse primer 

7, engeek desain primer dengan 8ast P&R untuk mengetahui tingkat spesi%itas primer dan ukuran produk P&Rnya,

SYARAT MEMBUAT PRIMER YANG IDEAL Pertimbangan desain yang penting yang diuraikan di ba4ah ini sebagai kuni untuk ampli%ikasi spesi%ik dengan hasil tinggi, 1, Panang Primer+ /al ini seara umum diterima bah4a panang optimal primer  P&R adalah 1B- mer (basa),  "lso keep in mind that most oligonuleotide synthesis reations are only CBD e%%iient, $his means that eah time a base is added# only CBD o% the oligos 4ill reeie the base, $his is not o%ten ritial 4ith shorter oligos# but as length inreases# so does the probability that a primer 4ill be missing a base,

$his is ery important in mutagenesis or loning reations, Puri%iation by /P2& or P"GE is reommended in some ases,

,

Oligonucleotie lengt!

Percent #e$uence

"it!

10 bases

(0,CB)10 F B1,7D

0 bases

(0,CB)0 F 66,7D

30 bases

(0,CB)30 F 5*,6D

*0 bases

(0,CB)*0 F **,6D

correct Primer elting

$emperature+ Primer elting $emperature ($m) merupakan temperatur  yang diperlukan oleh separuh primer dupleks mengalamai disosiasilepas ikatan, Primer dengan $m berkisar antara 5-5B o& sangat ideal# sedangkan $m diatas 65o& akan mengurangi e%ekti%itas aneling sehingga proses ampli%ikasi !" kurang beralan baik, $m ini sangat ditentukan oleh umlah basa G& (G& ontains), $m primer dapat dihitung dengan %ormula+ a, $m ( o&) F ((G&) A*)  (("$) A))HHH,seara kasar (kurang akurat) b, $m( o&) F IJ/ J<  R ln(&)K - 73,15HH,,seara akurat 3, Primer annealing temperature + $he primer annealing temperature ($a) merupakan suhu yang diperkirakan primer dapat berikatan dengan template (!") dengan stabil (!"-!" hybrid stability), ika suhu aneling tinggi akan menyulitkan teradinya iktan primer dengan !" template sehingga akan menghasilkan produk P&R yang rendah (kurang e%isien), !amun ika $a terlalu rendah akan menyebabkan terasinya penempelan primer pada !" template yang tidak spesi%ik, $a dapat dihitung dengan menggunakan %ormula di ba4ah ini+ $a F 0,3 A $m(primer)  0,7 $m (produt) : 1*,C $m(primer) F $m primer  $m(produt) F $m produk P&R *, G& &ontent + umlah >asa G dan & (G& ontent) di dalam primer yang ideal sekitar *0-60D, $he G& ontent o% a primer is the perentage o% nuleotides that are either  a G or & nuleotides, G-& base pairs hae 3 hydrogen bonds rather than  ust  like "-$ base pairs, $hus# in omparing t4o primers 4ith eLual length# the one 4ith the higher G& ontent 4ill hae a higher melting temperature, 5, G& &lamp + umlah basa G dan & yang terdapat pada 5 basa terakhir (3) disebut dengan G& lamp, G& lamp yang baik sekitar 3 basa G& dan tidan melebihi 5 basa G&, keberadaan G& di uung 3 primer sangat membantu teradinya stabilitas iktan antara primer dengan !" template yang diperlukan untuk inisiasi polymerase !" (proses P&R), eletakkan

 

3 atau lebih&s atau Gs pada uung 3 primer akan memiu mispriming, /al ini harus dihindari, 6, Primer 2"<$-!&>?, 10,"mplion 2ength + Panang P&R produk yang ideal berkisar antara 100500 basang basa, 11, .ptimum "nnealing temperature ($a .pt)+
MENG%ITUNG MELTING POINT SUATU PRIMER $he melting temperature o% a primer# abbreiate $ m is de%ined as the temperature at 4hih 50D o% that same !" moleule speies %orm a stable double heliA and the other 50D hae been separated to single strand moleules, $he melting temperature depends on both primer length and seLuene, " good rule o% thumb %or alulating melting temperatures is *N&O( G& nuleotides)  N&O( "$ nuleotides), Q$his is the rule used to alulate melting temperature in the primer atalog tables, /o4eer# to more aurately alulate melting temperature# you an also use one o%  seeral online tools, 8or P&R and seLuening appliations# primers should hae a

melting temperature o% 55-65N&# 4hih generally orresponds to a primer 0-5 nuleotides in length 4ith about *0D G& ontent, $he melting temperature an also be kno4n as the annealing temperature in re%erene to the temperature at 4hih primers start to bind template !" during P&R,

$he main %ators a%%eting $m are salt onentration# strand onentration# and the presene o% denaturants (suh as %ormamide or <.), .ther e%%ets suh as seLuene# length# and hybridi'ation onditions an be important as 4ell, E$uation# $he simplest eLuation %or $d is the allae rule&+ (1) $d F N&("$)  *N&(G&) $d is a %ilter-based alulation 4here "# G# &# and $ are the number o% ourrenes o%  eah nuleotide, $his eLuation 4as deeloped %or short !" oligos o% 1*-0 base pairs hybridi'ing to membrane bound !" targets in 0,C !a&l, $he melting temperature %or the seLuene $G&$&" is# (1)  *(1) F 1BN&, $he nature o% the immobili'ed target strand proides a net derease in the $ m obsered 4hen both target and probe are %ree in solution, $he magnitude o% the derease is approAimately 7-BN&,  "nother %amiliar eLuation' %or !" 4hih is alid %or oligos longer than 50 nuleotides %rom p/ 5 to C is+ () $m F B1,5  16,6 log   *1(@G@&) - 5002 - 0,68 here  is the molar onentration o% monoalent ations# @G and @& are the mole %rations o% G and & in the oligo# 2 is the length o% the shortest strand in the dupleA# and 8 is the molar onentration o% %ormamide, $his is a %ar more use%ul eLuation to most researhers# as it inludes adustments %or  salt (although the eLuation is S 4hen F0) and %ormamide # the t4o most ommon agents %or hanging hybridi'ation temperatures, $hus# at  F 0,C# and 8 F 0# $m F B1,516,6(log(0,C))*1(,17,33)-50060,6(0)F17,CN &,
T!eoretical
here J/ (=almol) is the sum o% the nearest neighbor enthalpy hanges %or  hybrids# " is a small# but important onstant ontaining orretions %or heliA initiation#  J< (eu) is the sum o% the nearest neighbor entropy hanges# R is the Gas &onstant (1,CB7 al deg-1 mol-1) and &t is the total molar onentration o% strands, ?% the strand is sel% omplementary# &t * is replaed by &t,  J/ and J< alues %or nearest neighbor interations o% !" and R!" are sho4n in $able 1, Please note that this eLuation inludes a %ator to adust %or salt onentration, 8or eAample# our sample seLuene 4ould result in the %ollo4ing eApression assuming 00 n strand onentration at C00 m !a&l+   1000O(-5,B-11,1-7,B-5,6-5,B) ---------------------------------------------------------- 73,15  16,6log(0,C)   Q(-10,B)(-1,C-6,7-0,B-13,5-1,C)(1,CB7)lnQ(,0E-7)*TT $here%ore+ $m F 1,75N& !otie the onsiderable di%%erene bet4een the results o% eLuations (1) and (3) in this ase, $his sho4s ho4 muh o% an e%%et seLuene an hae on the $m, Co*+ari#on#
8or instane# in situ hybridi'ations proide su%%iiently di%%erent enironments %rom ase to ase that anomalous results may our, &ounter ion identity# solation e%%ets# onugated groups (biotin# digoAigenin# alkaline phosphatase# %luoresent dyes# et,)# and impurities may also a%%et the $ m, ?n these ases# theoretial eLuations are inaurate# but still proide a use%ul estimate to begin deelopment, ANOT%ER BASIC MELTING TEMPERATURE ,TM- CALCULATIONS $he t4o standard approAimation alulations are used, 8or seLuenes less than 1* nuleotides the %ormula is Tm= (wA+xT) * 2 + (yG+zC) * 4 8or seLuenes longer than 13 nuleotides# the eLuation used is Tm= 64.9 +41*(yG+zC-16.4)/(wA+xT+yG+zC) ASSUMPTIONS: Both eLuations assume that the annealing ours under the standard onditions o%  50 n primer# 50 m !a# and p/ 7,0, Salt A.u#te Melting Te*+erature ,T*- Calculation#  " ariation on t4o standard approAimation alulations are used, 8or seLuenes less than 1* nuleotides the same %ormula as the basi alulation is use# 4ith a salt onentration adustment Tm= (wA+xT)*2 + (yG+zC)*4 - 16.6*log 10 (0.050) + 16.6*log 10 ([Na+ ) 4here 4#A#y#' are the number o% the bases "#$#G#& in the seLuene# respetiely,

$he term 16.6*log 10 ([Na+ ) adusts the $m %or hanges in the salt onentration# and the term log 10 (0.050) adusts %or the salt adustment at 50 m !a, .ther  monoalent and dialent salts 4ill hae an e%%et on the $m o% the oligonuleotide# but sodium ions are muh more e%%etie at %orming salt bridges bet4een !" strands and there%ore hae the greatest e%%et in stabili'ing double-stranded !"# although trae amounts o% dialent ations hae signi%iant and o%ten oerlooked a%%ets 8or seLuenes longer than 13 nuleotides# the eLuation used is Tm= 100.5 + (41 * (yG+zC)/(wA+xT+yG+zC)) - (!20/(wA+xT+yG+zC)) + 16.6*log 10 ([Na+ ) $his eLuation is aurate %or seLuenes in the 1B-5mer ra .ligo&al uses the aboe eLuation %or all seLuenes longer than 13 nuleotides,

$he %ollo4ing eLuation is proided only   %or your re%erene, ?t is not atually used by .ligo&al, ?t is reportedly more aurate %or longer seLuenes, Tm= !1.5 + (41 * (yG+zC)/(wA+xT+yG+zC)) 16.6*log 10 ([Na+ ) - 0.62" 

(500/(wA+xT+yG+zC))

+

$his eLuation is most aurate %or seLuenes longer than 50 nuleotides, ?t is alid %or oligos longer than 50 nuleotides %rom p/ 5 to C,
RE/ERENSI http+siene,leture,ub,a,id%iles010*design-primer,pd%  https+bio4eb,u4laA,eduGeneboleularseLVanalprimerVdesignprimerVdesign ,htm http+oomyete4orld,netprotoolsprimerD0designing,pd%  http+444,sigmaaldrih,omtehnial-doumentsartilesbiologyoligos-meltingtemp,html http+444,entelehon,om00B0Bdna-melting-temperature http+parts,igem,org/elp+PrimersGlossary http+444,premierbioso%t,omtehVnotesP&RVPrimerVesign,html http+444,basi,north4estern,edubiotoolsoligoal,html