PRÁCTICA N° 12. METABOLISMO MICROBIANO INTRODUCCIÓN Las células de los microorganismos, al igual que las de todos los seres vivos, por medio de su metabolismo incorporan y transforman los diversos compuestos obtenidos del medio ambiente, en compuestos requeridos para vivir, para su crecimiento y para su reproducción. En estas transformaciones participan diferentes enzimas que catalizan las reacciones de oxidación, reducción, hidrólisis, transferencia de grupos, isomerización y síntesis, dando lugar a la deg radación de los compuestos incorporados (catabolismo) y a la síntesis de nuevos compuestos (anabolismo). Las exoenzimas son secretadas por la célula y a ctúan fuera de ella sobre el sustrato, disminuyendo el tamaño de las moléculas complejas en el medio ambiente, hasta lograr un tamaño que pueda difundir al interior de la célula, donde dond e servirán de sustrato a las endoenzimas. e ndoenzimas. Asimismo, cada grupo de microorganismos muestra una capacidad enzimática diferente para transformar los compuestos, regida por su constitución genética y por factores ambientales. Pueden poseer una batería reducida de enzimas actuando sobre pocos sustratos o pueden presentar una amplia variedad de sistemas enzimáticos (actuando sobre gran diversidad de sustratos
COMPETENCIAS
Desarrollará y aplicará técnicas técnicas para observar la acción enzimática enzimática bacteriana bacteriana en diferentes sustratos Aplicará los estudios del metabolismo de los microorganismos para su identificación identificación y diferenciación de otras especies. Realizará las las pruebas bioquímicas para la la identificación identificación lograr una correcta identificación de género y especie de cultivos puros.
MATERIALES : Material Biológico
CEPAS BACTERIANAS DE:
eudomo mona nass aeruginos a - Ps eudo erratia Marcesc Marcesc ens - S erratia
- E s cherichia coli coli
Proteus mirabil mirabilis is - Proteus itrobacterr freundii - C itrobacte lebs iella iella pneumoniae - K lebs cillus s ubtilis ubtilis - B acillus oc c us aureus aur eus - S taphyloc occ oc c us epidermi epi dermi dis di s - S taphyloc occ - S almonella entéri c a hi g ella flexner flex neri i - S hig
Material de Laboratorio
Asas bacteriológicas (anillo y en punta) Mechero de alcohol o Bunsen Placas de Petri Incubadora a 37 °C Baño María.
Medios de cultivos diferenciales
Medio O-F. Medio TSI (triple sugar iron). Medio SIM. Medio MIO. Medio Citrato de Simons. Medio LIA (LisinaHierro) Medio Manitol salado. Medio Urea (agar y caldo) Medio MR-VP Medio Gelatina Agar Almidón
Reactivos
Solución de Lugol. Solución de KOH al 40%. Rojo de Metilo Solución de Alfa Naftol Reactivo de Kovacs
PROCEDIMIENTOS. A. METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS 1. Fermentación de carbohidratos (tres azúcares) Medio TSI: tres azúcares (glucosa, sacarosa, lactosa) +Hierro / Indicador: Rojo de fenol. Utilizado para evaluar la utilización de los carbohidratos como fuente de carbono por la vía fermentativa.
Con la aguja Bacteriológica estéril y frente a fuego de mechero, sembrar con la técnica de puntura en el fondo y estría en el plano inclinado del medio TSI cepas de Pseudomonas aeurinosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens, Citrobacter freundii .
Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
Observar e interpretar los resultados obtenidos.
Lectura
N°
Fondo
Centro
Plano inclinado
Resultado
CO2
H2S
Interpretación
1
rojo
rojo
rojo
K/K
-
-
No fermentación
2
amarillo
rojo
rojo
K/A
-
-
3
amarillo
amarillo
rojo
R/A
-
-
4
amarillo
amarillo
amarillo
A/A
+
-
4A
amarillo
amarillo
rojo
K/A
+
-
5
amarillo
amarillo
amarillo
K/K
+
+
Fermentación de glucosa Fermentación de glucosa y sacarosa Con producción H 2S Fermentación de glucosa, sacarosa y lactosa Con producción CO 2 Fermentación de glucosa, sacarosa Con producción CO 2 Fermentación de glucosa, sacarosa Con producción de H2S y CO2
2. Fermentación del Manitol Medio Manitol salado: manitol + NaCl / Indicador: Rojo de fenol. Utilizado para evaluar la utilización de diferentes fuentes de carbono por la v ía fermentativa como el manitol, teniendo como barrera de selectividad las concentraciones elevadas de sal.
Con el asa de kolle estéril y frente a fuego de mechero, sembrar con la técnica agotamiento y estría en medio Manitol salado cepas de Staphylococcus aureus y Staphylococcus epidermidis.
Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
Observar e interpretar los resultados obtenidos.
Lectura
Sin inocular
NEGATVO
POSITIVO
3. Prueba del Citrato de sodio. Medio Citrato de Simmons: Citrato de sodio /Indicador: Azul de bromotimol. En esta prueba se evalúa la capacidad metabó lica de las bacterias para utilizar el Citrato de sodio como fuente de carbono.
Con la aguja Bacteriológica estéril y frente a fuego de mechero, sembrar por técnica de estría en el plano inclinado del medio Citrato de Simons cepas de Pseudomonas aeurinosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens , Citrobacter freundii .
Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
Observar e interpretar los resultados obtenidos.
Lectura
NEGATIVO
POSITIVO
4. Prueba del Rojo de Metilo Medio MR-VP: Glucosa /Indicador: ----Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa con gran producción de ácido.
Con la aguja Bacteriológica estéril y frente a fuego de mechero, sembrar por técnica de siembra en medio líquido en el caldo MR-VP, cepas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Serratia marcescens , Citrobacter freundii . Llevar a incubación a 37°C por 24 horas. Después de la incubación, agregar 5 gotas de reactivo de Rojo de metilo, homogenizar y dejar en reposo unos minutos. Observar e interpretar los resultados obtenidos.
Lectura
POSITIVO
NEGATIVO
5. Prueba del Voges-Proskauer Medio MR-VP: Glucosa /Indicador: ----Esta prueba se realiza para determinar la capacidad de un microorganismo de fermentar la glucosa con producción de ácido por la vía ácido mixta o con producción de un producto final neutro (acetoína) por la vía butanodiólica.
Con la aguja Bacteriológica estéril y frente a fuego de mechero, sembrar por técnica de siembra en medio líquido en el caldo MR-VP, cepas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis, Serratia marcescens , Citrobacter freundii . Llevar a incubación a 37°C por 24 horas. Después de la incubación, agregar 4 gotas de solución de KOH al 40%, homogenizar y dejar en reposo por 20 minutos a T° de 37°C. Agregar posteriormente 5 gotas de solución de Alfa naftol, homogenizar y dejar en reposo por 10 minutos. Observar e interpretar los resultados obtenidos.
Lectura
POSITIVO
NEGATIVO
6. Prueba de la Hidrólisis del Almidón Medio Agar Almidón: Base Agar nutritivo + Almidón soluble 0.4% Utilizado para evaluar la capacidad metabólica de las bacterias de hidrolizar el almidón por la acción de exoenzimas (amilasas), y degradarla a m altosa (disacárido de dos glucosas) y glucosa. Estos azúcares son transportados al citoplasma de la célula y usado s como fuente de carbono y fuente de energía.
Con el asa de kolle o aguja bacteriológica estéril y frente a fuego de mechero, sembrar por picadura y de forma concéntrica en agar almidón cepas de Bacillus subtilis en cada uno de los cuadrantes de la placa. Llevar a incubación a 37°C por 24 horas. Después de la incubación, agregar gotas de lugol a la placa de agar almidón en el que se evidencie desarrollo de colonias.
Mover suavemente hasta lograr que el lugol se extiendo por toda la placa.
Observar e interpretar los resultados obtenidos.
Lectura
La aparición de color azul revela la presencia de almidón. La aparición de halos claros alrededor de las colonias indica la hidrólisis del po lisacárido.
B. METABOLISMO DE LOS CARBOHIDRATOS 1. Utilización del Triptofano y producción de INDOL: Medio SIM (Sulfuro de hidrógeno, Indol, Motilidad): Triptofano / Semisólido Este medio permite evaluar 3 pruebas: Motilidad de la bacteria, la cual se evidencia por el desplazamiento del crecimiento alrededor de la línea de inoculación, realizada en profundidad y en el centro del agar; Producción de Indol, producto de la acción de la enzima Triptofanasa sobre el triptófano del medio y la producción del Sulfuro de hidrógeno .
Con la aguja Bacteriológica estéril y frente a fuego de mechero, sembrar con la técnica de puntura en el medio SIM cepas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens , Citrobacter freundii . Llevar a incubación a 37°C por 24 horas. Después de la incubación, agregar 5 gotas de reactivo de Kovacs y mover suavemente. Observar e interpretar los resultados obtenidos.
Lectura Positivo: Formación de un anillo rosado o rojo Negativo: No formación de anillo.
2. Descarboxilación / desaminación de la ORNITINA: Medio MIO (Motilidad, Indol, Ornitina): Ornitina / Indicador: Purpura de Bromocresol Este medio permite evaluar 3 pruebas: Motilidad, Indol y descarboxilación o desaminación de la Ornitina. Debido a la fermentación de la glucosa se pro duce una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por descarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura.
Con la aguja Bacteriológica estéril y frente a fuego de mechero, sembrar con la técnica de puntura en el medio MIO cepas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens , Citrobacter freundii .
Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
Observar e interpretar los resultados obtenidos.
Lectura POSITIVO
NEGATIVO
3. Descarboxilación / desaminación de la LISINA: Medio LIA: Lisina / Indicador: Purpura de Bromocresol Este medio permite evaluar la capacidad metabólica de la b acteria de utilizar la Lisina como fuente de Nitrógeno. Debido a la fermentación de la glucosa se pro duce una condición ácida y originando que el indicador de pH púrpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones óptimas para la actividad de la enzima Lisina decarboxilasa, la cual decarboxila la Lisina presente. Producto de la descarboxilación, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color púrpura.
Con la aguja Bacteriológica estéril y frente a fuego de mechero, sembrar con la técnica de puntura y estría en el medio LIA cepas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens , Citrobacter freundii .
Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
Observar e interpretar los resultados obtenidos.
Lectura:
4. Hidrólisis de la ÚREA: Agar Úrea: Úrea / Indicador: Rojo de fenol. Este medio permite evaluar la capacidad metabólica de la bacteria de utilizar la Úrea como fuente de Nitrógeno, siempre que la especie bacteriana produzca la enzima ureasa.
Con la aguja Bacteriológica estéril y frente a fuego de mechero, sembrar con la técnica de estría en plano inclinado del medio agar Urea, cepas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens , Citrobacter freundii .
Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
Observar e interpretar los resultados obtenidos.
Lectura:
NEGATIVO
POSITIVO
POSITIVO
5. Hidrólisis de la GELATINA: Medio Frazier (Agar Gelatina): Gelatina / Indicador: --------Esta prueba se utiliza para determinar la capacidad de un microorganismo para producir enzimas proteolíticas que licúan la gelatina (ge latinasas).
Con la aguja Bacteriológica estéril y frente a fuego de mechero, sembrar con la técnica de Puntura en el medio Frazier (agar Gelatina), cepas de Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Shigella flexneri, Proteus mirabilis, Serratia marcescens , Citrobacter freundii .
Llevar a incubación a 37°C por 24 horas.
Después de la incubación llevar a refrigeración por 30 min.
Observar e interpretar los resultados obtenidos.
CUESTIONARIO 1. Esquematice lo realizado en práctica. 2. Reporte los resultados obtenidos con la especie bacteriana que trabajó. 3. Explique el fundamento de cada una de las pruebas realizadas.
