UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU FACULTAD DE INGENIERÍA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE CIENCIA E INGENIERÍA DE ALIMENTOS
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA GENERAL
DOCENTE: Ing. M.Sc. Emilio Fredy Yábar Villanueva 1
Semestre Académico 2011-II INDICE GENERAL Página 1.
Introducción
03
2.
Normas generales de laboratorio
04
3.
Espectro de absorción de soluciones coloreadas
4.
05
Construcción de una curva estándar - demostración práctica de la ley de Beer
5.
07
Determinación por espectrofotometría de una sustancia Biológica-antocianinas totales
6. Determinación de proteínas por espectrofotometría
11 13
7. Evaluación de la actividad de la enzima polifenoloxidasa 15 8. Determinación de la actividad de la catalasa
17
9. Actividad de la amilasa
19
10.
Medida de la intensidad respiratoria por el método manométrico simple
22
11. Fermentación láctica
24
12. Fermentación alcohólica
26
13. Determinación del punto isoeléctrico de la caseína
28
2
INTRODUCCIÓN Las prácticas de Bioquímica General son una parte esencial en la formación de un alumno, porque además del aspecto cognitivo es importante la formación metódica de trabajo en el laboratorio. La mayoría de las técnicas experimentales y conocimientos que se han aprendido en otros cursos son muy útiles en el laboratorio de Bioquímica. Los conocimientos metodológicos para estudiar las biomoléculas son cada vez más cerca del principio de la ciencia, por lo que las prácticas propuestas solamente constituyen alcances formativos de la bioquímica Las prácticas de laboratorio, pretenden proporcionar al estudiante las principales técnicas experimentales utilizadas habitualmente en un laboratorio de Bioquímica, lo cual le permitirá aprender posteriormente técnicas más complejas con mayor facilidad. Cada práctica presenta una breve fundamentación teórica que centra al alumno sobre los objetivos de la misma. A continuación, se detallan los materiales, reactivos y el procedimiento experimental a seguir Por último, cada equipo de trabajo, procederá a realizar su práctica de laboratorio;
cada
alumno
deberá
anotar
cuidadosamente
sus
observaciones y preguntar sus dudas respecto a los resultados u observaciones que el alumno vea por conveniente 3
Las prácticas de Bioquímica General, considera dos aspectos, 1) Prácticas de laboratorio y 2) Seminarios; los mismos que serán evaluados y considerados en la nota final de la asignatura. Finalmente, el manual de Laboratorio de Bioquímica General contiene prácticas sencillas y representativas, que intentan explicar algunas de las propiedades de las biomoléculas y técnicas para estudiarlas.
NORMAS GENERALES DE LABORATORIO Para iniciar las prácticas de laboratorio, se recomienda lo siguiente. 1. Estudiar cuidadosamente la guía de prácticas del experimento a realizar 2. Es obligatorio el uso de un mandil blanco, limpio, y cualquier otro material de protección que indique el profesor. 3. Cada grupo de trabajo debe contar con el mínimo de material de limpieza del área de trabajo y de aseo personal. 4. Está absolutamente prohibido comer en el laboratorio. 5. Está absolutamente prohibido trabajar con reactivos NO identificados y evitar pipetear con la boca. 6. Mantener constantemente limpio la mesa de trabajo durante el desarrollo de las prácticas. 7. Cada alumno debe contar con un cuaderno de prácticas. 8. Si algún reactivo llega a los ojos, lavarse con abundante agua e inmediatamente acudir al centro médico de la universidad para el auxilio correspondiente. 9. El alumno debe preguntar al profesor cualquier duda con el fin de evitar accidentes o errores durante la ejecución de la práctica. 10. Una vez finalizado la práctica de laboratorio deben lavarse las manos, dejar limpio y en orden la mesa de trabajo
4
ESPECTRO DE ABSORCION DE SOLUCIONES COLOREADAS I.
OBJETIVOS
1.1.
Aprender el manejo de un espectrofotómetro
1.2.
Determinar experimentalmente la lambda óptima de absorción
II. FUNDAMENTO Cada sustancia tiene un determinado punto de luz monocromática donde se produce la mayor cantidad de excitación y por lo tanto se produce la mayor absorción de la luz que incide sobre ella. La curva que nos muestra la variación de absorbancia en función de diferentes longitudes de onda, es conocida como espectro de absorción y el pico más alto representa la longitud de onda de máxima absorción u óptimo. III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Materiales Espectrofotómetro, tubos de prueba, gradillas, fiolas y pipetas 3.2. Reactivos Azul de bromo fenol u cualquier otro colorante 3.3. Metodología 1. A partir de una solución stock del colorante de azul de bromo fenol u otro colorante de 10 mg. % de concentración, preparar una solución de trabajo que tenga una concentración de 0,4 mg. por ciento. 2. Encender el espectrofotómetro, dejar procesar por aproximadamente 5 minutos y proceder a calibrar el equipo con agua destilada a una lambda igual a 400 nm. 3. Coloque una alícuota de la solución de trabajo en un tubo del espectrofotómetro y haga su lectura en unidades de absorbancia. 5
NOTA: Pruebe sus lecturas con las dos soluciones preparadas y de acuerdo a los resultados decida la concentración de la solución a trabajar. 4. Repita la lectura en las lambdas, de tal forma que se incrementen de 10 en 10 hasta 700 nm.; anote sus lecturas en forma tabular. No olvide que debe calibrar el equipo con agua destilada cada vez que cambie de lambda. 5. Grafique en papel milimetrado ploteando Absorbancia (eje Y) versus Lambda (eje X). Una todos los puntos con trazos suaves y en el punto de máxima absorbancia trace una línea recta que corte el eje X y determine así la lambda óptima para el colorante. 6.
Si el equipo es automatizado, aplicar los correspondientes parámetros, con la correspondiente orientación del profesor.
IV. RESULTADOS Y DISCUSION V. CONCLUSIONES VI. CUESTIONARIO VII. BIBLIOGRAFIA 1.
Aliaga P. y Col. 1997. Manual de Prácticas. Bioquímica I. Facultad de Ciencias. Departamento de Química. UNA-LM LimaPerú.
2.
Plummer, D. 1981. Introducción a la Bioquímica Práctica. Edit. Acribia S.A. Zaragoza-España.
3.
Skoog, D., Holler, F. y Crouch, S. 2008. Principios de Análisis Instrumental. Edit. CENGAGE LEARNING Editores. México D.F.
6
CONSTRUCCION DE UNA CURVA ESTANDAR - DEMOSTRACION PRÁCTICA DE LA LEY DE BEER I.
OBJETIVOS
1.
Demostrar la relación lineal entre la absorbancia y la concentración
de
una determinada sustancia a una longitud de onda
máxima. 2. Construir la curva estándar de una determinada sustancia coloreada y demostrar su aplicabilidad. II. FUNDAMENTO Según la ley Lambert, cuando un rayo de luz monocromática pasa a través
de
un
medio
absorbente,
su
intensidad
disminuye
exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta, mientras que la ley de Beer menciona que, cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentración del medio absorbente aumenta. Si se sigue la ley de Lambert-beer y l se mantiene constante, un gráfico de la extinción en función de la concentración da una línea recta que pasa por el origen; en tanto que un gráfico del porcentaje de transmitancia en función de la concentración da una curva 7
negativa exponencial. Algunos colorímetros y espectrofotómetros tienen dos escalas, una líneal de porcentaje de transmitancia y otra logarítmica de extinción. Esta última escala es la que está linealmente relacionada con la concentración y se usa en las curvas patrones de concentración; con la ayuda de tales curvas se puede determinar fácilmente la concentración de una muestra problema conociendo su extinción. III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Materiales Espectrofotómetro Solución de trabajo Material de vidrio como fiolas, pipetas y tubos de prueba 3.2. Metodología Utilizando la solución de trabajo preparada en la anterior práctica, seguir las indicaciones del jefe de práctica para realizar la galería de diluciones. Realice las lecturas de absorbancia a la longitud de onda determinada como óptima en la experiencia anterior. Se recomienda hacer las lecturas en unidades de transmitancia a fin de minimizar el error de lectura y transformarla luego a absorbancia. TUBOS Solución de trabajo H2O destilada Transmitancia Absorbancia Concentración
B -
1 2
2 4
3 6
4 8
5 10 ml.
10
8
6
4
2
0 ml.
mg/ml. mg% µg/ml. ppm IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES 4.1. En papel milimetrado grafique absorbancia (eje Y) versus 8
concentraciones (eje X) y una los puntos con una línea recta que pase por el origen. 4.2. Determinar la absorbancia de una muestra del colorante de concentración
desconocida
y
determine
gráficamente
su
concentración utilizando la curva estándar. V. CONCLUSIONES VI. CUESTIONARIO
VII. BIBLIOGRAFIA 1. Aliaga, P. y Col. 1997. Manual de Prácticas. Bioquímica I. Facultad de Ciencias. Dpto. de Química U.N.A. La Molina. 2. Plummer, D. 1981. Bioquímica Práctica. Edit. Mc. Graw-Hill Latinoamericana S.A. Bogotá-Colombia. 3. Skoog, D., Holler, F. y Crouch, S. 2008. Principios de Análisis Instrumental. Edit. CENGAGE LEARNING Editores. México D.F. .
9
Seminario: CÁLCULO DE LA ENERGÍA DE ACTIVACIÓN DE UNA REACCIÓN
10
DETERMINACIÓN POR ESPECTROFOTOMETRÍA DE UNA SUSTANCIA BIOLÓGICA- ANTOCIANINAS TOTALES I.
OBJETIVOS
1. Demostrar la aplicación práctica de la ley de Lambert y Beer 2. Construir la curva estándar de una determinada sustancia biológica y calcular la concentración de dicha sustancia en muestras de trabajo. II. FUNDAMENTO Según la ley Lambert, cuando un rayo de luz monocromática pasa a través
de
un
medio
absorbente,
su
intensidad
disminuye
exponencialmente a medida que la longitud del medio absorbente aumenta, mientras que la ley de Beer menciona que, cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un medio absorbente, su intensidad disminuye exponencialmente a medida que la concentración del medio absorbente aumenta. Si se sigue la ley de Lambert-beer y l se mantiene 11
constante, un gráfico de la extinción en función de la concentración da una línea recta que pasa por el origen; en tanto que un gráfico del porcentaje de transmitancia en función de la concentración da una curva negativa exponencial. Algunos colorímetros y espectrofotómetros tienen dos escalas, una líneal de porcentaje de transmitancia y otra logarítmica de extinción. Esta última escala es la que está linealmente relacionada con la concentración y se usa en las curvas patrones de concentración; con la ayuda de tales curvas se puede determinar fácilmente la concentración de una muestra problema conociendo su extinción. III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Materiales Espectrofotómetro Solución stock y de trabajo de la sustancia biológica Material de vidrio como fiolas, pipetas y tubos de prueba 3.2. Metodología Utilizando la solución de trabajo de la sustancia biológica, seguir las indicaciones del jefe de práctica para realizar la galería de diluciones. Realice
las
lecturas
de
absorbancia
a
la
longitud
de
onda
correspondiente. Para la determinación de antocianinas totales se pesará una cantidad de muestra, luego agregar un volumen de una solución extractora a base de etanol/ácido clorhídrico/agua en la proporción 70/1/30 (V/V/V). La lectura se efectuará en un espectrofotómetro a una longitud de de onda de 531 nm (λ = 531nm). Como blanco se usará la solución de etanol/ácido clorhídrico/agua. Para la cuantificación se usará una curva de calibración a base de antocianinas totales. Los resultados se expresarán como mg de antocianinas totales por gramo o por 100 gramos de muestra. IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES 4.1. En papel milimetrado grafique absorbancia (eje Y) versus concentraciones (eje X) y una los puntos con una línea recta que pase por el origen. 4.2.
Determinar la absorbancia de una muestra biológica de 12
concentración
desconocida
y
determine
gráficamente
su
concentración utilizando la curva estándar. V. CONCLUSIONES VI. CUESTIONARIO VII. BIBLIOGRAFIA 1.
Aliaga,P. y Col. 1997. Manual de Prácticas. Bioquímica I. Facultad de Ciencias. Dpto. de Química U.N.A. La Molina.
2. Plummer, D. 1981. Bioquímica Práctica. Edit. Mc. Graw-Hill Latinoamericana S.A. Bogotá-Colombia. 3. Silveira, A. C. et. al. 2007. Determinación de algunos atributos de calidad de la variedad Fuji y sus mutantes al momento de cosecha. Ciencia, Tecnología de Alimentos, Campinas, 27(1): 149-153.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROFOTOMETRÍA I.
OBJETIVOS
1.1.
Determinar la concentración de proteínas por espectrofotometría.
1.2.
Aplicar los principios de la espectrofotometría.
II. FUNDAMENTO La concentración de proteínas se medirá utilizando el método del Biuret, que se basa en la formación de un compuesto coloreado o cromóforo, de color azul-púrpura, debido a la formación de un complejo entre el ión cobre y los enlaces peptídicos a pH alcalino. Se requiere un mínimo de dos enlaces peptídicos para la formación del complejo coloreado, que se mide a 550 nm. Es un método poco sensible pero muy preciso, ya que la abundancia de grupos peptídicos (por unidad de masa de proteína) es prácticamente la misma en cualquier proteína . 13
III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Materiales y reactivos pH-metro o papel pH, baño maría, espectrofotómetro, ácido cítrico, bisulfito de sodio, agua destilada. Soluciones de albúmina de concentración desconocida, muestra A y B. Soluciones de proteína patrón (albúmina) de concentraciones conocidas Reactivo de Biuret Pipetas Tubos de prueba Espectrofotómetro (Colorímetro) 3.2. Metodología 1. Enumerar 7 tubos de prueba 2. Añadir a cada tubo lo siguiente
3. Añadir 4 ml. del reactivo de Biuret a todos los tubos. 4. Mezclar el contenido de cada tubo . 5. Esperar 5 min. para que se desarrolle el color. Medir la absorbancia a 550 nm ajustando a cero con el tubo 1 (blanco). IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES En una hoja de papel milimetrado construir una gráfica de A550 (eje y) frente a concentración de proteína (eje x) de las soluciones (tubos 2-5). Marcar el eje de las x en g/l de proteína. Determinar la concentración de las soluciones problema A y B interpolando en la curva estándar los valores de las soluciones problema A y B. Expresarlo en g/L V. CONCLUSIONES 14
VI. CUESTIONARIO VII. BIBLIOGRAFIA 1. Departamento
de
Biología
Molecular. 2011.
Prácticas
de
Bioquímica. Facultad de Medicina. Universidad de Cantabria. 2. Barboza, E., Ortiz, G. y Salcedo, R. 2011. Manual de Prácticas de Bioquímica. División Ciencias de la Vida. Universidad de Guanajuato.
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LA ENZIMA POLIFENOLOXIDASA I. OBJETIVOS 1.1. Determinar la presencia de la enzima polifenoloxidasa en diversos productos hortofrutícolas. 1.2. Determinar la actividad de la enzima polifenoloxidasa en función de los factores de una reacción enzimática. II. FUNDAMENTO La
reacción
de
pardeamiento
está
catalizada
por
el
enzima
polifenoloxidasa. Los compuestos fenólicos existentes en productos como la manzana, papas y otros, son oxidados a quinonas; estos compuestos se polimerizan para dar pigmentos marrones denominados melanoidinos. Entre las reacciones que ocurren en las células dañadas de algunos frutos se encuentran aquéllas que involucran la oxidación de compuestos fenólicos por medio del sistema enzimático llamado Polifenoloxidasas, que dan como resultado la formación de productos finales de color característico. El sistema enzimático polifenoloxidasa (E.C.1.10.3.2) es también conocido como fenolasa, tirosinasa y catecoloxidasa. La naturaleza de estas enzimas es de oxidorreductasas, se encuentran dentro del grupo 15
de las hidroxilasas y se considera que están asociadas principalmente con los cloroplastos y otros plastos. III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Materiales y reactivos pH-metro o papel pH, baño maría, espectrofotómetro, ácido cítrico, bisulfito de sodio, agua destilada. Manzana, papa u otro material biológico Material de vidrio
3.2. Metodología A.
Efecto del tratamiento de los tejidos de manzana y su efecto en la reacción de pardeamiento.
Cortar 3 rodajas de manzana de un espesor de aproximadamente 2 mm y colocarlas en una placa petri por 15 minutos. B. Efecto del calor en la reacción de pardeamiento Cortar 3 rodajas de manzana de aproximadamente 2 mm de espesor e inmediatamente colocarla en el baño maría a 80 0C durante 5 minutos y otras 3 rodajas a 10 minutos e inmediatamente enfriarla y colocarla en placas petri por 15 minutos. Tres rodajas de control serán tratadas sólo con agua destilada. C. Efecto del bisulfito de sodio y ácido cítrico en las reacciones de pardeamiento Colocar tres rodajas de manzana de 2 mm de espesor en una placa petri y embeberla con bisulfito de sodio, en una segunda placa petri colocar otras tres rodajas y embeberla con una solución de ácido cítrico y en una tercera placa petri colocar tres rodajas de manzana y embeberla con agua destilada (control). Controlar el tiempo por 15 minutos. D. Evaluación Licuar las rodajas de los experimentos A, B y C con 20 mL de agua 16
destilada, filtrarla y regular su %T o A a una λ de 475 nm IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES V. CONCLUSIONES VI. CUESTIONARIO VII. BIBLIOGRAFIA 1. Connie, M., Weaver and James, R. Daniel 2005. The Food Chemistry Laboratory CRC PRESS London. 2. Fennema,O. 2000. Química de los Alimentos Edit. Acribia S.A. Barcelona- España. 3. Salfield, J.R. 1977 Prácticas de Ciencia de los Alimentos. Edit ACRIBIA, S.A. Zaragoza-España. DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA I.
OBJETIVOS:
Determinar la actividad de la catalasa y la eficiencia de inactivación de enzimas (peroxidasa y catalasa) en productos alimenticios. II. FUNDAMENTO: Las enzimas son proteínas y una característica de éstas es ser termolábiles, es decir se destruyen por el calor. Esta destrucción por el calor significa pérdida de su actividad como enzima. La peroxidasa y catalasa son enzimas ampliamente difundidas en productos vegetales. Su control, habitualmente utilizado por los fabricantes, es realizado mediante un escaldado con agua caliente o con vapor vivo; también puede utilizarse tratamientos con dióxido de azufre o sus sales o una combinación de escaldado y sulfitado. Los sulfitos resultan particularmente útiles para inhibir la actividad peroxidasa. Peroxidasa: Enzima resistente al calor y su inactivación asegura la destrucción de los más lábiles. Temperatura de escaldado 77 - 82 oC . Catalasa: Enzima de control para hortalizas que modifican su sabor y textura a temperaturas altas. Temperatura de escaldado 60-65 oC. La catalasa es una enzima que tiene el grupo prostético hemo (presenta hierro en el centro de su esqueleto fundamental porfirítico) y actúa sobre 17
el peróxido de hidrógeno resultante de la oxidación del glicolato en los peroxisomas durante la fotorrespiración en las hojas. III. MATERIALES Y METODOS: 3.1. Materiales Muestras, manómetro, mortero, peróxido de hidrógeno, material de vidrio y otros 3.2. Metodología 1. Pesar cuidadosamente 10 g de muestra 2. Colocarlo en un mortero y molerlo durante 2 min. Agregar de 5 a 10 ml de agua destilada y tomar 1 ml de la solución con una pipeta y colocarla en una pequeña cápsula dentro del erlenmeyer. 3. Pipetear 2 a 5 ml de solución de peróxido de hidrógeno al 3 % y transferir al erlenmeyer sin que entre en contacto con el contenido de la cápsula. Conectar el erlenmeyer al dispositivo manómetro. Nivelar y tomar el erlenmeyer y agitarlo suave y uniformemente por 2 min. para que la reacción tenga lugar. Después de los dos minutos se lee en la pipeta el volumen de oxígeno liberado. 4. Calcular el número de moles de oxígeno liberado según la formula: PV=nRT 5. Calcular la actividad enzimática en unidades de catalasa. Una unidad de catalasa, es un micromol de O 2 liberado por minuto a una determinada temperatura. IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES: V. CONCLUSIONES VI. CUESTIONARIO VII. BIBLIOGRAFIA 1. Rodríguez,
A. y Chang, M. 2009. Manual de prácticas de
fisiología vegetal. Universidad Nacional Agraria la Molina. Departamento de Biología. Lima Perú. 18
ACTIVIDAD DE LA AMILASA I. OBJETIVOS 19
Determinar la actividad de la enzima amilasa II. FUNDAMENTO La amilasa es un grupo de tres enzimas: alfa-amilasa, beta-amilasa y almidón fosforilasa, las cuales rompen distintos enlaces de la molécula de almidón degradándola hasta el nivel disacárido maltosa (glucosa + glucosa). Luego, la maltosa puede ser degradada por la enzima maltasa hasta el nivel de glucosa, la cual entra al proceso respiratorio para la obtención de energía. La amilasa se puede encontrar en diversos tejidos vegetales y en gran cantidad en semillas, ya que degrada el almidón acumulado y a través de la respiración se obtiene la energía necesaria (ATP) para los procesos metabólicos durante el desarrollo del embrión hasta que la plántula forme sus primeras hojitas y pueda fotosintentizar formando su propia fuente de azúcares. III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Materiales Tubos de ensayo, gradillas, pipetas, beakers, baño maría, mortero, almidón, lugol, HCI 1 N, material vegetal: semilla de cebada en germinación 3.2. Metodología Pesar 10 g de semillas germinadas, molerlas y adicionar 100 ml de agua destilada, filtrar, dejar reposar hasta que se separen dos .capas y separe la superior, ésta constituye el extracto crudo de amilasa. Tomar 5 tubos de ensayo enumérelos y colocar 5 ml de almidón al 1 % (sustrato). Agregue a cada tubo 1 ml de amilasa (enzima), tenga cuidado en tomar el tiempo desde que empieza la reacción enzima-sustrato, trate de realizar esta operación rápidamente para que la reacción empiece casi al mismo tiempo en todos los tubos. Agite con cuidado y deje reposar. Finalizado el tiempo de reacción previsto para cada tubo (0, 5, 10, 15 y 20 minutos) agregue al instante 2 ml de ácido clorhídrico y agite. Tenga en cuenta que para el tiempo cero esta operación debe ser casi 20
simultánea con la anterior. Todas estas operaciones deben realizarse con los tubos de ensayo dentro del medio que proporciona la temperatura deseada: alta (dentro de un vaso de agua caliente), baja (dentro de un vaso de agua fría) o a temperatura ambiente. Finalmente agregue 1 gota de lugol a cada tubo y adicione agua destilada hasta completar 10 ml y observe la gradiente en las distintas temperaturas. IV. BIBLIOGRAFIA 1. Rodríguez, A. y Chang, M. 2009 Manual de prácticas de fisiología vegetal. Universidad Nacional Agraria la Molina. Departamento de Biología. Lima Perú
21
SEMINARIO: PROBLEMAS DE CINÉTICA ENZIMÁTICA
22
MEDIDA DE LA INTENSIDAD RESPIRATORIA POR EL METODO MANOMETRICO SIMPLE I. OBJETIVO Demostrar el intercambio gaseoso en el proceso de respiración mediante la medida
de la intensidad respiratoria por el sistema manométrico
simple. II. FUNDAMENTO La respiración es un proceso catabólico oxidativo que utiliza el oxígeno atmosférico y libera anhídrido carbónico y energía de los sustratos respiratorios que se consumen en dicho proceso. La respiración puede ser medida por el volumen de anhídrido carbónico producido y un método sencillo aunque no muy preciso pero satisfactorio, para demostrar intercambio gaseoso en la respiración, consiste en captar el anhídrido producido en la respiración por una solución de hidróxido de sodio. El volumen de oxígeno consumido se puede medir mediante un sistema manométrico simple. III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Materiales: Sistema Manométrico simple, granos de semillas en germinación NaOH 10 normal 3.2. Metodología: Será explicado por el profesor IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES V. CONCLUSIONES VI. CUESTIONARIO VII. BIBLIOGRAFIA 1.
Fennema,O. 2000. Química de los Alimentos Edit. ACRIBIA S.A. Barcelona- España.
2.
Rodríguez, A. y Chang, M. 2009 Manual de prácticas de fisiología vegetal. Universidad Nacional Agraria la Molina. Departamento de Biología. Lima Perú. 23
24
FERMENTACIÓN LÁCTICA I. OBJETIVO 1.
Demostrar la transformación de la lactosa en ácido láctico
2.
Cuantificar el ácido láctico producido por las bacterias del yogurt
II. FUNDAMENTO La Lactosa, azúcar de la leche, es fermentada por bacterias acido lácticas para producir ácido láctico. La fermentación láctica es un proceso anaeróbico, mediante el cual la glucosa es degradada hasta ácido láctico, en bacterias acido lácticas y en el músculo. La secuencia de reacciones degradativas comprende la vía de Embden-Meyerhoff, donde se forma ácido pirúvico que se transforma en ácido láctico por medio de la enzima lactato deshidrogenasa. La fermentación láctica se aplica en la preparación de diversas leches lácticas, encurtidos y ensilado de forrajes. La
fermentación
homoláctica
es
realizada
principalmente
por
streptococcus y algunas especies de Lactobacillus que transforman la lactosa casi enteramente en ácido láctico. La fermentación heteroláctica, es realizada principalmente por bacterias del género Leuconostoc y algunas especies del género Lactobacillus que transforman la lactosa en ácido láctico y otros productos como etanol, ácido acético y CO 2. III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Materiales y reactivos: 2 erlenmeyer de 125 mL, probeta de 100 mL, bureta de 25 mL, NaOH 0,5 N, fenolftaleína, leche y cultivo de yogurt (Streptococcus lactis, Lactobacillus bulgaricus). 3.2. Metodología: 1. Pasteurizar aproximadamente 250 mL de leche entre 60 a 90 0C durante 10 minutos. 2.
Enfriar la leche a aproximadamente 45 0C.
3. Medir aproximadamente 100 mL de esta leche y verter en un erlenmeyer de 125 mL (blanco). Preparar otro matraz similar para la muestra problema (muestra). 25
4. Agregar aproximadamente entre el 2 al 5 % de yogurt a ambos erlenmeyers, mezclar adecuadamente. 5. El blanco se coloca en una refrigeradora y la muestra se coloca en una estufa o baño maría a 45 0C durante 4 horas. 6. Tomar muestras cada 2 horas de ambos erlenmeyers, temperar al ambiente. 7. Determinar acidez total expresado en gramos de ácido láctico IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES V. CONCLUSIONES VI. CUESTIONARIO VII. BIBLIOGRAFIA 1. Cortes, R.. 2009. Manual de Prácticas de Biotecnología. Programa de Biología. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. México.
FERMENTACION ALCOHOLICA I. OBJETIVOS 26
1.1.
Observar y estudiar el proceso de fermentación alcohólica utilizando como sustrato zumo de productos vegetales
1.2.
Obtener un metabolito primario (alcohol) a partir de una fermentación realizada por la levadura de Saccharomyces cerevisiae.
II. FUNDAMENTO Durante el metabolismo de los carbohidratos, la glucosa resulta ser el sustrato que más fácilmente es utilizado por las células con el fin de obtener energía para realizar sus procesos de biosíntesis. En el músculo, la glucosa en condiciones aeróbicas o anaeróbicas es transformada hasta dos moléculas de piruvato, la cual en condiciones anaeróbicas es reducida hasta dos moléculas de lactato. En las levaduras, caso de la Saccharomyces cerevisiae, similar proceso sucede hasta piruvato, la cual en condiciones anaeróbicas es transformada en dos moléculas de alcohol etílico y dos moléculas de dióxido de carbono. En el primer caso el ciclo de conversión es denominado glucolisis y en el segundo ciclo de E. M.P. III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Materiales Fermentador experimental, Potenciómetro, Brixómetro, densímetro, destilador simple, Zumo de un producto vegetal, azúcar, solución de ácido cítrico estándar. 3.2. Metodología Será explicado por el profesor de práctica IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES Expresar sus resultados mediante un gráfico y la prueba de su destilación. V. CONCLUSIONES VI.CUESTIONARIO VII. BIBLIOGRAFIA 1. Jagnow,
G.
y
David,
W.
1991.
Bioctenología:
experimentos modelos. Edit. Acribia, Zaragoza-España.
27
inducción
con
28
DETERMINACION DEL PUNTO ISOELECTRICO DE LA CASEINA I. OBJETIVOS 1.1. Determinar el punto isoeléctrico de la caseína utilizando el pH de mínima solubilidad, para luego proceder a su extracción y "purificación". 1.2. Determinar el perfil de pH versus adición de ácido cítrico estándar. II. FUNDAMENTO El punto isoeléctrico (pI) es el pH en que la carga neta total de una molécula es igual a cero y no migra en un campo eléctrico. Un fenómeno físico importante es que cuando una molécula está en su punto isoeléctrico tiende a precipitarse, el cual representa un principio importante de separación de proteínas. Para determinar el pI de una proteína se usa la técnica del isoelectroenfoque, y si se conoce la secuencia de una proteína, existen programas que permiten conocer el punto isoeléctrico, como el EditSeq de DNA star. Debido a que una proteína
precipita
en
su
punto
isoeléctrico,
en
esta
práctica
determinaremos el punto isoeléctrico aproximado de la caseína (proteína mayoritaria en la leche) al colocarlos en soluciones con diferentes valores de pH. La caseína es la principal proteína de la leche y está presente en una concentración de aproximadamente 35 g/L. No es un compuesto simple sino una mezcla heterogénea de proteínas que contienen fósforo. La mayoría de las proteínas muestran una solubilidad mínima en su punto isoeléctrico y este principio se usa para separar la caseína y otras proteínas que tienen similar comportamiento, es decir aquellas que precipitan ajustando el pH progresivamente hasta llegar al punto isoeléctrico. La caseína de la leche tiene su punto isoeléctrico a un pH de 4,6; además es también insoluble en alcohol lo cual permite remover la grasa de las preparaciones.
29
III. MATERIALES Y METODOS 3.1. Materiales pH-metro o papel pH Leche descremada, ácido acético 0.01 N, ácido acético 0.1 N, ácido acético 1N. Material de vidrio 3.2. Metodología Será explicado por el profesor de práctica REACTIVO (Volumen en ml.) H2O HOAC 0.01M HOAC 0.1 M HOAC 1.0 M Leche pH Observación
1 8.4 0.6 1
2 7.8 1.2 1
3 8.8 0.2 1
TUBO 4 8.5 0.5 1
NÚMERO 5 6 8.0 7.0 1.0 2.0 1 1
7 5.0 4.0 1
8 1.0 8.0 1
9 7.4 1.6 1
IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES Cuadro de pH, adición de ácido cítrico estándar y observaciones. Gráfica de pH versus adición de ácido cítrico estándar Propiedades funcionales V. CONCLUSIONES VI. CUESTIONARIO VII. BIBLIOGRAFIA 1. Fennema,O. 2000. Química de los Alimentos Edit. ACRIBIA S.A. Barcelona- España. 2. http://www.upo.es/depa/webdex/quimfis/docencia/biotec_FQbiomo l/Practica3FQB.pdf. Octubre del 2011.
30
31
HOJA DE CONTROL DE LA ACTIVIDAD DE LOS ALUMNOS DURANTE LA PRÁCTICA
PRÁCTICA
FECHA:
APELLIDOS Y NOMBRES DEL ALUMNO
OBSERVACIONES
CÁLCULOS/RESULTADOS
32
33
