UNIVERSIDAD UNIVERSI DAD CATOLICA CATOLICA SANTA MARIA PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL CURSO: MICROBIOLOGIA AMBIENTAL PRACTICA N° 13 TOMA DE MUESTRAS DE MEDIO AMBIENTE CON EL USO DE EQUIPO SAS (SURFACE AIR SYSTEM METHOD) METHOD ) OBJETIVOS
1. Comple Completar tar la practi practica ca ante anterio rior: r: a. Identifiqu Identifiquee las caracterís características ticas del del crecimiento crecimiento bacteri bacteriano ano en los medios medios de cultiv cultivoo para bacterias que biodegraden el petróleo. Lectura de características y coloración de Gram. b. Lectura de pruebas bioquímicas de las bacterias inoculadas (identificación por rueba I!"IC# y otras bioquímicas para para descartar$ tipos de de bacterias e identificar específicamente cada una. %. &ue el alumno alumno aprenda aprenda a conocer conocer las las formas formas para determ determinar inar la canti cantidad dad de microo microorgan rganismos ismos (bacte (bacteria riass y 'on 'ongos gos## que pueden pueden estar estar presente presentess en el ambien ambiente te (aire# (aire# de un lugar lugar determinado y aplicar los mtodos aprendidos para la identificación de los microorganismos aislados. a. )specí )specífic ficame amente nte conoce conocerr el mtodo mtodo *+*$ (*urface (*urface +ir +ir *ystem *ystem !et'od !et'od#$ #$ para su aplicación en el recuento recuento de los microorganismos microorganismos encontrados en el aire de medio medio ambiente$ pueden ser aulas laboratorios$ centros de comerciali,ación$ salas de operaciones$ etc. INTRODUCCION
)l aire contiene en suspensión suspensión diferentes tipos tipos de microorganismos$ microorganismos$ especialmente bacterias bacterias y 'ongos. La presencia de uno uno - otro tipo tipo depende del origen$ de la dirección e intensidad intensidad de las corrientes corrientes de aire y de la supervive supervivencia ncia de microorg microorganism anismos. os. Los virus virus son las las formas formas de vida mas simples simples $ que se transmiten principalmente a travs del aire. )stn constituidas -nicamente por material gentico: +/0 (cido desoirribomucleico ó +20 (cido ribonucleico y una cpside ó cubierta nucleica. *on parsitos obligados es decir decir precisan de un un 'usped para poder reproducirse . La infección la llevan a cabo inyectando su material gentico en las clulas del 'usped. 3na ve, en su interior se sirven de la maquinaria biológica biológica del 'usped para producir producir copias de si mismos 'asta 'asta lograr su tota recomposici recomposición ón y en un n-mero tal que rompe rompe las membranas celulares celulares pasando así a infectar nuevas nuevas clulas. La bacterias son organismos organismos ms comple4os que los los virus y a diferencia de ellos son capaces de vivir en un medio adecuado adecuado$$ sin la necesidad necesidad de un 'usped 'usped para completar completar su desarrol desarrollo. lo. +lguna +lgunass bacterias bacterias presentan esporas que son resistentes a condiciones adversas$ stas pueden resistir a5os en diferentes temperatu temperaturas$ ras$ sequedad$ sequedad$ falta falta de nutrientes nutrientes $ recuperando recuperando su estado estado normal y capacidad capacidad infectiv infectivaa al entrar en contacto con un medio adecuado para su desarrollo.
Los 'ongos son formas comple4as de vida que presentan una estructura vegetativa denominada !icelio formado por 'ifas . La que surge de de la germinación de sus clulas reproductoras ó esporas . Las enfermedades transmitidas por el aire$ producidas por bacterias$ virus y 'ongos$ son las respiratorias (neumonía$ tosferina$ tuberculosis$ legionelosis$ resfriado$ gripe#$ sistmicas (meningitis$ sarampión$ varicela$ micosis# y alrgicas. 3n bioaerosol es aquello que se encuentra en suspensión en el aire que est o estaba vivo$ o es producto de algo vivo. )4emplos de bioaerosoles son: 6 "irus 6 7acterias 6 )sporas de 8ongos 6 +lgas 6 roto,oos 6 olen 6 9caros del polvo 6 )scamas de piel pelo (animales o 'umanos# NECESIDAD DEL ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AIRE.
)l aire es un ve'ículo que puede transportar esporas de 'ongos y tambin bacterias ad'eridas a partículas de polvo o contenidas en gotitas microscópicas de líquido (aerosoles#. *on los denominados bioaerosoles. )stos microorganismos pueden alcan,ar los alimentos que estn siendo procesados y alterarlos$ por lo que es necesario conocer cul es el nivel de riesgo que se est corriendo para aplicar medidas correctoras si esto fuese necesario. ANALISIS MICROBIOLOGICO DEL AIRE.
)l anlisis microbiológico del aire puede consistir en un recuento en placa de microorganismos aerobios mesófilos (n-mero de ufc por metro c-bico de aire# que puede complementarse con una investigación de la presencia de determinados microorganismos patógenos. *on dos las peculiaridades destacables del anlisis microbiológico del aire sobre los anlisis de otros tipos de muestras:
a# Las bacterias viables presentes en el aire suelen estar lesionadas debido a una des'idratación notable. or lo tanto$ no es conveniente recoger las muestras de aire sobre medios selectivos$ sino sobre medios que permitan la revivificación de estos microorganismos b# Las tcnicas de toma de muestra son totalmente distintas. PERMANENCIA
)l tiempo que permanecen los microorganismos en el aire depende de la forma$ tama5o y peso del microorganismo y de la eistencia y potencia de las corrientes areas que los sostengan y los eleven. La sedimentación de los microorganismos por gravedad sólo es importante en el aire en calma.
)l impacto que sufren las partículas del aire cuando encuentran un obstculo$es mayor cuando partículas grandes inciden a altas velocidades 'acia ob4etos peque5os. )l lavado del aire por la lluvia termina rpidamente con el proceso de dispersión$siendo die, veces ms eficiente que la sedimentación y la impactación. +lgunos microorganismos$ incluidos bacterias$ virus y 'ongos$ son capaces de via4ar grandes distancias sin perder viabilidad. "ía de /I*)2*I;0 muy importante para los microorganismos. )n el )<=)2I>2 los organismos predominantes son de origen edfico. 6 )n el I0=)2I>2 'ay mas organismos en el ambiente y provienen mayoritariamente del tracto respiratorio 'umano. +daptaciones especiales que favorecen la supervivencia y la dispersión: 6 )*>2+* (
Corrientes de aire$ "ientos ?uertes y '-medos )n aerosols y sprays >r collision de gotas de lluvias+gua pilveri,ada =oses y estornudos
!>/>* /) /I*)2*I>0 +C=I"+: -
'ilobus )sp'aerobolus
+I2) en el interior de las construcciones: -
*tap'ylococcus$ *=2)=>C>CC3*$ enicillium $ +lternaria
RECUENTO DE BACTERIAS PARA CONTROL DE CALIDAD DE AMBIENTES.
Con el uso de *+* (*urface +ir *ystem !et'od#$ es posible 'acer un muestreo del medio ambiente para poder anali,ar y ver la cantidad y el tipo de microorganismos presente en un ambiente determinado. )l principio de *+* es que el aire es aspirado a una velocidad fi4a a travs de una cubierta con 'oyos$ (que es la característica del equipo#$ que cubre las placas con el medio de cultivo. )l flu4o de aire que se crea es laminar y el dise5o de la cabe,a del equipo *+* es tal que los microorganismos en el aire son impulsados por la velocidad y son depositados sobre una superficie de agar de una placa de contacto. Cada muestra puede ser a4ustada para aspirar vol-menes variables de aire para permitir un muestreo del medio ambiente con un amplio rango de microorganismos concentrados. MUESTREO
+ntes de empe,ar a tomar la muestra con el equipo @*+* @ 'a de esterili,arse la cubierta del aparato. Asta puede llevarse a cabo por medio del autoclave. =ambin se puede efectuar limpiando la cubierta del aparato con una solución desinfectante. + continuación se coloca la placa etri en el lugar indicado del aparato de muestreo. ara mane4ar las placas etri (conteniendo ya el medio de cultivo # y el muestreador se recomienda 'acerlo con guantes estriles desec'ables. /espus de cada bloque de toma de muestras$ limpiar la cubierta del muestreador con una solución desinfectante$ teniendo la precaución de que se 'aya secado totalmente antes de tomar una nueva muestra. Me!"# e $%&'!" A*+ N%'+!'!"
*e utili,a este medio de cultivo para efectuar el conta4e de bacterias. 3na ve, tomada la muestra$ se trasladan las placas etri al laboratorio$ de4ndolas en la estufa de cultivo a BDC durante EF 'oras. A*+,S*-"%+*%
*e utili,a este medio de cultivo para efectuar el conta4e de 'ongos. 3na ve, tomada la muestra$ se trasladan las placas etri al laboratorio de4ndolas en la estufa de cultivo a %DC durante días. Re$%e'" e $"&"!*#
asado el tiempo de incubación$ se observa el crecimiento de las colonias y se procede al recuento de las mismas mediante un contador de colonias que proporciona el n-mero de colonias formadas por placa. )ste recuento es usado para calcular el n-mero de microorganismos por metro c-bico de aire. romedio de flu4o de aire (que capta el equipo *+* es de : 1FH litros por minuto 3nidades de aspiración: -
3na unidad es igual a %H segundos con un flu4o de H litros de aire.
C/&$%&"#
-
-
-
3na ve, determinado el n-mero de colonias$ y sabiendo el flu4o de aire y el tiempo de muestreo que se 'a aplicado$ se puede calcular el n-mero de unidades formadoras de colonias por metro c-bico de aire$ aplicando la fórmula siguiente: siendo:
0C: n-mero de colonias por placa 03: n-mero de unidades de tiempo empleadas en el muestreo Las cpsulas de etri una ve, llevado a cabo el recuento se retiran del laboratorio empleando un contenedor de residuos biológicos. Cuando el nD de ufcmB 'allado sea superior a HH se recomienda efectuar la identificación de los grmenes eistentes en el aire muestreado. )n ambientes considerados estriles el nD de ufcmB debe ser H.
AISLAMIENTO DE HONGOS DE FUENTES NATURALES.,
Los 'ongos son microorganismos que se encuentran normalmente en una variedad de 'bitats (suelo$ agua$ aire$ plantas$ animales$ 'ombre o sobre cualquier sustancia orgnica en descomposición# de acuerdo a las eigencias nutricionales muc'os de ellos$ es fcil que se adapten a la vida parasitaria causando enfermedades en las plantas$ animales y en el ser 'umano. )isten 'ongos que tiene 'bitats específicos: acuticos$ fitofilicos$ antropofilicos. METODOS
repara los siguientes medios de cultivo. 1. AGAR SABOURAUD GLUCOSADO • •
eptona 1H g Glucosa EH g
• •
+gar6agar F J%H g +gua destilada 1HHH mL
%. Preparación.- /isolver el agar en agua por ebullición luego agregar los dems ingredientesK a4ustar el p8 .6.. 2epartir en recipientes adecuados y esterili,ar a 1%1C por 1 minutos.. ara me4orar el medio se puede agregar B a gr. de etracto de levadura para (1HHH ml de agua#. 3. AGAR PAPA DE0TRO0A (PDA) • •
apa BHH g Glucosa %H g
• •
+gar6agar %H g +gua destilada 1HHH mL
E. Preparación .6 Las papas se cortan en cuadraditos se 'ierven en 1 litro de agua 'asta su reblandecimiento y desprendimiento de almidón$ luego se filtra a travs de varias capas de gasa. +l filtrado a5adir agar y detrosa$ 'ervir para disolver el agar$ enfriar y a4ustar el p8 entre . y .. )sterili,ar a 1%1C por 1 minutos. . AGAR ALMIDON DE ARRO2 (AAA) • •
+rro, EH g +gar6agar 1F J %H g
•
+gua destilada 1HHH mL
8ervir el arro, E a H minutos luego filtrar en un tami, de algodón o gasa. +l filtrado agregar el agar$ 'ervir y completar el volumen. + a4ustar el p8 entre . y .. )sterili,ar a 1%1C por 1 minutos. .
Preparación .6
4. AGAR PAPA 2ANAHORIA • • •
apa 1H g Mana'oria 1H g Glucosa %H g
• •
+gua destilada 1HHH mL +gar6agar %H g
F. 5.
1H. CUESTIONARIO 1. Indicar cual es el n-mero aceptable de bacterias y 'ongos en ambientes cerrados como 'ospitales$ aulas$ y laboratorios. %. )plique sobre otros mtodos que se usa $ para el control de calidad de +ire. B. 8aga una lista de bacterias y 'ongos presentes en diferentes tipos de ambiente: +ulas$ laboratorios$ mercados$ 'ospitales$ oficinas y otros y el n-mero aceptable de cada uno de ellos. 11. 1%. 1B. 16. UNIVERSIDAD CATOLICA SANTA MARIA 1. PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL 1. CURSO: MICROBIOLOGIA AMBIENTAL 14. 17. PRACTICA N°18 15. 89. BIODEGRADACION DE PETROLEO %1. (II PARTE)
%%. %B. )l e'+;&e" ( @aceite de roca@# es una me,cla 'omognea de compuestos orgnicos$ principalmente 'idrocarburos insolubles en agua. =ambin es conocido como e'+;&e" $+%" o simplemente $+%". *e produce en el interior de la =ierra$ por transformación de la materia orgnica acumulada en sedimentos del pasado geológico y puede acumularse en trampas geológicas naturales$ de donde se etrae mediante la perforación de po,os. %E. )n condiciones normales es un líquido bituminoso que puede presentar gran variación en diversos parmetros como color y viscosidad (desde amarillentos y poco viscosos como la gasolina 'asta líquidos negros tan viscosos que apenas fluyen. )stas variaciones se deben a la diversidad de concentraciones de los 'idrocarburos que componen la me,cla. %. )s un recurso natural no renovable y actualmente tambin es la principal fuente de energía en los países desarrollados. )l petróleo líquido puede presentarse asociado a capas de gas natural$ en yacimientos que 'an estado enterrados durante millones de a5os$ cubiertos por los estratos superiores de la corte,a terrestre. %. )l petróleo est formado principalmente por 'idrocarburos$ que son compuestos de 'idrógeno y carbono$ en su mayoría parafinas$ naftenos y aromticos. Nunto con cantidades variables de derivados saturados 'omólogos del metano (C8E#. *u fórmula general %. )l crudo de petróleo se caracteri,a por ser un líquido negro$ viscoso y con una composición química sumamente comple4a$ pudiendo contener miles de compuestos$ bsicamente de la familia de los 'idrocarburos. %F. %O. Los 'idrocarburos componen la familia predominante de compuestos (un H6OFP de la composición#$ por lo que constituyen uno de los grupos de contaminantes ambientales ms
importantes$ tanto por su abundancia$ como por su persistencia en distintos compartimentos ambientales. BH. +dems de 'idrocarburos$ el petróleo contiene otros compuestos que se encuentran dentro del grupo de orgnicos$ entre los que destacan sulfuros orgnicos$ compuestos de nitrógeno y de oígeno. =ambin 'ay tra,as de compuestos metlicos$ tales como sodio (0a#$ 'ierro (?e#$ níquel (0i#$ vanadio ("# o plomo (b#. +simismo$ se pueden encontrar tra,as de porfirinas. B1.
B%. BB. BE.
B. B. B. 37. B!"++e
EH. La biorremediación es la adición de materiales a ambientes contaminados para pr od uc ir un a ac el er ació n del pr oc eso na tur al de bi ode gr ada ci ón . E1. E%. La elevada comple4idad de la composición del crudo de petróleo y derivados$ implica la eistencia de una amplia capacidad en,imtica si se quiere conseguir una degradación significativa del crudo. EB. EE. La mayor parte de los estudios reali,ados se 'an llevado a cabo con cepas bacterianas individuales o con la combinación de diferentes cepas aisladas. E. E. )n la mayoría de los casos$ son degradadoras de alcanos$ debido a que los alcanos son los componentes ms abundantes del crudo de petróleo. 0o obstante en algunos casos$ estas cepas tienen la capacidad de oidar selectivamente las cadenas alquílicas de ciertos 8+s alquilados$ compuestos abundantes en el crudo. E. EF. La alternativa a la utili,ación de cepas individuales es la obtención y utili,ación de cultivos mitos$ los cuales pueden ser consorcios definidos y consorcios no definidos. EO. Los consorcios definidos se caracteri,an por ser una combinación de cepas aisladas con capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre sí. H. Los consorcios no definidos se caracteri,an por ser el resultado de procesos directos de enriquecimiento a partir de muestras ambientales con 'istoria previa de contaminación y por lo tanto no son el resultado de una combinación de cepas previamente aisladas. 1. %.
B.
E.
. . .
F. O. H. 1. BACTERIAS DEGRADADORAS DE PETROLEO
%. B. . . O. 1. B. . . O. F1. FB. F. F. FF. FO.
+cinetobacter +ctinomyces +lcaligenes +rt'robacter 7acillus 7enecQea +c'rornobacter 7revebacterium Coryneformes )rRinia ?lavobacterium Slebsiella
E. Lactobacillus . Leumt'ri F. !oraella H. 0ocardia %. eptococcus E. seudomonas . *arcina F. *p'erotilus FH. *pirillum F%. *treptomyces FE. "ibrio F.
59. HONGOS DEGRADADORES DE PETROLEO
O1. O%. 8ongos degradadores de / OE. +llesc'eria O. +spergillus OF. +ureobasidium 1HH. 7otrytis 1H%. Candida 1HE. Cep'alosporium 1H. Cladosporium 1HF. Cunning'amella 11H. /ebaromyces 11%. ?usarium 11E. Gonytric'um 11. 8ansenula 11F. 8elmintrosporium 1%H. !ucor 1%%.
OB. >idiodendrum O. aecylomyses O. 'ialop'ora OO. enicillium 1H1. 2'odosporidium 1HB. 2'odotorula 1H. *acc'aromyces 1H. *acc'aromycopisis 1HO. *copulariopsis 111. *porobolomyces 11B. =orulopsis 11. =ric'oderma 11. =ric'osporon 11O. 1%1.
183.
1%E. La acumulación de contaminantes genera la dispersión de estos compuestos en el aire$ el suelo$ las aguas superficiales$ con la consecuente filtración de los mismos 'acia las aguas subterrneas$ que constituyen la reserva de agua para consumo 'umano. 18.
=C;<" #e %ee #"&%$!"*+ e#'e +"-&e<*>
1%. 3na respuesta a esta pregunta es la remediación$ que consiste en el uso de procesos de degradación$ biológicos o químicos$ para eliminar sustancias contaminantes que 'an sido vertidas en el medio ambiente.
1%. M!$+""+*!#<"# ?%e &!<!* e&
1%F. )n sus procesos metabólicos$ los microorganismos transforman los nutrientes que obtienen del ambiente en sustancias ms simples$ y en este proceso obtienen materia y energía que utili,an para su subsistencia. )l 'ombre 'a aprendido a aprovec'ar estos procesos metabólicos de los microorganismos para obtener diferentes productos de utilidad. /e esta forma$ los microorganismos que pueden degradar compuestos tóicos para el ambiente y convertirlos en compuestos inocuos o menos tóicos$ se aprovec'an en el proceso de biorremediación. )isten$ por e4emplo$ microorganismos capaces de nutrirse a partir de 'idrocarburos$ detergentes o bifenilos policlorados$ de manera que su metabolismo los convierte en productos inocuos para el medio ambiente. La gran diversidad de microorganismos eistente ofrece muc'os recursos para limpiar el medio ambiente y$ en la actualidad$ esta rea est siendo ob4eto de intensa investigación. *e 'an aislado de la naturale,a varios tipos de microorganismos que consumen vertidos de petróleo y otras sustancias tóicas
185.
139.
De#*++"&&"# *$'%*&e# @ %'%+"#
1B1. + continuación se mencionan algunos de los desarrollos biotecnológicos que se estn llevando a cabo para el me4oramiento de los microorganismos empleados en la biorremediación: 1B%.1BB. 7acterias Pseudomonas transgnicas que son capaces de degradar compuestos tóicos T que contienen cloro (como el vinilcloruro# en compuestos menos nocivos. 1BE.1B. 7acterias capaces de degradar algunos de los componentes del petróleo$ con la T perspectiva de llegar a conseguir microorganismos que$ liberados en una marea negra$ limpien el agua contaminada. 1B.1BF. 7acterias capaces de reducir las formas altamente tóicas de mercurio en otras menos T tóicos y voltiles. 1EH.1E1. 7acterias que transforman metales del suelo en formas menos tóicas o insolubles. or T e4emplo: la reducción de cromo (Cr#. 1E%.1EB. !icroorganismos capaces de degradar =0=$ un eplosivo de gran potencia y muy T agresivo para el entorno. 1E.1E. 7acterias que pueden eliminar el a,ufre de los combustibles fósiles$ como en el caso T del carbón o del petróleo$ con el fin de favorecer combustiones ms limpias. 1EF.1EO. La utili,ación de la bacteria Deinococcus radiodurans para eliminación de elementos T radiactivos presentes en el suelo y aguas subterrneas. )ste microorganismo es un etremófilo que resiste condiciones etremas de radiación$ sequedad$ agentes oidantes y diversos compuestos mutagnicos. 1H.11. Cianobacterias a las que se le 'an introducido genes de bacterias Pseudomonas con T capacidad de degradar diferentes 'idrocarburos o pesticidas. 1B.1E. 7acterias transgnicas que se usan para etraer metales valiosos a partir de residuos de T fbricas o de minas$ o para eliminar los vertidos de petróleo$ o el sulfuro causante de la lluvia cida que producen las centrales energticas de carbón. 1. 1.
1.
MATERIALES
• • • • •
lacas etri de +gar 78I con diferentes concentraciones de petróleo. +sa y porta6asa microbiológica !ec'ero ruebas bioquímicas Coloración de Gram !icroscopio
1F. 15. •
•
PROCEDIMIENTO
Lectura de los caracteres macroscópicos de las colonias de bacterias desarrroladas en la placa. Lectura de las características microscópicas de cada una de las bacterias desarrolladas en cada medio
19. 11. 18.
EJEMPLO DE RESULTADOS PARA LA IDENTIFICACION DE BACTERIAS
1B.
1E. 7ac illus spp
1.
1. !o rfologia
1F. 7ac ilos cortos$espo racentral nodeforma nte 1%.
1O.
1B.
1. itivo
1. itivo
11. /is posicion 1. =in cion G2+! 1O. Cat alasa 1FB. Cre cimiento en caldo 1F. 2e ducción de 0>B 1O1. >? Glucosa 1O. 2o4 o !etilo 1OO. " %HB. 8id rólisi de
os
1FH. os itivo 1FE. elí cula$ turbide, y crecimiento 1FF.
1FO.
1F%. os itivo 1F. elí cula$ turbide, y crecimiento 1OH.
1O%.
1OB.
1OE.
1O.
1O.
1OF.
6
%H1. %H.
%H%. %H.
6 U
%HH. %HE.
U U
1F1.
os
1. se udomona spp. 1H. 7ac ilos medianos no esporulado s 1E. +is lados de ados 1F. 0e gativo
1F.
almidón %H. Ind ól %11. Cal do Glucosa %1. Cal do !altosa %1O. 8id rVlisis de gelatina %%B. %%E. 88.
%HF.
6
%HO.
%1H.
%1%.
U
%1B.
%1E.
%1.
U
%1.
%1F.
%%H.
U
%%1.
%%%.
CUESIONARIO
1 8aga una relación de microorganismos con los que se 'aya traba4ado en petróleos en el er-. % )plique que microorganismos se aislaron y cuales sirven para la biorremediación. B )plique sobre otros mtodos que se use para la degradación de petróleo e indique los beneficios y desventa4as de cada uno de ellos. E )plique a que se refiere la acción emulsificante de las bacterias degradadoras de petróleo. )plique a que se refiere la actividad degradativa de las cepas bacterianas de petróleo. %%. 227.
