INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES MONTERREY CAMPUS ESTADO DE MÉXICO
Práctica IV Amplifcaci! "# $! %#! #$cari&!t# p&r la t'c!ica "# PCR La(&rat&ri& La(&rat&ri& "# I!%#!i#r)a G#!'tica Gr$p& * M+ #! C+ A!a La$ra T&rr#, -$#rta Equipo 5 Xochitl Citlalli Romo Sandoval A01163289 Elia Arena Cru! A01163232 "ario Al#ono Arena $arc%a A01162581 &2012
Introducción
La PCR (reacción en cadena de polimerización, por sus siglas en inglés) es un método que permite la amplificación exponencial del AD! consiste en la separación del AD por medio del calor para que pueda ser copiada por el AD polimerasa " el proceso se repite cuantas #eces se desee$ Al %acer la PCR, se requiere de un primer " de una DA polimerasa adecuada para lo que se desea o&tener$ Como tal, son necesarios dos primers (para cada cadena) que flanqueen la secuencia deseada! si se desea %acer amplificación selecti#a, es recomenda&le tener un poco de la información de la secuencia, " se agregan en exceso para que no se detenga el proceso$ 'n cuanto al DA polimerasa, ésta de&e resistir al calor para e#itar que se desnaturalice " que se agregue constantemente al proceso! por lo general se usa a Taq polimerasa (pro#iene de Thermus aquaticus) "a que se puede dear por mltiples ciclos sin cam&iarlo$ *+ 'n s-ntesis, el proceso ocurre de la siguiente forma *./ i$ ii$ iii$ i#$
0e agrega AD deseado " los componentes de la reacción (se mezclan &ien desde un inicio) 0e calienta a 123C para desnaturalizar el AD Conforme la temperatura &aa, los primers se %i&ridan en sus secuencias indicadas " Taq pol$ inicia el copiado de las cadenas templado 0e completa el ciclo " nue#amente se repite, iniciando en el paso i$
's importante destacar que si %a" trazas diminutas de contaminación en la muestra, puede que se pueda arruinar el experimento como tal "a que su finalidad es ampliar la cantidad de AD presente! por lo que es necesario que se lle#e a ca&o con particular limpieza " con cuidado$ 4a" mltiples #ariaciones del PCR, que se detallan a continuación/ Anidada (Nested ) 0e utilizan dos sets de primers! el primero genera un producto normal de PCR mientras que el segundo se encuentra m5s 6adentro7 de este producto (por eso se denominan internos o nested ) " éstos generean un producto m5s corto$ 'sta PCR aumenta la sensi&ilidad " la especificidad de la reacción, esto es de&ido a que con un solo ciclo no se puede o&tener un producto nico (aquél que contiene el fragmento correcto de AD que tiene los sitios de %i&ridación para el segundo par de primers) "a que se parte de un molde compleo$ *8 9ranscriptasa Re#ersa
@igura +$ ested PCR
La técnica de transcriptasa re#ersa de PCR permite la amplificación de moléculas de mAR en forma de AD complementario (cDA)$ 'ste método se utiliza principalmente para la detección de #irus como el de la :nmunodeficiencia 4umana o el de la 4epatitis C$ *; La detección de mRA permite el an5lisis de microorganismos as- como el estudio de la expresión génica en células %uéspedes %umanos$ 9am&ién se usa para la s-ntesis de cDA se requiere de d9Ps, un &uffer, 9aq polimerasa, primers, la enzima transcriptasa re#ersa " un molde de RA$ La reacción es calentada a 8<= C, lo que permite que la enzima de la transcriptasa re#ersa tra&ae " se efecte la producción del cDA$ Después de la s-ntesis de la primera %e&ra, se realiza una PCR tradicional para la amplificación del producto del cDA$ Posteriormente, el AD de do&le cadena se amplifica de manera tradicional$ *> ?ltiple
'l método de la PCR mltiple amplifica simult5neamente en un nico tu&o distintas secuencias espec-ficas$ 0e utiliza para la detección de patógenos mltiples en una reacción nica, esto se logra a tra#és de #arios ce&adores, puesto que cada uno se dirige a un patógeno diferente$* 's necesario tomar en cuenta para el diseBo de primers que éstos no interaccionen entre s-, que funcionen a temperaturas similares " que los amplicones generados sean de tamaBos distintos para que después de la amplificación puedan ser separados " diferenciados$ Las limitaciones de la PCR mltiple se relacionan con las posi&les interacciones entre los diferentes primers$ *< 4ot 0tart La técnica de 4ot 0tart PCR in%i&e la acti#idad de la polimerasa durante la preparación de la reacción de la PCR, ésta comienza cuando la temperatura de la mezcla es alta para que de este modo no se produzcan %i&ridaciones inespec-ficas$ * Los métodos que permiten la acti#ación de las DA polimerasas inclu"en modificaciones qu-micas, f-sicas, unión a anticuerpos entre otros$ PCR de colonia Para la PCR de una colonia &acteriana se sigue el mismo protocolo que un PCR con#encional, sin em&argo, en esta técnica se utiliza una fracción de una colonia &acteriana en lugar del AD templado, para esto se %ace uso de una micropipeta$ La colonia &acteriana utilizada no tiene la necesidad de crecer en un medio " se a%orra tiempo pues los pl5smidos no requieren ser purificados$ *1 Polymerase cycling assembly
La técnica de Polymerase cycling assembly (PCA) permite la s-ntesis artificial de estructuras largas de DA$ Del mismo modo que en la PCR tradicional, se diseBan primers para la s-ntesis, sin em&argo, en este método los oligonucleótidos tienen longitudes de >2 p& para asegurar una correcta %i&ridación$ *+2 9iempo Real no de los incon#enientes de la PCR con#encional es que carece de ser una técnica cuantitati#a, por lo que para solucionar esta limitante se %a desarrollado una #ariación conocida como PCR en tiempo real$ 'sta #ariación consiste en detectar en tiempo real la amplificación de nuestra muestra de interés$ *++ La técnica consiste en utilizar una sonda complementaria que lle#e ad%erida una molécula fluorescente " otra molécula que in%i&a esta fluorescencia$ La molécula fluorescente se li&era cuando la sonda es desplazada por la DA polimerasa " a su #ez emite fluorescencia al ser detectada por un l5ser$ 0e lle#a a ca&o una cuantificación de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de PCR, la cual se cuantifica de manera proporcional a la cantidad de DA amplificado$ *+. 's importante mencionar que la cuantificación requiere de una cur#a patrón para conocer la cantidad total de DA amplificado$ Droplet digital
Etra #ariante de la PCR con#encional es llamada Droplet Digital PCR , esta técnica consiste en una partición de la muestra en miles de gotas en tamaBo de nanolitros$ na #ez o&tenida la partición en miles de gotas (aprox$ .2,222 gotas por cada .2 microlitros de muestra), se realiza una PCR en termociclador! finalmente un softFare especializado registra la fluorescencia emitida mediante detección de dos colores para determinar gotas positi#as (secuencia blanco) " negati#as$ La fracción de gotas positi#as permite determinar la concentración de DA blanco en la muestra por cada microlitro$ *+8
'n esta pr5ctica se reporta la amplificación de un gen 0cRad>+, de una muestra de DA de E. coli " de una muestra de le#adura mediante la técnica de PCR con#encional! para finalmente realizar un an5lisis de los resultados en gel de agarosa$
Objetivos
Comprender los mecanismos para %acer los c5lculos de ?:G, aplicar una técnica de PCR para amplificar un gen eucarionte " finalmente analizar el producto de PCR en gel de agarosa$
Cuestionario
+$ Cantidad requerida de AD templado (genómico, pl5smico " cDA) para realizar la PCR$ *+ *. H AD genómico/ 2$> H +$2 mg H AD pl5smico/ +$2 I .$2 ng H cDA/ .2 I .> Jg .$ Caracter-sticas de la 9aq polimerasa utilizada en la pr5ctica (Kit 9aq pol$ :n#itrogen Cat$ +++>) 0e utiliza en la PCR "a que su acti#idad es esta&le a temperaturas altas (1>3C)$ 0us propiedades son *8/ • • •
p$4 óptimo de 1 Acti#idad #olumétrica/ > Jl 9ermoesta&ilidad/ retiene 2M de su acti#idad enzim5tica después de 82 ciclos
8$ NPara qué sir#e #ariar las caracter-sticas que de&en cumplir los primers para considerarse en su diseBoO ?gCl. es un coHfactor para el AD pol$! entonces su #ariación en concentraciones influ"e muc%o en la PCR$ ?u" poco magnesio causa que %a"a poco o nada de producto PCR! demasiado ?g . promue#e el apareamiento erróneo de &ases$ 0e de&e de encontrar un punto óptimo$ *; ;$ NCu5les son las caracter-sticas que de&en cumplir los primers para considerarse en su diseBoO *> H Dentro de +H82 &p en longitud, con MQC de entre ;2 " 2 H '#itar usar primers con 9m ma"or a >H<23C (particularmente cuando los templados tengan muc%as QC) Al diseBar un primer, tam&ién se considera lo siguiente/ H 'legir un sitio para el primer a una distancia ma"or de >2 nucleótidos de la posición donde la nue#a secuencia se requiere H '#itar aquellos que usan regiones de &aa calidad de secuencia H '#itar sitios que presentan m5s del 12M de identidad con el sitio primario o que tiene unión con m5s de siete nucleótidos consecuti#os en 87
Metodología
Descongelar DA
R Posteriorment e colocar en %ielo$
Descongelar &uffer +2G " ?gCl.
Realizar reacciones para/
Poner reacciones en termociclador
R La enzima se sacar5 %asta el momento de utilizarse$
+$ Control positi#o (pl5smido que contiene 0cRad>+) .$ Control negati#o (DA de &acteria) 8$ ?uestra pro&lema (DA de 0acc%arom"ces cere#isiae)
Preparar 8 Programar con mezclas S?ixS condiciones para gen en RcRad>+ tu&o eppendorf (2$ mL) Visualizar los productos en un gel de agarosa 2$M H9T' 2$>G
?gCl., Tuffer PCR +2G, d9Ps mix, Eligo @, Eligo R, 9aq Polimerasa, 4.E T?, DA U C5lculos de cantidades para mezcla se encuentran posteriormente en este reporte$
tilizar marcador de peso molecular Condiciones de corrimiento/ +22V por ;> min$
Analizar en transiluminador
Documentar la imagen$
Quardar el producto de PCR a H.23C
Resultados
123*4
*5
*0
**
.
/
Pb
+.222
+>2 +222 >22
822
Pozos correspondientes al 'quipo >$ +$ ?arcador + K& Plus (> WL) .$ Pl5smido que contiene el gen 0cRad>+ (control ) ( WL) 8 WL de L$T$ ;$ DA de &acteria E. coli (control H) ( WL) 8 WL de L$T$ $ DA de le#adura Saccharomyces cerevisiae (muestra) ( WL) 8 WL de L$T$ +< " +$ Resto del pl5smido (;. WL) < WL de L$T$
C5lculos para o&tener mezcla mix de reacción/ Reactivo
DA ?gCl. (>2m?) Tuffer PCR +2G d9Ps mix +2 m? Eligo @ (+2 J?)
1X
3X
+$2 JL +$> JL >$2 JL +$2 JL +$2 JL
Concentración final
HH ;$> JL +> JL 8 JL 8 JL
HH +$> m? +G 2$. m? 2$. J?
Eligo R(+2 J?) 9aq Polimerasa 4.E T? Volumen total de reacción/
+$2 JL 2$. JL 81$8 JL >2 JL
8 JL 2$ JL UU+.>$< JL +>;$ JL 8 X >+ JL ctu&o ep$
2$. J? c&p >2 JL
UU 0e agregan 2$. #olmenes adicionales de agua grado Tiolog-a ?olecular$ H 'n los pozos +, +< " +! se o&ser#a una &anda del tamaBo de +.;2 p&$
Discusión
Goc%itl Romo La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de amplificación de nucleótidos de una secuencia &lanco$ 0e fundamenta principalmente en la capacidad de amplificación de la DA polimerasa, iniciando la replicación del DA templado gracias al uso de primers espec-ficos$ Al realizar la técnica de PCR se de&en tener ciertos cuidados$ De&emos conocer parcialmente la secuencia de nuestro DA templado para poder diseBar l os primers espec-ficos$ 'n cuanto a los primers, para su diseBo, se de&en tener en cuenta los siguientes factores/ de&en ser ricos en contenido QHC, aprox$ el >2M para que sean esta&les, tener entre +1 " .> nucleótidos de longitud, de&en ser complementarios a las regiones deseadas, su 9m de&e ser similar a la de la muestra de DA " no de&en formar d-meros entre el primer or!ard " Reverse, ni formar %orquillas entre s-$
Al utilizar d9Ps se de&e tomar en cuenta la concentración apropiada de ?gCl .! pues los d9Ps ligan ?g " a ma"or cantidad de d9Ps, menor cantidad de ?g li&re$ De preferencia la polimerasa utilizada en PCR de&e tener acti#idad polimerasa >7H87 " acti#idad exonucleasa >7H87 , 87H>7 para corrección! adem5s de&e soportar la temperatura a utilizar en el termociclador$ Etro punto a mencionar es la elección de &uffer! éste de&e ser el óptimo para funcionar como medio de reacción en la técnica de PCR$ Las temperaturas en la PCR son mu" importantes para lograr con éxito la amplificación de la muestra$ 'n el caso de esta pr5ctica se utilizó una temperatura de 1;3C para desnaturalizar las cadenas de DA, en seguida se programó una temperatura de ><3C para permitir la alineación de primers " finalmente se utilizó una temperatura de <.3C para permitir que la polimerasa amplifique óptimamente la secuencia &lanco$ 'n el proceso de amplificación es importante comprender que es a partir de 8er ciclo que "a se comienza a tener la amplificación de la secuencia de interés! entonces o&tenemos que el nmero de copias ser5 igual a . ( nm$ de ciclos)$ La cantidad de DA templado necesario para la PCR #ar-a dependiendo de si se trata de DA genómico o de pl5smido$ 'n el caso de DA de pl5smido, por lo regular se requieren cantidades de
aprox$ +H. ng, mientras que la cantidad de DA genómico necesario es de aproximadamente +22H>22 ng$ 'sta #ariación se de&e a que el DA genómico es m5s grande que el plasm-dico! " se sa&e que colocar poca cantidad de DA plasm-dico no afectar5 la amplificación, pues %a" &ao -ndice de error de la polimerasa al tener menor cantidad de p&$ 'n el caso de nuestros resultados de amplificación por PCR o&ser#amos claramente nuestro marcador de peso molecular$ 'n el pozo Y. utilizado como control positi#o, colocamos la muestra del pl5smido que contiene el gen 0cRad>+ " o&ser#amos una &anda definida de aproximadamente +.>2 p&! lo cual indica que la amplificación se lle#ó a ca&o correctamente, pues o&tu#imos un producto espec-fico$ 'n nuestro pozo Y;, colocamos nuestro control negati#o, producto de PCR de DA de &acteria$ 'n este pozo no o&ser#amos ninguna &anda! lo cual es correcto pues nuestros primers esta&an diseBados para amplificar secuencias espec-ficas para le#adura Saccharomyces cerevisiae, m5s no para secuencias de &acteria E. coli $ 'n nuestro pozo Y, se colocó el DA de la le#adura Saccharomyces cerevisiae" la cual fue nuestra muestra amplificación de PCR$ o o&ser#amos ninguna &anda en la fotograf-a del gel en este pozo$ De&imos de %a&er o&tenido una &anda definida, pues los primers esta&an diseBados para amplificar un gen 0cRad>+ que se encuentra en le#adura$ Definiti#amente no se o&ser#ó la amplificación en la muestra, "a que no o&tu#imos una &anda en n uestro pozo$ 's pro&a&le que la amplificación no se %a"a lle#ado a ca&o exitosamente de&ido a que el DA templado se encontra&a "a degradado, lo que ocasionó que los primers se alinearan correctamente, " a su #ez que la polimerasa no iniciara la replicación$ Etra pro&a&le causa de esta falta de amplificación es que el DA templado %a"a estado contaminado con prote-nas, sales o fenol! "a que la presencia de estos compuestos afecta el desarrollo de la técnica de PCR$ 'xiste tam&ién la pro&a&ilidad de que los primers diseBados para la amplificación no fueran capaces de reconocer el templado de DA de le#adura "a que tal #ez existe una mutación en la región de reconocimiento " de esta forma no se logró la %i&ridación DA I primer$ 'lia Arenas PCR son las siglas en inglés de Pol"merase C%ain Reaction, un método que permite amplificar un fragmento de DA utilizando una polimerasa que tra&aa a temperaturas ele#adas$ Para esto, es necesario un molde de DA, polimerasa, un &uffer, oligonucleótidos, d9Ps para simular lo ocurrido en las células para la s-ntesis de AD$ 'l termociclador permite aumentar la temperatura primero a 1>=C, a la cual la do&le cadena de la molécula consigue romper sus puentes de 4idrógeno para desnaturalizarse$ Posteriormente, la temperatura se austa a entre ;2= " 2=C a la cual se alinean los oligonucleótidos para que en seguida la polimerasa sintetice en sentido >7H87$ La temperatura se aumenta a <.=C "a que as- la polimerasa alcanza su acti#idad m5xima continu5ndose as- la s-ntesis de los fragmentos de AD$ Con cada ciclo, la cantidad de fragmentos con el tamaBo esperado aumenta$ Para una &uena reacción de PCR, es importante considerar la calidad de la extracción de DA, "a que es importante que éste no se encuentre contaminado con prote-nas o con una sustancia que in%i&a la reacción de PCR$ 'n el caso de nuestra muestra, influ"e en el resultado final el %ec%o de que no utilizamos Rasas durante la extracción del material genético de la le#adura$ Para la PCR tam&ién %a" que considerar las concentraciones de magnesio usadas pues la polimerasa necesita iones de magnesio para su correcto funcionamiento$ A su #ez, una alta concentración de d9Ps puede in%i&ir la reacción "a
que atrapa el magnesio requerido por la polimerasa$ 'l &uffer permite regular las condiciones de p4, tomando en cuenta las caracter-sticas de la polimerasa utilizada$ Los oligonucleótidos tam&ién de&en ser re#isados para descartar degradado, un mal diseBo o que la cantidad usada no sea la correcta$ Los primers tienen entre +1 " .>p&, siendo éstas complementarias a las secuencias que se desean amplificar, as- como es importante un alto contenido en QHC para garantizar su esta&ilidad$ Por otro lado, la cantidad de AD templado requerido para la realización de la PCR #ar-a dependiendo si es AD genómico pues son requeridos entre +22H>22 ng mientras que para el pl5smido se necesitan entre +H. ng$ 'sto se de&e a que el pl5smido contiene menor cantidad de material genético$ 'n el primer pozo colocamos un marcador de peso molecular que arroo &andas definidas$ Para la PCR, se utiliza un control negati#o que permite monitorear contaminación, en nuestro caso utilizamos +Jl de AD &acteriano, el cual no presento ningn patrón de amplificación, lo cual se apega a lo esperado "a que los primers utilizados sólo permit-an la amplificación de secuencias de le#adura, no de &acteria$ 'n el control positi#o utilizamos una muestra de pl5smido que conten-a el gen 0cRad>, en la que o&ser#amos una &anda definida sa&iendo que lo esperado era un producto espec-fico$ 'n el ltimo pozo, colocamos una muestra de Saccharomyces cerevisiae que %a&-amos extra-do en una pr5ctica anterior$ Lo que o&ser#amos en el gel de agarosa fue la ausencia de una &anda que indicara la amplificación del fragmento$ De %a&er tenido una meor calidad de muestra, la amplificación no se %u&iera #isto in%i&ida$ Del mismo modo, pudo %a&er errores en el protocolo de realización d e la PCR, como la omisión de algn reacti#o o equi#ocaciones en la adición o medición de algn reacti#o$
?ario Arenas 'l fundamento de la PCR es esencialmente la s-ntesis de grandes cantidades de una región espec-fica del AD, por medio del uso de DA pol$ termoesta&les " un molde de AD con la secuencia deseada$ 'l producto puede ser analizados en gel agarosa o con la digestión de enzimas de restricción para clonar, secuenciar o %acer el 6#ingerprint 7$ *+ La PCR es una %erramienta de muc%a utilidad en la ingenier-a genética! sin em&argo, es suscepti&le a una #ariedad de factores, como lo puede ser *./ •
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•
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Limpieza/ el método detecta una sola molécula de AD, por lo que si presenta contaminación puede que influ"e considera&lemente en el resultado final$ 'sto inclu"e usar soluciones espec-ficamente para el proceso " usar mltiples reacciones de control para poder #erificar resultados$ Compuestos qu-micos/ es importante la integridad " pureza del molde de AD " el diseBo del primer$ Los meores primers tienen entre +.H8; &p sin estructuras secundarias con una distri&ución &alanceada entre QHC " AH9 " que no tienen complementariedad en los e xtremos 87$ Reacción mezcla/ el escoger una DA pol$ afecta la fidelidad de la reacción " la calidad del producto$ 'n muc%os la&oratorios se %a sustituido 9aq pol$ por enzimas con ma"or fidelidad$ A su #ez, la concentración de ?gCl . influ"e la PCR "a que es coHfactor de la enzima$ Por otro lado, se de&e agragar cantidades iguales de d9Ps " algunas sustancias pueden afectar la eficiencia de la reacción$ 9ipo de termociclador/ la precisión #aria entre cada uno! puede que no mantengan del todo las condiciones deseadas$
•
Condiciones del ciclo/ el paso inicial para la desnaturalización de&e ser lo suficiente como para poder romper los lazos entre las cadenas de AD " los ciclos de&en ser lo suficientemente largos como para poder e#itar que se reHnaturalice$
n elemento importante a considerar en la PCR son las temperaturas a las cuales ocurren los pasos$ La desnaturalización ocurre a temperaturas ma"ores a 12=C (1.=CH1;=C) " es por un periodo corto (menor a + min)$ La %i&ridación ocurre a >=C de&ao de la temperatura de fusión ( melting ) de los primers, el cual ocurre t-picamente entre ;>3C a >>=C$ 0i es mu" alta la temperatura entonces los primers no se %i&ridan adecuadamente mientras que si es mu" &aa entonces se unen de forma no espec-fica$ @inalmente, en la extensión, al usar Taq pol$ su temperatura óptima es de <>=CH2=C! este puede cam&iar dependiendo de la polimerasa que se emplea$ *8 Con respecto a las concentraciones requeridas para las cantidades de AD molde, se o&ser#a lo siguiente *; *>/ • • •
AD genómico/ 2$> H +$2 mg AD pl5smico/ +$2 I .$2 ng cDA/ .2 I .> Jg
Las cantidades #ar-an dependiendo de una #ariedad de factores! tales como lo puede ser la calidad del AD (si esta degradado o no), su tamaBo o sencillamente por el tamaBo del producto de PCR deseado$ * 'n el gel electroforesis que se realizó con el producto de la P CR! solo se o&ser#ó la de la Reacción + (R+), la cual era el control que conten-a el pl5smido con el gen deseado$ 9anto la Reacción . (R.) que conten-a el AD de la &acteria " la Reacción 8 (R8) que conten-a la muestra con la PCR no se o&ser#aron so&re el gel de agarosa$ R+ era el control positi#o " R. el control negati#o! el primero permite o&ser#ar como se #er-a el producto de la PCR "a que contiene el gen deseado (0cRad>+) mientras que el segundo era AD de &acteria de la pr5ctica pre#ia (no conten-a nada)$ ?ientras R+ apareció en el gel, R. no! por lo que puede asumirse que el AD de la &acteria esta&a sumamente degradado " no se retu#o en el gel$ 'rrores con respecto a la cantidad del loading bu##er es desprecia&le "a que se agregó la misma cantidad para las tres R (8 Jl) " se o&ser#ó R.$ Con respecto a R8! puede %a&er una #ariedad de factores que influ"en en el %ec%o de que no %a"a aparecido en el gel electroforesis/ •
•
0e encontra&a sumamente degradado o presenta&a contaminantes que imped-a que se uniera adecuadamente los primers$ Los primers no se diseBaron adecuadamente " sencillamente no se %i&ridaron con el AD, el cual no permit-a o&tener un producto de PCR en los siguientes pasos
De esto! es m5s facti&le que %a"a sido por algn pro&lema con relación al AD, "a que en la segunda pr5ctica se %a&-a esta&lecido que el AD de le#adura presenta&a contaminantes de AR " prote-nas$ 'stos pudieron %a&er afectado la reacción como tal$ Por otro lado, el proceso mismo pudo %a&er afectado el resultado final! no o&stante, se realizó con los esta&lecimientos indicados " es dif-cil que %a"a influido so&re ello$
Conclusiones
Goc%itl Romo 0e o&ser#ó una &anda &ien definida correspondiente a la muestre del gen 0cRad>+, por lo que éste se amplificó correctamente$ o se o&ser#ó ninguna &anda correspondiente a la muestra de DA de le#adura, por lo que ésta no se amplificó$ 0e necesitó de un control negati#o en esta pr5ctica, por lo tanto se utilizó DA de &acteria que no contiene el gen a amplificar$ 's importante que la polimerasa soporte las temperaturas a las cuales se programa el termociclador, por lo que para esta pr5ctica se utilizó 9aq Polimerasa para la amplificación$ 0e diseBaron primers espec-ficos para un gen, por lo tanto el producto de PCR fue la amplificación del gen llamado 0cRad>+$ La calidad del DA templado de le#adura era mala, por lo tanto no se o&ser#ó amplificación por la técnica de PCR$
'lia Arenas o %u&o amplificación en la muestra de Saccharomyces cerevisiae de&ido a posi&les errores en la adición de reacti#os o a la contaminación de la muestra como resultado de la extracción de la misma$ 'l control positi#o presentó &andas espec-ficas, as- como se espera&a mientras que el control negati#o no fue amplificado pues los primers no esta&an diseBados para ese propósito$ Para la PCR, se requiere de una enzima que tra&ae a las temperaturas ele#adas utilizadas en cada ciclo de la reacción$ Del mismo modo, es importante el diseBo de primers adecuados que permitan el inicio de la amplificación$
?ario Arenas o se realizó exitosamente la PCR, puesto a que el producto presente en el AD de la le#adura no se encontra&a presente en el gel de agarosa, denotando que el éste se encontra&a o degradado o contaminado con prote-nas "o AR$ De manera similar, este resultado se o&ser#o con el control negati#o R., por lo que puede denotar que éste a su #ez esta&a degradado$ Por otro lado, los factores que influ"en en la PCR son de suma importancia "a que si son controlados de una forma adecuada el producto final que se o&tiene es de ma"or calidad! al igual que diseBar primers adecuados " utilizar una DA pol$ que se adecue a lo que se desee %acer$
Fuentes de inforación
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Fuentes de cuestionario
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