Laboratorio de Farmacología 1 Practica 5: ‘Determinación Experimental De La Dosis Efectiva 50 Sedante En Ratones’
OBJETIVOS
Determinar la DE50 para el efecto sedante del pentobarbital y etanol en ratón, utilizando el modelo del cilindro de Exploración en ratones. Aplicar los conocimientos que obtuvimos en la primera practica. Calcular la potencia relativa
HIPÓTESIS •
•
Si aumentamos la dosis de pentobarbital entonces se observarán menos levantamientos por que el animal se sedará y perderá vivacidad e interés por la exploración. En el caso del etanol, a dosis bajas esperaríamos ver una conducta más viva ya que es estimulante en esas cantidades, así que es probable que los levantamientos aumenten, pero al ir aumentando la dosis se observará un aletargamiento y nuevamente se esperarían observar menos levantamientos.
INTRODUCCIÓN La ansiedad es una sensación desagradable de tensión, aprensión o incomodidad, un miedo que parece proceder de un origen desconocido. Los sintomas de la ansiedad grave son similares a los del miedo (como taquicardia, sudación, temblores y palpitaciones) y conllevan la activación del sistema simpático. Cuando los síntomas de la ansiedad son graves, crónicos crónicos y debilitantes, se requiere terapia con fármacos ansiolíticos, ansiolíticos, con o sin una terapia psicológica psicológica o conductal en forma concomitante. Debido a que todos los fármacos ansiolíticos causan cierta sedación, los mismos agentes se emplean para inducir el sueño (hipnóticos). El pentobarbital usado en la práctica pertenece a la familia de los barbitúricos que constituyeron el tratamiento básico para sedación, así como para inducción y mantenimiento del sueño. Los barbitúricos son depresores no selectivos del sistema nervioso central con efectos que oscilan entre la sedación y la reducción de la ansiedad a la inconsciencia y la muerte por insuficiencia respiratoria y cardiovascular. Por tanto, son peligrosos en caso de sobredosis. Actúan en parte potenciando la acción del GABA para permitir la entrada de cloro a la neurona, el flujo de iones i ones de cloro hacia el interior de la célula provoca hiperpolarizació hiperpolarización n leve que aleja al potencial postsináptico de su umbral de emisión e inhibe la formación de potenciales de acción. El etano etanoll tiene tiene accio accione nes s ansio ansiolít lític icas as y sedan sedante tes s pero pero su poten potencia ciall de toxic toxicida idad d sobrepasa estos beneficios, no pertenece a la familia de los barbitúricos. Los principales efectos del etanol se ejercen en el SNC, donde sus acciones depresoras son similares a las de los anestésicos volátiles. En las células, el efecto del etanol es puramente depresor, aunque aumenta la actividad de los impulsos (probablemente por deshinibición) en algunas partes del SNC.
El etanol potencia la acción del GABA, actuando sobre los receptores GABA A de manera semejante a las benzodiacepinas y barbitúricos. Sin embargo, su efecto es menor y menos constante que el de estas sustancias tóxicas y no se ha demostrado que ejerza un efecto claro en la transmisión sináptica inhibidora en el SNC. El principal efecto cardiovascular del etanol es la vasodilatación cutánea, de origen central, que produce una sensación de calor, pero que en realidad aumenta la pérdida de calor. El etanol incrementa la secreción salival y gástrica, en parte como efecto reflejo producido por el sabor y la acción irritante del alcohol. La diuresis es un conocido efecto del etanol, debida a la inhibición de la secreción de hormona antidiurética; la tolerancia aparece con rapidez, por lo que este incremento de diuresis no se mantiene. Los grandes bebedores sufren una degeneración neurológica con demencia y neuropatías periféricas, su consumo produce a largo plazo una hepatopatía que progresa a la cirrosis y la insuficiencia hepática. El etanol se metaboliza fundamentalmente en el hígado, primero por acción de la alcohol deshidrogenasa, que lo transforma en acetaldehído, y después por la aldehído deshidrogenasa, que lo transforma en acetato. Los análisis biológicos se diseñan para medir la potencia relativa de dos preparaciones, normalmente una estándar de referencia y otra desconocida. Por supuesto, el patrón de referencia idóneo es la sustancia pura, pero a menudo hay que establecer preparaciones estándar de distintas hormonas, productos naturales y antisueros frente a los que se pueden calibrar las muestras de laboratorio, aún cuando las preparaciones estándar no son químicamente puras. Según el modelo de los dos estados, la eficacia refleja la afinidad relativa del compuesto por los receptores en reposo y activados. Los agonistas son selectivos por el estado activado; los antagonistas no muestran selectividad alguna.
DIAGRAMA DE FLUJO A) Efecto sedante de pentobarbital.
INICI O
Pesado y marcaje de animales .
Cada grupo de trabajo recibió seis ratones. Marcamos a nuestros animales con el marcador de tinta indeleble en la base de la cola, los pesamos y registramos el peso de Desarrollo del experimeto 1) Nos cercioramos de que el cilindro de vidrio estuviera seco y limpio. 2) Colocamos el cilindro sobre un trozo de papel balnco mayor al diámetro del cilindro 3)Treinta minutos después de haber administrado el fármaco o la solución salina introducimos al animal en el cilindro de exploración. 4)Pusimos a funcionar el cronómetro y registramos el número de levantamientos que realizó el animal en un período de 5 minutos. Solo una persona cuantificó esta conducta para que fueran analizados bajo el mismo criterio. 5)Limpiamos con una solución hidroalcohólica el
Preparación de las disoluciones de pentobarbital sódico
Rotulamos seis frascos viales con las siguientes leyendas 0, 2.5, 5, 10, 15 y 30 mg/kg. Agregamos la cantidad indicada del cuadro que viene en el manual de la disolución de pentobarbital de 3mg/ml y de disolución salina al 0.9 % (p/v).
Administración del fármaco
Asignamos aleatoriamente las dosis que recibió cada ratón. Administramos por vía intraperitoneal 0.1 ml de la disolución correspondiente del fármaco o de la disolución salina por cada 10 g de peso
FIN
B) Efecto sedante de etanol
Pesado y marcaje de animales . INICI O
Cada grupo de trabajo recibió seis ratones. Marcamos a nuestros animales con el marcador de tinta indeleble en la base de la cola, los pesamos y registramos el peso de
Desarrollo del experimeto
1) Nos cercioramos de que el cilindro de vidrio estuviera seco y limpio. 2) Colocamos el cilindro sobre un trozo de papel balnco mayor al diámetro del cilindro
Preparación de las soluciones de etanol absoluto. Rotulamos seis matraces aforados de 10 ml con las siguientes leyendas 0, 500, 1000, 2000, 2500 y 3000 mg/kg. Agregamos la cantidad indicada en el
Administración del fármaco
Asignamos aleatoriamente las dosis que recibió cada ratón. Administramos por vía intraperitoneal 0.1 ml de la disolución correspondiente del fármaco o de la disolución salina por cada 10 g de peso
3)Treinta minutos después de haber administrado el fármaco o la solución salina introducimos al animal en el cilindro de exploración. 4)Pusimos a funcionar el cronómetro y registramos el número de levantamientos que realizó el animal en un período de 5 minutos. Solo una persona cuantificó esta conducta para que fueran analizados bajo el mismo criterio. 5)Limpiamos con una solución hidroalcohólica el
FIN
RESULTADOS Pentobarbital sódico
Algoritmo de cálculo
Dosis (mg/Kg) 0
levantamie ntos 27
2.5
20
20
1− efecto 0 0.259259 26
%efecto 0 25.92592 59
0.296296 5 19 3 0.370370 10 17 37 0.629629 15 10 63 0.925925 30 2 93 Tabla1. pentobarbitol sódico: lineal
29.62962 96 37.03703 7 62.96296 3 92.59259 3 modelo
27
=
0.259
calculo de DE50 0.5 − 0.1174 0.0284
=
13.4718mg / Kg
Pentobarbitol Sódico: modelo lineal y = 0.0284x + 0.1174 1.2
R2 = 0.9414
1 m i c 0.8 e d ( 0.6 o t c 0.4 e f e 0.2
efecto Lineal (efecto )
0 0
10
20
30
40
Dosis (mg/Kg)
Grafica 1, pentobarbitol sódico: modelo lineal log D (mg/Kg) Efecto 0.397940009 0.25925926 0.698970004 0.2962963 1 0.37037037 1.176091259 0.62962963 1.477121255 0.92592593 Tabla 2. pentobarbitol sódico: modelo lineal logarítmico
Pentobarbitol Sódico: modelo lineal logarítmico 1
calculo de DE50
l 0.8 a m i c 0.6 e d ( o 0.4 t c e f E 0.2
0.5 0.0 −
Serie1
DS 50
=
10^
0.6169
=
6.460mg / Kg
Lineal (Serie1)
0 0
0.5
1
1.5
2 y = 0.6169x - 0.0898 R2 = 0.8464
Dosis (mg/Kg)
Grafica 2 pentobarbitol sódico: modelo lineal logarítmico log D (mg/Kg) log efecto 0.397940009 -0.58626572 0.698970004 -0.52827378 1 -0.43136376 1.176091259 -0.20091484 1.477121255 -0.03342376 Tabla 3. pentobarbitol sódico: modelo del efecto máximo.
Pentobarbitol Sódico: modelo del efecto máximo 0 -0.1 0
0.5
1
m -0.2 i c e -0.3 d ( E -0.4 g o -0.5 l
1.5
calculo de DS50 D E 5 0
2
Serie1 Lineal (Serie1)
-0.6 -0.7
log D (mg/Kg)
y = 0.5316x - 0.861 R2 = 0.9127
Grafica 3. pentobarbitol sódico: modelo del efecto máximo. log D (mg/Kg) log efecto 0.397940009 -0.58626572 0.698970004 -0.52827378 1 -0.43136376 1.176091259 -0.20091484 1.477121255 -0.03342376 Tabla 4. pentobarbitol sódico: modelo del efecto máximo sigmoideo
=
10
−
b
0.86 1
=
10
=
7.2 6 1 0m g / K g
Pentobarbitol Sódico: modelo del efecto máximo sigmoide
calculo de DS50 0 0 l a -0.2 m i c e -0.4 d ( E g -0.6 o l
0.5
1
1.5
DE 50
2 Serie1
=
=
10
−
b/m
=
10 0.861 / 0.5316
1.6196 mg / Kg
Lineal (Serie1)
-0.8 y = 0.5316x - 0.861 R2 = 0.9127
log D (mg/Kg)
Grafica 4. pentobarbitol sódico: modelo del efecto máximo sigmoideo.
Etanol Dosis (mg/Kg)
levantamie ntos
0 500 1000 2000 2500 3000
efecto
%efecto
21 -0.14285714 24 0.19047619 -14.2857143 17 0.33333333 19.047619 14 0.95238095 33.3333333 1 0.95238095 95.2380952 1 0.95238095 95.2380952
Tabla 5. etanol: modelo lineal
Algoritmo de calculo
Etanol: modelo lineal
1−
17 21
=
0..333333
1.2 1 l a m 0.8 i c e d ( 0.6 o t c 0.4 e f E 0.2
calculo de DS50 Serie1 Lineal (Serie1)
0 0
1000
2000
3000
Dosis(mg/Kg)
4000 y = 0.0004x - 0.3007 R2 = 0.8199
Grafica 5. etanol: modelo lineal log D (mg/Kg) -2.698970004 3 3.301029996 3.397940009
Efecto 0.25925926 0.2962963 0.37037037 0.62962963 0.95238095
Tabla 6. etanol: modelo lineal logarítmico
0.5 − 0.3007 0.0004
=
2001 .75mg / Kg
Etanol: modelo lineal logarítmico 1
Algoritmo de calculo
m 0.8 i c e 0.6 d ( o t 0.4 c e f E 0.2
Serie1
calculo de DS50
Lineal (Serie1) 0.5 − 0.0
DS 50 = 10^ 1.6792
=
1.9850 mg / Kg
0 2.8
3
3.2
3.4
3.6 y = 1.6792 x - 4.9242
Log D (mg/Kg)
2
R = 0.7575
Grafica 6. etanol: modelo lineal logarítmico log D (mg/Kg)
log efecto
2.698970004 3 3.301029996 3.397940009 2.698970004
-0.14285714 0.19047619 0.33333333 0.95238095 0.95238095
Tabla 7. etanol: modelo del efecto máximo.
Algoritmo de calculo
M odelo del efecto máximo: e
calculo de DS50 e 2. 5 l a m 2 i c e d ( 1. 5 o t c 1 e f E 0. 5 g o L 0
2.8
DE 50
Serie1 Lineal (Serie
3
3.2
3.4
3.6
Log D (mg/K
y = 1.5465x - 3.40 R2 = 0.862
Grafica 7. etanol: modelo del efecto máximo. log D (mg/Kg) 2.698970004 3 3.301029996 3.397940009 2.698970004
log efecto -0.14285714 0.19047619 0.33333333 0.95238095 0.95238095
Tabla 8. etanol: modelo del efecto máximo sigmoideo
=
10
−
B
3.4042
=
10
=
25.14mg / Kg
Modelo del efecto máximo sigmoideo: etanol
calculo de DS50 2.5 i c e 2 d ( o 1.5 t c e 1 f E g 0.5 o L 0
DE 50 =
=
10
−
b/m
=
10 3.4042 / 1.5665
158.94mg / Kg
Serie1 Lineal (Serie1)
2.8
3
3.2
3.4
3.6
Log D(mg/Kg)
y = 1.5465 x - 3.4042 R2 = 0.862
Grafica 8. etanol: modelo del efecto máximo sigmoideo
Cálculo de la potencia relativa del Etanol: Pr EtOH =
DE 50 petobarbit al DE 50 E tan ol
=
13.4718mg / Kg 2001 .75mg / Kg
=
0.00673
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Para calcular el efecto sedante del Pentobarbital, se usó el modelo lineal pues fue el modelo con el que obtuvimos mejor correlación y por lo tanto la DE50= 13.4718 mg/kg; en cambio, para el Etanol, se utilizó el modelo del ‘efecto máximo sigmoide’, obteniendo una DE50= 2001.75 mg/kg, lo cual nos indica que el Pentobarbital es más potente y por lo tanto más peligroso que el Etanol, ya que con una menor dosis se obtiene la DE50. También pudimos observar que al realizar la determinación de las DE50 del etanol, en la primer dosis administrada (500 mg/kg) no se observó el efecto que esperábamos (efecto sedante de los depresores del Sistema Nervioso Central) sino el contrario, ya que hubo mayor número de levantamientos del ratón al estar dentro del cilindro de vidrio, esto sucedió, porque el etanol, a bajas concentraciones tiene efecto estimulante, no inhibitorio, pues produce efecto estimulante sobre el receptor serotonérgico y por lo tanto libera neurotransmisores como la dopamina, el cual es precursor en la síntesis de catecolaminas (como la adrenalina y noradrenalina), esto quiere decir, que dicho efecto del aumento del número de levantamiento fue un efecto normal. Pero posteriormente con mayores dosis, si se presentó la respuesta esperada como desde un principio con el Pentobarbital, pues facilita la interaccón del GABA con los receptores GABAA lo cual causa depresión del SNC, e igualmente se aumenta el tiempo de apertura de los canales de Cloro lo cual causa una hiperpolarización y no es poible la transmisión de potenciales de acción causando
mayor inhibición del SNC. El pentobarbital es más potente que el Etanol porque deja los canales de Cloro mayor tiempo abiertos. La potencia relativa del Etanol= 0.00673, el cálculo se realizó comparándolo con la potencia del Pentobarbital, el valor obtenido es un número muy pequeño, lo cual nos indica que la potencia del Etanol es mucho menor comparada con la del Pentobarbital, lo cual pudimos comprobar al calcular la DE50 para cada uno. CONCLUSIONES
Se comprobó que a mayor dosis de pentobarbital menos levantamientos del ratón, por tanto mayor sedación del animal y como consecuencia mayor depresión del sistema nervioso central.
También se pudo comprobar el efecto estimulante del etanol al observar en un principio que con dosis bajas de dicho alcohol el ratón presentaba mayor número de levantamientos y a dosis altas se presentó el efecto sedante, observando en este caso un menor número de levantamientos del ratón.
La determinación de la DE50 nos permite saber la toxicidad que pueda tener un fármaco puesto que a menor DE50 más rápido se produce el efecto terapéutico deseado y por tanto el fármaco es más potente. En esta práctica el pentobarbital es más potente que el etanol puesto que tiene una DE 50 menor.
La potencia relativa entre dos sustancias nos ayuda a saber cuál de estas es más potente.
Los mecanismos de acción del etanol y del pentobarbital son parecidos puesto que potencian la acción del GABA y tienen como función inhibir algunas partes del SNC, sin embargo el efecto del etanol es menor y menos constante puesto que el pentobarbital deja los canales de cloro más tiempo abiertos. En la elección de un modelo para determinar la DE50 se considera el mejor el que tenga una regresión lineal más cercana a 1.
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