13
CHƯƠ NG NG 3: TỔNG QUAN VỀ SẮC KÝ LỎNG11 3.1
PHƯƠ PHƯƠ NG NG PHÁP SẮ SẮC KÝ LỎ LỎNG HIỆ HIỆU NĂ NĂNG CAO (HPLC)
HPLC là một ph ươ ng ng pháp tách và phân tích các h ợ p ch ất đượ c sử dụng r ộng rãi và phổ biến nhất hiện nay vì nhi ều lí do: có độ nhạy tươ ng ng đối cao, có khả năng định lượ ng ng tốt, thích hợ p cho việc tách các hợ p chất khó bay hơ i hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, có
ĩ nh phạm vi ứng dụng tr ải r ộng trong nhiều l ĩ nh vực từ nghiên cứu khoa học trong các phòng ĩ nh thí nghiệm đến công nghiệ p và một số l ĩ nh vực khác. Hợ p chất có thể phân tích bằng s ắc ký lỏng như acid amin, protein, acid nucleic, hydrocacbon, carbohydrate, thuốc kháng sinh, thu ốc tr ừ sâu, các hợ p chất vô cơ … Dựa vào sự khác nhau về cơ ch chế chiết tách sử dụng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao mà ngườ i ta có thể phân chia nó ra làm các lo ại: sắc ký hấ p phụ, sắc ký phân b ố, sắc ký ion, sắc ký rây phân t ử… trong đó s ắc ký phân bố đượ c ứng dụng r ộng rãi và phổ biến. Tùy theo độ
ĩ nh phân cực pha t ĩ nh và dung môi pha động, ngườ i ta phân bi ệt: s ắc ký lỏng pha thườ ng ng và sắc ký lỏng pha đảo.
ắ c ký l ỏng pha thườ ng S ắ ng :
ĩ nh pha t ĩ nh có độ phân cực cao hơ n độ phân cực c ủa dung
môi pha động, dùng để tách và phân tích các h ợ p chất có độ phân cực cao vớ i phân t ử lượ ng ng không lớ n lắm.
ắ c ký l ỏng pha đảo: ngượ c vớ i s ắc S ắ
ĩ nh ký pha thườ ng, ng, pha t ĩ nh có độ phân cực thấ p,
pha động có độ phân cực cao hơ n. n. Phươ ng ng pháp này dùng để phân tích các h ợ p ch ất từ không phân cực đến phân cực vừa. Dung môi sử dụng là dung môi phân c ực, trong đó nướ c đóng vai trò quan tr ọng mà lại r ẻ tiền, do đó sắc ký lỏng pha đảo đượ c sử dụng nhiều nhất. 3.2 CÁC THÔNG SỐ CỦ CỦA PHƯƠ PHƯƠ NG NG PHÁP SẮ SẮC KÝ LỎ LỎNG 12 3.2.1 Hệ Hệ số số phân bố bố Cân bằng của một cấu tử trong hệ sắc ký có thể đượ c mô tả bằng phươ ng ng trình đơ n giản sau:
ĩ nh A pha động A pha t ĩ nh
14
Hệ số cân bằng K cho cân bằng này đượ c gọi là tỉ lệ phân bố và đượ c tính như sau: K
ĩ nh Cs: nồng độ cấu tử trong pha t ĩ nh
CS CM
Cm: nồng độ cấu tử trong pha động
ĩ nh S: Pha t ĩ nh M: Pha động
ĩ nh, K tùy thuộc bản chất pha t ĩ nh, pha động và chất hòa tan. K nh ỏ: chất di chuyển nhanh; K lớ n: n: chất di chuyển chậm.
ĩ nh Thông thườ ng ng K 1 để ch ất có ái l ực vớ i pha t ĩ nh nếu không thì nó sẽ di chuyển nhanh quá làm cho khó tách. Hai chất muốn tách ra khỏi nhau thì phải có K khác nhau. 3.2.2 Thờ Thờ i gian lư lư u tR
time
Là thờ i gian để chất phân tích sau khi tiêm vào c ột đến đầu dò đượ c tính theo công thức: tR = t’R + tM tM: thờ i gian l ưu chết c ủa c ấu tử không bị giữ l ại trên cột, đượ c tính gần đúng theo công thức: tM
trong đó: L: chiều dài cột, cm
0, 5 L ( dc) 2 V
15
dc: đườ ng kính cột, cm V: tốc độ dòng pha động, mL/phút Có thể nhận danh chất thông qua th ờ i gian lưu vì trong điều kiện thí nghiệm trên cột thiết bị sắc ký lỏng nhất định, thờ i gian l ưu của chất đó là một đại lượ ng xác định. Thờ i gian lưu càng lớ n thì hệ số phân bố càng lớ n. 3.2.3 Hệ số dung lượ ng
Để mô tả tốc độ lưu của cấu tử phân tích trong c ột ngườ i ta sử dụng một hệ số quan tr ọng gọi là hệ số dung lượ ng k’. k'
Vs Cs.Vs K V M C M .VM
Vs: thể tích pha t ĩ nh Vm: thể tích pha động k '
k' có thể tính theo công th ức
t R t M tM
k’ phải > 1 để peak của chất tan tách khỏi peak của dung môi nhưng không quá lớ n vì lúc đó thờ i gian phân tích sẽ kéo dài và mũi bị tù do chất ở trong cột quá lâu. Khoảng k’ lý tưở ng là từ 2 đến 5 nhưng khi phân tích một hỗn h ợ p phức t ạ p chúng ta có thể chấ p nhận k’ trong khoảng từ 0,5 đến 20. k’ tăng hoặc giảm tùy thuộc độ mạnh của dung môi pha động. Trong s ắc ký phân bố pha đảo ngượ c, độ mạnh của dung môi tăng theo phần tr ăm chất hữu cơ . Thông thườ ng trong sắc ký phân bố pha đảo ngượ c, khi giảm dung môi hữu cơ trong pha động 10% thì k’ s ẽ tăng lên gấ p 2 đến 3 lần. 3.2.4 Hiệu năng Khi nói đến hiệu năng của cột là nói đến khả n ăng tách mũi sắc ký của một cấu tử trên cột. Độ hiệu năng N đượ c biểu diễn như số đĩ a lý thuyết của cột. N càng lớ n hiệu năng tách của cột càng lớ n. t L t N 16 5,55 w H w 2
R
R 1
2
2
16
Vớ i W: bề r ộng mũi sắc ký W1/2: bề r ộng của mũi ở phân nửa chiều cao Số đĩ a lý thuyết càng lớ n, bề r ộng W càng nhỏ, mũi càng nhọn. 3.2.5 Độ chọn lọc K B K 'B α K A K 'A
α
K 2 K1
t R 2 tM t R1 t M
t ' R 2 t 'R1
Độ chọn lọc là một thông số r ất quan tr ọng, liên quan tớ i khả năng tách của các cấu tử cần phân tích, nó tùy thu ộc bản chất của pha t ĩ nh, pha động. Hai chất tách đượ c khi # 1 và càng lớ n, khả năng tách càng cao. Có nhiều y ếu t ố ảnh h ưở ng đến độ chọn l ọc như thành phần dung môi pha động, pH của môi tr ườ ng, bản chất của pha t ĩ nh, nhiệt độ. Trong đó sự thay đổi pha động từ dung môi này sang dung môi khác s ẽ làm thay đổi đáng k ể. 3.2.6 Độ phân giải
Độ phân giải (R s) tùy thuộc vào điều ki ện pha động, pha t ĩ nh và đặc tính của hợ p chất cần phân tích mà ta có đượ c sắc ký đồ vớ i những mũi phủ lên nhau ho ặc tách hẳn nhau. Độ phân giải R s là m ột thông số dùng để đánh giá mức độ tách phổ, khả năng tách của các mũi sắc ký sẽ có ý ngh ĩ a quan tr ọng trong việc phân tích một cách định lượ ng. R S
t R 2 t R 1 w1 w 2 2
Phươ ng trình trên thích h ợ p cho việc tính R s khi 2 mũi tách hẳn nhau (R s 1,5). Trong tr ườ ng hợ p R s nh ỏ h ơ n, t ức mũi bị trùng lấ p thì việc xác định W1 và W 2 s ẽ khó khăn hơ n là W1/2(1) và W1/2(2) lúc này R s sẽ đượ c tính theo: Rs 1,18
t R 2 t R1 W1/2(1) W 1/2(2)
17
R s
Khi k’1= k’2, →1:
R s
1 4 1
1 1 4
k ' 1 2
N
k '2
k ' k ' 1
N
Để có thể phân tích một cách định lượ ng thì 2 mũi k ề nhau phải tách hẳn nhau, tức R s 1,3. Khi R s 1 cần phải thay các thông s ố thực nghiệm để làm tăng R s. Tóm lại: khi tiến hành một quy trình phân tích b ằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, thì cần chú ý tớ i khả năng phân tách của các mũi trên sắc ký đồ. Có nhiều yếu tố ảnh hưở ng lên phép xác định và tùy theo yêu c ầu c ần phân tích định tính, định l ượ ng hay bán định lượ ng mà chúng ta sẽ tối ưu hóa các thông số thực nghiệm của pha t ĩ nh cũng như pha
động cho hợ p chất cần nghiên cứu. 3.3
GIỚ I THIỆU CÁC BỘ PHẬN CỦA THIẾT BỊ SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao bao gồm các bộ phận chính: bơ m, bộ phận tiêm mẫu, cột sắc ký phân tích, đầu dò, bộ phận điều khiển và xử lý số liệu.
Hình 10: Mô hình cơ bản của HPLC.
Nguyên lý hoạt động: mẫu sau khi đượ c tiêm vào cột sẽ đượ c pha động lôi kéo qua cột. D ựa vào khả n ăng t ươ ng tác khác nhau gi ữa các chất có trong nền mẫu vớ i pha t ĩ nh và pha động mà chúng đượ c tách ra khỏi nhau và sau khi ra kh ỏi cột sẽ đượ c ghi nhận bở i bộ dò cụ thể.
18
Sắc ký lỏng có thể ghép vớ i nhiều loại đầu dò khác nhau nh ư đầu dò phổ t ử ngoại khả kiến UV-Vis, đầu dò huỳnh quang FLD, đầu dò chỉ số khúc xạ RID, đầu dò điện hóa ECD, đầu dò khối phổ MS… Hiện nay đầu dò khối phổ đượ c ứng dụng r ộng rãi trong phân tích vết và các hợ p chất nhận danh chính xác. Tùy theo tính chất c ủa chất c ần khảo sát mà ta có thể chọn lựa pha t ĩ nh, pha động (bảng 1). Loại cột
Pha t ĩ nh
Dung môi
Chất cần phân tích
C18
Octyldecyl
ACN, MeOH, H2O
Không phân cực
C8
Octyl
ACN, MeOH, H2O
Không phân cực
Phenyl
Styryl
ACN, MeOH, H2O
Axit béo, chất có liên k ết đôi
Cyano
Cyanopropyl
ACN,MeOH,H2O, THF
Xeton, aldehyd
Amino
Aminopropyl
ACN, MeOH, H2O, THF,
Đườ ng, anion
CHCl3, CH2Cl2 Diol
Dihydroxyhexyl
ACN, MeOH, H2O, THF
Protein
SAX
Aromatic Quaterany
Đệm
Anion
SCX
Aromatic
Đệm
Cation
Acid sulfonic
ACN, MeOH, H2O
Alkyl ether
Đệm
Diethyl
aminoethyl Diethylamine DEAE
ACN, MeOH, H2O
CM
Alkyl ether
Đệm
Acid acetic
ACN, MeOH, H2O
Si
Hexane
Silanol
chloroform
Silica
Protein, anion
Protein, cation
Hợ p chất hữu cơ phân cực, đồng phân
Bảng 1: Lo ại cột, pha t ĩ nh, pha động và hợ p chấ t phân tích thông d ụng 13.
19
Để định lượ ng anthocyanin trong các d ịch trích bằng phươ ng pháp HPLC ngườ i ta còn k ết h ợ p đầu dò UV/Vis vớ i đầu dò ECD. Không giống HPLC bán định lượ ng chỉ để làm sạch, HPLC- UV/Vis- ECD dùng để phân tích. Chất phân tích đượ c tiêm tự động và cùng vớ i pha động t ớ i cột. Các hợ p phần khác tươ ng tác khác nhau vớ i pha t ĩ nh và pha
động. Chất phân tích sau khi đượ c r ửa giải đi đến detector một cách riêng biệt. Phươ ng pháp HPLC-UV/Vis-ECD có một số đặc điểm sau:
Pha động: Pha động trong HPLC đượ c đưa liên tục vào hệ thống. Pha động có thể theo
chươ ng trình gradient dòng ho ặc đẳng dòng, nhưng pha động cố định thườ ng mất thờ i gian lâu và khó tách các mũi. Hiện nay thườ ng dùng nhất là dạng gradient. Khi r ửa giải trong sắc ký pha đảo, l ượ ng dung môi hữu cơ t ăng dần lên. Tại lúc tiêm mẫu, một l ượ ng pha động yếu h ơ n đi vào hệ (ít hợ p phần hữu cơ h ơ n). Sau đó l ại t ăng tỉ l ệ h ữu cơ trong pha động lên để r ửa giải tất cả những chất bị giữ lại ở pha t ĩ nh.
Cột 10: Có nhiều loại pha t ĩ nh khác nhau, dẫn đến cơ chế r ửa giải c ũng khác nhau. Trong
nghiên cứu này sử dụng cột pha đảo v ớ i pha t ĩ nh không phân cực và pha động phân c ực. Pha t ĩ nh chứa các hợ p phần giống RMe2SiCl vớ i R là các nhóm alkyl (C 18H37 hoặc C8H17). Hợ p phần không phân cực có ái lực vớ i pha t ĩ nh nên thờ i gian lưu dài hơ n. Thờ i gian lưu có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi độ phân cực của pha động. Đườ ng kính trong của cột lớ n tạo sức chứa lớ n, đượ c dùng trong HPLC bán điều chế để làm sạch anthocyanin. Cột phân tích dùng trong HPLC-UV/Vis-ECD có đườ ng kính trong ID nhỏ hơ n (C18 250 x 4.6mm). 3.3.1. Đầu dò UV-Vis
Đầu dò có gắn đèn UV (thườ ng là đèn deuterim 190-360nm) và đèn Vis (đèn tungsten, 360-800nm). Vì vậy các hợ p ph ần h ấ p thu ánh sáng từ khoảng 180- 800nm sẽ
đượ c đầu dò phát hiện. Chất phân tích sau khi r ửa giải ra khỏi c ột chuyển qua 1 tế bào cảm biến hình tr ụ. Ánh sáng trong vùng UV/Vis truy ền qua tế bào tớ i mảng quang điện. N ếu chất phân tích hấ p thu đượ c ánh sáng ở 1 bướ c sóng nào đó, mảng quang điện sẽ phát hiện ra sự thay
20
đổi. Tín hiệu phát ra từ mảng quang điện sẽ chuyển tớ i bộ khuếch đại đến bộ ghi đo và hệ thống thu dữ liệu. Cườ ng độ dòng sáng truyền qua cell đo (I) tỉ lệ vớ i nồng độ của chất phân tích theo định luật Lamber- Beer (- hệ số hấ p thu phân tử, c- nồng độ (mol/L), l- chiều dài
đườ ng truyền quang (l luôn là 1 cm), Io là cườ ng độ của tia sáng t ớ i cell): A= l c I A log10 I 0 C C
DientichECD F Vtiem n DientichUV l
Anthocyanin có 2 b ướ c sóng hấ p thu ở 530nm và 280nm, vì vậy có thể sử dụng
đầu dò UV/Vis. Trong HPLC định lượ ng, có thể dùng UV/Vis k ết hợ p vớ i ECD hoặc vớ i MS. 3.3.2. Đầu dò ECD: 3.3.2.1 Tính chất điện hóa của anthocyanin: Hoạt tính chống oxi hóa của các hợ p chất thiên nhiên ph ụ thuộc vào số l ượ ng các phân t ử hiện diện trong mẫu và cấu trúc c ủa chúng, ví dụ vị trí nhóm -OH hay -OCH3. Anthocyanin có đặc tính chống oxi hóa do các nhóm -OH trên vòng th ơ m. Chất chống oxi hóa là một chất khử khi tươ ng tác vớ i các gốc tự do, ngh ĩ a là chúng bị oxi hóa trên bề mặt điện cực. Chất chống oxi hóa ngăn sự hình thành và ho ạt động của oxi và nitơ . Ta có thể thấy ở hình 11, nhóm catechol ở vòng B và các nhóm resorcinol ở vòng A của catechin có thể bị oxi hóa. Vòng A và B không liên h ợ p nhau nên s ự oxi hóa các nhóm -OH của vòng này không ảnh hưở ng tớ i các nhóm -OH trên vòng kia. C ấu trúc catechin có các nhóm -OH g ắn vào vòng th ơ m có thể bị oxi hóa. Vòng B dễ bị oxi hóa hơ n vòng A, vì v ậy khi áp thế 100 ÷ 800mV thì các -OH trên vòng B s ẽ b ị oxi hóa, trên 1500mV vòng A sẽ bị oxi hóa.
21
Hình 11: S ự oxi hóa c ủa các nhóm catechol.
Một số nghiên cứu cho thấy các nhóm -OH ở vị trí meta (trên vòng A) khó b ị oxi hóa hơ n ở vị trí para hoặc ortho (trên vòng B). K ết quả là, anthocyanin sẽ bị oxi hóa nhiều bướ c ở các thế áp khác nhau, tùy vào th ứ tự oxi hóa của các nhóm -OH khác nhau. So vớ i đầu dò UV/Vis, đầu dò ECD nh ạy hơ n và chọn lọc hơ n đối vớ i anthocyanin có hàm lượ ng nhỏ. Cơ chế của quá trình oxi hóa x ảy ra theo thứ tự sau: 1.
Sự oxi hóa các nhóm -OH trên vòng B ở thế dươ ng bé
2.
Sự oxi hóa các nhóm -OH trên vòng A ở thế cao hơ n Thế oxi hóa tùy thuộc vào pH, khi pH t ăng lên sẽ làm giảm thế oxi hóa. Nói chung, các nhóm -OH ở vị trí ortho trên vòng B b ị oxi hóa ở 450mV. Nhóm
methoxyl và đườ ng làm tăng khả năng chống oxi hóa c ủa anthocyanin. Vòng A và B không liên hợ p nhau nên sự oxi hóa của các nhóm -OH trên vòng A không ảnh hưở ng
đáng k ể tớ i sự oxi hóa các nhóm -OH ở vòng B và ngượ c lại. Vì vậy từ phươ ng pháp quang phổ có thể k ết luận r ằng vòng A không ảnh h ưở ng trên tính chất ph ổ của các gốc tự do từ vòng B. 3.3.2.2 Nguyên lý của HPLC/ECD6,14,15,16
22
Thiết k ế máy HPLC - ECD về mặt cơ bản không khác gì HPLC truy ền thống, ngoại tr ừ đầu dò quang học đượ c thay bằng đầu dò ECD. Đầu dò ECD đượ c dùng từ 1974. Lượ c đồ về cơ chế mô tả hệ thống HPLC - ECD ở hình 14. Thi ết b ị gồm bơ m để
đẩy dung môi động bằng áp suất hệ thống. Cột phân tích chứa vật liệu nhồi cột (thườ ng là lớ p nền tr ơ đượ c phủ vớ i bề mặt k ị nướ c, chẳng hạn các dẫn xuất của hydrocacbon đa vòng) để phân tách chất dựa trên thờ i gian lưu. Đầu dò điện hóa nối tr ực tiế p vớ i cột. Để tăng hiệu suất và độ lặ p lại, mẫu đượ c tiêm bằng hệ thống tiêm mẫu tự động, bộ tạo gradient điều khiển thành phần pha động, tất cả các hệ thống này đều phục vụ cho máy tính và máy tính thu ph ổ sắc ký đồ. Để làm phong phú ph ần dữ liệu, đầu dò PDA nối tr ực tiế p và đặt tr ướ c đầu dò ECD. Thành phần pha động chứa nồng độ chất điện ly cao để thuận tiện cho dòng đi qua đầu dò ECD. Thườ ng pha động ở môi tr ườ ng acid chứa Li3PO4 hoặc Na3PO4. Li3PO4 dễ tan trong dung môi h ữu cơ (MeOH hoặc ACN) và vi khuẩn không phát tri ển khi có mặt Li nên Li3PO4 thườ ng ưa dùng trong dung môi động. Cần làm sạch dung môi động vớ i khí tr ơ He để loại oxi vì oxi c ản tr ở việc phát hiện chất phân tích siêu nhạy. Khi chất phân tích đi qua điện cực làm việc ( điển hình là điện cực Cacbon nhưng thườ ng là điện cực kim loại), phản ứng hóa học xảy ra nhờ đó chất phân tích mất một (hoặc nhiều) điện tử. Những điện tử này đượ c phát hiện bằng một dòng chảy qua điện cực làm việc. Vì thế, tín hiệu hóa học chuyển thành tín hi ệu điện tử mà không cần chất mang từ tính trung gian. Dòng ch ảy qua điện cực làm việc vào một th ờ i điểm nào đó là một hàm tuyến tính vớ i số phân tử b ị oxi hóa tại bề mặt điện cực. Thế điện hóa của điện cực làm việc có thể biến đổi để xác định một cách chọn lọc chất phân tích; bất kì chất nào ra khỏi cột sắc ký mà không b ị oxi hóa dướ i thế áp vào thì đầu dò sẽ không phát hiện
đượ c. Do đó ECD có một chức năng chọn lọc nội tại mà các hệ thống đầu dò khác không có. Thêm vào đó, ECD cực k ỳ nhạy, giớ i h ạn phát hiện nh ỏ gấ p 10 ÷ 1000 l ần độ nhạy của đầu dò UV/Vis và gấ p 10 lần đầu dò huỳnh quang.
23
Hình 12: H ệ thố ng LC-UV-ECD t ại phòng thí nghi ệm
Hình 13: Nguyên lý hoạt động của đầu dò đ iện hóa.
vào thành của rãnh hẹ p, ch ấ t phân tích đượ c chuyể n A: ECD lo ại ampe g ồm đầu dò g ắn qua. Phản ứ ng đ iện hóa chuyể n chấ t X thành sản phẩ m bị oxi hóa Y. B: ECD d ạng coulom g ồm m ột đ iện c ự c x ố p mà chấ t phân tích sẽ chuyể n qua, phản ứ ng
đ iện hóa hiệu quả hơ n và cải thiện đượ c sự truyề n khố i.
Đầu dò điện hóa ở hình 13A là lo ại đầu dò ampe. Đây là dạng cơ bản nhất của ECD. Khi chất phân tích chảy qua điện cực làm việc (thườ ng là Cacbon nhưng cũng có
24
khi là kim loại), phản ứng hóa học xảy ra lúc này chất phân tích mất đi một hoặc nhiều
điện tử (tức là chất phân tích bị oxi hóa). Nh ững điện tử này đượ c phát hiện dướ i hình thức dòng điện chạy qua điện cực làm việc. Do đó thông tin hóa học về chất phân tích
đượ c chuyển thành tín hiệu điện mà không cần ch ất mang từ tính hoặc quang học trung gian. Dòng chạy qua pin điện hóa ở b ất kì thờ i điểm nào đều tuyến tính vớ i số mol đượ c oxi hóa trên bề mặt pin tại thờ i điểm đó. Thế điện hóa của điện cực làm việc có thể biến
đổi cho phép xác định chất phân tích chọn l ọc hơ n d ựa trên thế oxi hóa; bất kì hợ p ch ất nào đi ra khỏi cột mà không oxi hóa d ướ i thế áp vào cell đo thì đầu dò sẽ không nhận ra. Do vậy đầu dò ECD có một chức năng chọn l ọc nội tại mà các đầu dò quang học không có. Tuy nhiên, lo ại đầu dò này ít nhiều không hiệu qu ả vì chỉ có 5 - 10% chất phân tích chuyển qua điện c ực làm việc sẽ khuếch tán đến bề mặt điện c ực và thực hiện quá trình
điện hóa. Do dạng hình học của đầu dò nên chỉ cho phép sự oxi hóa tại lớ p phân cách (boundary), chỉ một phần chất phân tích truy ền qua đầu dò đượ c oxi hóa. Loại đầu dò coulom tốt hơ n (hình 13B), loại này có matrix xố p, thườ ng là Cacbon. Điện c ực so sánh và điện cực bổ tr ợ (counter) dạng kim loại (thườ ng là Paladium). Đối vớ i dung dịch loãng, đầu dò coulom gần nh ư đẩy h ết ch ất phân tích chuy ển hóa trên điện c ực dướ i th ế áp c ủa đầu dò. Dòng đượ c h ướ ng tr ực ti ế p vào đầu dò chứ không phải truyền qua. Diện tích bề mặt điện cực tăng đáng k ể, dòng chuyển động mạnh nên pha tr ộn lớ p dung dịch ở phần biên giúp các điều kiện đượ c thỏa mãn. Vì vậy, đầu dò nhạy h ơ n 10 - 20 l ần đầu dò ampe vì cải thiện đượ c sự truyền khối. Trong thực hành đầu dò ampe và đầu dò coulom không khác nhau nhi ều về độ nhạy nhưng nhìn chung đầu dò culong đượ c ưa chuộng hơ n. 3.3.2.3 Cơ chế Các chất có thể khử hoặc oxi hóa tr ải qua phản ứng oxi hóa trên bề mặt điện cực, tạo s ự thay đổi dòng và đượ c đầu dò ECD ghi nhận. Hình 14 mô tả cơ chế của pin điện hóa: 1 cặ p điện c ực đượ c đặt vào trong pin và áp thế dọc theo điện c ực. Khi thế đủ lớ n, phản ứng diễn ra và xuất hiện dòng điện. Cườ ng độ dòng I đượ c ghi đo theo thờ i gian, diện tích peak ứng vớ i tổng điện tích Q trao đổi giữa điện cực và chất có hoạt tính điện hóa, đượ c tính theo công th ức sau: Diện tích peak = Q = i . dt
25
Định luật điện phân Faraday liên k ết Q vớ i nồng độ chất hoạt động điện c ực qua phươ ng trình: Q = n F ntiêm Vớ i ntiêm = [C] Vtiêm
Q = n [C] VtiêmF Trong máy Dionex chúng tôi bi ểu diễn theo hiệu điện thế V thay vì cườ ng độ I, cườ ng độ dòng này đượ c biến đổi thành hiệu thế bằng cách nhân vớ i điện tr ở R
Diện tích peak = R ∫i . dt = n × [C] × Vtiêm × F Vớ i: R: là điện tr ở của thiết bị (có thể tính toán ho ặc biết đượ c từ nhà sản xuất), còn gọi là hệ số i: dòng đo đượ c bở i đầu dò điện hóa. n: số electron trao đổi liên quan t ớ i quá trình điện cực. C: nồng độ của chất hoạt động điện cực. Vtiêm: thể tích tiêm ( L) F: hằng số Faraday = 96500 (C/mol). ntiêm là số mol chất phân tích đượ c tiêm vào máy. Nếu biết đượ c s ố electron trao đổi n trong hợ p chất có tính điện hóa, sẽ bi ết đượ c nồng độ chất phân tích từ diện tích peak ở sắc ký đồ HPLC- ECD.
26 Hình 14: S ơ đồ của hệ HPLC- ECD. Đườ ng mũi tên đậm là pha động. Đườ ng đứ t nét chỉ mố i liên hệ giữ a các thiế t bị.
Hình 15: (a) mô ph ỏng phản ứ ng trên pin đ iện hóa (2 đ iện cự c đặt trong dung d ịch chứ a hợ p chấ t có hoạt tính đ iện hóa); (b) pin đ iện hóa th ật- đ iện cự c bổ tr ợ (A) áp th ế cố định bở i Amp.1, thế đượ c chọn l ọc t ừ máy đ iện thế (P) k ết nố i vớ i nguồn đ iện. Dòng chả y qua đ iện cự c làm việc đượ c đ iề u khiể n bằ ng b ộ ampe thứ 2 (Amp.2) và d ữ li ệu đ i ra hướ ng vào đầu đọc hoặc hệ th ố ng quản lý d ữ li ệu; (c) hệ đ iện c ự c culong sử d ụng đ iện c ự c carbon graphite l ỗ x ố p, trên mỗ i đơ n vị đ iện c ự c có 1 đ iện c ự c carbon l ỗ x ố p, trên c ả 2 mặt có g ắn đ iện c ự c so sánh và đ iện cự c b ổ tr ợ . Khi áp su ấ t d ọc theo đ iện c ự c khá nh ỏ , các đơ n v ị đ iện c ự c có thể k ết n ố i l ại thành chuỗ i, t ạo mảng array.
Một pin điện hóa cơ bản c ần 3 điện c ực: điện cực làm việc (ở đây s ẽ diễn ra quá trình oxi hóa hoặc khử), điện cực bổ tr ợ và điện cực so sánh (dòng điện chạy qua r ất bé,
để dung hòa bất kì s ự thay đổi trong độ dẫn nền của pha động). Pin điện hóa đượ c sử dụng có độ nhạy cao, bề mặt r ộng đảm bảo 100% chất phân tích hoạt tính điện cực s ẽ b ị oxi hóa hoặc khử. Dòng đo ở đầu ra có đơ n vị mV (U = I R, U có đơ n v ị là mV, I có
đơ n vị là mA, R có đơ n vị là ). Việc trao đổi điện t ử x ảy ra tại ranh giớ i c ủa điện cực làm việc và chất hoạt động trong dung dịch điện dẫn. Tỷ lệ trao đổi điện tử, tức độ lớ n của dòng chuyển qua, chính là tốc độ phản ứng tại thế áp. Tỷ lệ này cũng tùy thuộc vào tốc độ của chất khảo sát đến bề mặt điện cực bằng khuếch tán và đối lưu. Số electron trao đổi n của các chất điện hoạt có thể đượ c xác định bằng phươ ng pháp vol-ampe. Nguyên tắc của phươ ng pháp đượ c mô tả như sau:
27
Cách xác định số electron trao đổi bằng vol-ampe 19,20,21:
Các phươ ng pháp điện hóa sử dụng trong hệ sinh học mô phỏng bản chất chống oxi hóa dựa trên mối liên hệ chặt chẽ giữa khả năng oxi hóa khử của hóa chất trong dung dịch và hoạt tính điện hóa tại bề mặt điện cực, cườ ng độ của chất chống oxi hóa trong môi tr ườ ng và thế áp để chúng bị khử trên bề mặt điện c ực (chất khử càng mạnh thế áp càng ít dươ ng). Thực tế một chất chống oxi hóa là chất khử trong tươ ng tác vớ i gốc tự do, lúc này chúng s ẽ bị oxi hóa, tuy nhiên không ph ải lúc nào cũng vậy. Những chất ch ống oxi hóa khác nhau ph ản ứng vớ i các gốc tự do và các chất oxi hóa khác nhau ở nhiều mức
độ, cũng như chúng sẽ hoạt động trên các bề mặt điện cực khác nhau vớ i mức độ khác nhau. Dù biến đổi như vậy nhưng chúng cũng cho phép định danh và định lượ ng. Mặc khác, chất chống oxi hóa ngăn sự hình thành và kh ả năng hoạt động của nitrogen và oxygen từ những dạng hoạt động khác. Trong phươ ng pháp vol-ampe, thế áp của điện cực làm việc thay đổi tuyến tính vớ i thờ i gian, bắt đầu t ừ thế E mà ở đó không xảy ra phản ứng điện hóa đến giá tr ị E xảy ra sự khử/oxi hóa chất nghiên cứu. Sau khi đi ngang qua vùng th ế có một hoặc hai phản ứng
điện hóa xảy ra, hướ ng quét tuyến tính đảo lại, các sản phẩm cũng như sản phẩm trung gian tạo ra từ lần quét đầu sẽ thực hiện phản ứng điện hóa và đượ c ghi nhận. Khoảng thờ i gian thí nghiệm (chính là vận tốc quét và thế E nghiên c ứu) có thể biến đổi 102-10-3s mặc dù các phản ứng định lượ ng thườ ng giớ i h ạn 10-10-3s. Chất điện ly bổ tr ợ có mặt để kìm hãm sự di chuyển của các điện tích. Các thí nghiệm đượ c thực hiện trên cell 3 điện cực kín khí nối vớ i dòng argon, dung dịch đượ c sục khí argon 5-10 phút để đuổi oxi tr ướ c mỗi lần đo, thể tích cell là 10mL. Quét thế từ -200 tớ i 1200mV và -200 t ớ i 600mV. Điện cực so sánh là calomen bão hòa cách biệt vớ i dung dịch bở i cầu nối, bên trong cầu nối có cùng dung môi và ch ất
điện ly bổ tr ợ. Điện c ực b ổ tr ợ có dạng xoắn di ện tích bề mặt 1cm2, là 1 sợ i platium dài khoảng 5cm đườ ng kính 1mm. Điện cực làm việc gồm những đĩ a thu đượ c từ mặt cắt ngang của sợ i dây bằng vàng có các đườ ng kính khác nhau đặt bên trong vật liệu thủy tinh. Giữa các lần chạy, điện cực làm việc đượ c đánh bóng bằng bột alumina trong 3 phút
để loại bỏ các sản phẩm oxi hóa hấ p thụ mạnh trên bề mặt điện cực, những sản phẩm này sẽ cản tr ở bề mặt điện cực, ảnh hưở ng tớ i lần thế thứ 2 dù là ở pH nào. Điện cực làm việc
28
cũng có thể làm bằng Cacbon đườ ng kính 3mm hoặc có dạng đĩ a quay đườ ng kính 2mm nằm giữa lõi Teflon, hoạt động ở vận tốc góc = 105rad/s, quét th ế 20mV/s đảm bảo tr ạng thái ổn định. Số electron trong phản ứng điện hóa có thể đượ c xác định bằng nhiều cách. Phươ ng pháp phổ bi ến nhất dùng phép đo điện l ượ ng coulometry, xác định số l ượ ng của chất điện phân giải phóng trong thờ i gian điện phân bằng cách đo s ố culong đã s ử d ụng. Tuy nhiên khi sử d ụng giá tr ị n từ ph ươ ng pháp culong để giải thích phổ CV thườ ng gặ p tr ở ngại, vì khoảng thờ i gian và các điều kiện phản ứng tươ ng đối khác nhau. Trong phép
đo điện lượ ng coulometry thờ i gian là 1 gi ờ và lớ p phản ứng là dung dịch gốc của cell đo, còn trong ph ươ ng pháp CV thờ i gian ngắn hơ n 1 giây và l ớ p phản ứng khoảng một vài mm tính từ bề mặt điện cực. Các bài báo tr ướ c đây thườ ng dùng một phươ ng pháp r ất phổ biến để xác định n trong CV là: chất chuẩn, thườ ng là ferrocene (n = 1), đượ c thêm vào cùng vớ i mẫu trong cell đo CV, r ồi so sánh tr ực tiế p cườ ng độ peak của chuẩn và chất nghiên cứu. Tuy nhiên việc so sánh này dựa trên giả thiết hệ số khuếch tán của chuẩn và mẫu là như nhau (thườ ng h ệ số khuếch tán r ất khó biết tr ướ c). Ngoài ra cũng phải tính đến các phản ứng hóa học đồng thể và d ị thể có thể ảnh hưở ng tớ i hình dạng và chiều cao của sóng điện thế. Do đó phươ ng pháp này luôn thiếu chính xác. Tuy nhiên, n ếu đo lườ ng t ừ k ỹ thuật tức thờ i: Itransient = n D1/2 F A co ( Tc)-1/2
itransient tỉ lệ vớ i n D1/2 Vớ i Tc: thờ i gian khảo sát riêng. A: diện tích bề mặt điện cực. F: hằng số Faraday = 96500. D: hệ số khuếch tán bề mặt. co: nồng độ của dung dịch. K ết hợ p vớ i phép đo điện lượ ng voltametry tr ạng thái t ĩ nh (đo dòng Faraday đi qua dung dịch điện phân khi áp th ế thích hợ p vào điện cực làm việc)
29
isteady state = n D 4F co r o
isteady state tỉ lệ vớ i n D. D: hệ số khuếch tán cầu. r o: bán kính.
itransient i steadystate
n , lúc này hệ số khuếch tán D đượ c giản lượ c.
Nếu s ử d ụng các điện c ực khác nhau cho phép đo tức thờ i và tr ạng thái t ĩ nh, cần
điều chỉnh dòng đo đượ c vì có hiệu ứng diện tích điện cực. Tuy vậy chúng ta có th ể tránh việc chuẩn hóa này nếu các phép đo giống nhau thực hiện trên cùng điện cực và cùng một chất chuẩn đã biết n và D gi ống như ferrocene. 3.3.3 Giớ i thiệu về LC/MS/MS12 Sắc ký lỏng ghép khối phổ là một thiết bị lý tưở ng cho các phòng thí nghi ệm. LC/MS là phươ ng pháp đượ c dùng trong phân tích vết và các hợ p chất cần nhận danh chính xác vì trong nh ững điều kiện vận hành nhất định ngoài thờ i gian lưu đặc tr ưng, hóa chất còn đượ c nhận danh bằng khối phổ của nó. Độ nhạy LC/MS tùy thuộc vào hợ p chất cần phân tích và giao di ện s ử dụng. Trong sắc ký lỏng ghép khối phổ, hỗn hợ p chất phân tích sau khi tách ra kh ỏi cột sẽ đi qua một đườ ng truyền đến đầu dò khối phổ. Cột sắc ký lỏng cho phép tách chất c ần quan tâm, khối phổ cho phép tách ion c ần quan tâm và cho biết phân tử lượ ng của chất phân tích. Một hệ thống LC/MS/MS sẽ phân mảnh ion mẹ thành các ion con và tách các ion con để định danh và định lượ ng. Một hệ LC/MS cơ b ản gồm hệ thống bơ m sắc ký lỏng, bộ ph ận tiêm mẫu, c ột sắc ký, đầu dò khối phổ. Nhiệm vụ của đầu dò khối phổ:
Nhận danh hóa chất: Một mũi trên sắc ký đồ vớ i th ờ i gian lưu xác định đặc tr ưng cho hóa chất, tR này
chính là thờ i gian từ lúc hóa chất bắt đầu vào cột và ra khỏi cột để vào đầu dò khối phổ.
30
Mũi này biểu diễn tổng cườ ng độ các ion sinh ra t ừ phân tử hóa chất thông qua k ỹ thuật ion hóa xác định. Tổng các mũi này trên sắc đồ hợ p thành sắc đồ tổng ion (total ion chromatogram). Mũi này cũng có thể biểu diễn cườ ng độ của một loại ion sinh ra từ s ự phân mảnh của phân tử hóa chất hoặc từ sự phân mảnh của một loại ion của hóa chất. Khối phổ tươ ng ứng c ủa hóa chất ho ặc khối phổ biểu di ễn c ườ ng độ các ion sinh ra từ một ion nhất định. Như thế việc nhận danh thông qua vừa thờ i gian lưu vừa khối phổ sẽ chính xác hơ n là chỉ dựa vào thờ i gian lưu.
Định lượ ng nồng độ của hóa chất trong mẫu.
Các bộ phận chính của khối phổ gồm: bộ tạo ion, bộ tách ion, bộ dò ion. So sánh 2 k ỹ thuật ion hóa APCI và ESI:
Giống nhau: -
Đều thuộc loại ion hóa mềm, ít tạo sự phân mảnh, trong nhiều tr ườ ng hợ p còn thấy
đượ c phân tử ban đầu. -
Nếu có sự phân mảnh ion thì cách phân mảnh c ũng đơ n giản, giúp đoán nhận cấu
trúc chất ban đầu dễ dàng hơ n. sát.
Cả hai k ỹ thuật đều có thể tạo ion âm hoặc dươ ng tùy theo c ấu trúc hợ p chất khảo
31
Khác nhau:
K ỹ thuật phun ion (ESI: electrospray
K ỹ thuật ion hóa hóa học ở áp suất thườ ng
ionization)
(APCI:
atmospheric
pressure
chemical
ionization) -
Ion tạo trong pha dung d ịch
-
Ion tạo trong pha h ơ i
-
Thích hợ p cho chất không bền nhiệt
-
Thích hợ p cho chất không bền nhiệt
-
Có thể tạo sự phân mảnh ít hơ n APCI
-
Có thể tạo sự phân mảnh nhiều hơ n ESI
-
Thích hợ p cho chất khá phân cực
-
Thích hợ p cho chất ít phân c ực
-
Thích hợ p cho chất có phân tử khối
-
Thích hợ p cho chất có phân tử khối nhỏ
lớ n
32
K ỹ thuật APCI: khi phân t ử chất phân tích và dung môi đi qua một lò sấy s ẽ hóa hơ i,
các phân t ử hơ i đượ c khí N2 phun ra và đi vào vùng phóng điện (corona discharge). Hi ện tượ ng ion hóa xảy ra:
Cơ chế tạo ion dươ ng:
N2 + e- → N2 + 2eH2O + e- → H3O+ +2eH2O + H3O+ → H3O+ + OH· M + H3O+ → MH+ + H2O
Cơ chế tạo ion âm: vớ i những phân tử có H linh động, trong vùng phóng
điện, có sự ion hóa của phân tử bằng cách mất đi H+, phần còn lại là một anion: OH· + M → (M-H)- + H2O
K ỹ thuật phun ion ESI: -
Các phân tử hóa chất và dung môi ra khỏi cột sắc ký đượ c đưa vào một ống mao
quản bằng kim loại cao thế và sau đó đượ c phun mịn bằng khí N2 thoát ra chung quanh ống mao quản. -
Dướ i tác dụng của điện thế cao, có sự tạo thành những hạt nhuyễn mang điện tích
thoát ra từ đầu ống mao quản. -
Sau đó các phân tử dung môi từ từ b ốc hơ i. Các hạt mang điện có thể tích nhỏ d ần
và do s ự đẩy nhau giữa các điện tích cùng dấu, chúng sẽ b ể ra thành nh ững h ạt nhỏ mang
điện tích. -
Sau đó các ion dươ ng hoặc âm tạo thành đượ c đưa vào bộ phận tách ion qua m ột
cửa r ất nhỏ. Dung môi và khí N 2 bị bơ m hút ra ngoài.
33
-
Điện th ế d ươ ng ở đầu kim tạo ion dươ ng, điện th ế âm thì tạo ion âm và đượ c quyết
định tùy theo ch ất khảo sát. -
Các chất có tính acid t ạo ion âm ở pH cao, còn ch ất có tính baz t ạo ion dươ ng ở pH
thấ p.
3.3.4 Giớ i thiệu thiết bị khối phổ FINNIGAN LCQ deca17 (hãng Thermo Quest Finnigan). Thiết bị HPLC (TPS Spectra system) bao g ồ m b ộ l ấy mẫu tự động (spectra system AS3000), bơ m P4000 gradient pump (spectra system P4000) và b ộ loại khí chân không,
đầu dò UV 6000 (spectra system SN4000) LP flow cell 5cm n ối vớ i đầu dò MS (LCQ Deca). Thể tích anthocyanin kho ảng 10L tiêm vào c ột Phenomenex (Torrance, California, USA) Luna C18 (150mm 2.0mm, kích thướ c hạt 3m), chươ ng trình r ửa giải ở bảng 3.
Hình 16: H ệ thố ng LC-UV- MS t ại phòng thí nghiệm
Đầu dò MS là một bẫy ion LCQ-Deca (ThermoFinnigan) v ớ i giao diện ion hóa phun điện tử chạy ở dạng ion dươ ng. Áp thế dươ ng +3 → +4kV vào kim silica, dung môi t ạo giọt bay lên, khí Helium đẩy các hạt khí và giúp phân nh ỏ, các hạt khí này va ch ạ m nhau , dòng điện 80mA, thế mao quản 23mV, nhiệt độ mao quản 225oC, thấu kính (tube lens) cài
34
đặt ở hiệu thế -5V, sheath gas (He) 1.2 L/phút và khí b ổ tr ợ (He) 6 L/phút. Ph ổ hấ p thu DAD đặt ở bướ c sóng 200 tớ i 800nm. Bẫy ion chạy ở dạng quét scan MS/MS tùy thuộc d ữ liệu, lần quét đầu cài đặt ở khoảng m/z= 200-1200. Lần quét thứ hai khai báo ion có c ườ ng
độ cao nhất từ lần quét đầu và thu phổ MS lần hai, tươ ng tự lần quét 3 MS3 khai báo ion cườ ng độ cao ở l ần 2. Năng l ượ ng va chạm 28%, thờ i gian kích hoạt 30ms. Sau khi đượ c tách nhỏ, ion con có điện tích lớ n hơ n điện tích của phân tử mẹ, ESI là k ỹ thuật ion hóa mềm, chỉ cần vài giây để thực hiện sự phân mảnh.
Hình 17: S ơ đồ của giao diện ESI 14
Nhìn chung, 1 chất đi vào máy MS tr ải qua 3 bướ c:
Đầu tiên, phân t ử đượ c bắn phá bở i dòng electron n ăng lượ ng cao, chuyển phân t ử
thành ion. Ion phân t ử tăng tốc đến tr ườ ng t ĩ nh điện.
Tiế p theo, trong tr ườ ng t ĩ nh điện hay nam châm điện, các ion gia t ốc đượ c phân tách
tùy theo tỉ lệ khối lượ ng/điện tích.
Cuối cùng, các ion có t ỉ l ệ khối lượ ng/điện tích đặc tr ưng đượ c phát hiện. Dòng ra
của đầu dò đượ c khuếch đại và ghi đo. Chất phân tích từ s ắc ký lỏng hoặc b ơ m xy lanh chuyển qua kim phun, tạo các giọt tích điện ở cu ối đầu kim. Dòng He không tích điện trung hòa chất lỏng và giúp dung môi bay hơ i thành gi ọt. Khi dung môi bay h ơ i, các phân tử ch ất phân tích b ị đẩy gần nhau hơ n,
35
chúng đẩy lẫn nhau và các gi ọt bị vỡ ra. Quá trình này do l ực kháng culong giữa các ion gây ra. Quá trình này s ẽ d ừng l ại khi các phân t ử không còn liên k ết vớ i dung môi và tr ở thành các ion riêng r ẽ. Sau đó chúng đượ c phát hiện. Anthocyanin ở dạng ion dươ ng, vì vậy chúng không cần ion hóa mà tr ực ti ế p đi vào máy MS sau khi bay hơ i dung môi. Quá trình như sau:
Thí nghi ệm khối tandem mass chính là các b ướ c lựa chọn khối phổ vớ i các dạng vỡ xuất hiện giữa các quá trình. Trong thí nghiệm tandem mass, thông tin v ề cấu trúc đượ c tìm thấy qua các mảnh vỡ lần 2 và 3 (MS2, MS3). Vớ i anthocyanin, khi các nhóm đườ ng mất
đi, tùy vào khối lượ ng phân tử bị mất, có thể xác định đó là đườ ng hexose hay pentose. Sau khi mất gốc đườ ng, sẽ nhận biết nhóm aglycone. Loại aglycone đượ c nhận danh khi so sánh vớ i những nhóm đã biết.
2
Hình 18: Mô t ả phươ ng pháp tandem mass t ạo ra các mảnh vỡ ion t ừ MS trong thiế t bị triple quadropole.
Trong ion trap, các ion b ị loại ra kh ỏi bẫy ngoại tr ừ ion cần đượ c bắn phá ở l ần 2. Thiết bị áp m ột t ần số sóng radio svớ i t ần số c ộng h ưở ng bằng vớ i vận tốc góc c ủa ion trong bẫy. Nhờ t ần s ố sóng này, năng l ượ ng động l ực đượ c chuyển vào ion và ion bắt đầu luân chuyển trong ion trap ở một bán kính lớ n hơ n. Ekinetic = m × r × 2
36
Ion có nguồn n ăng lượ ng động học này sẽ va chạm vớ i một trong các nguyên t ử He vốn ở sẵn trong ion trap, lúc này quá trình b ắn phá xuất hiện. Năng lượ ng động học này tùy vào độ khuếch đại của tín hiệu sóng radio và đượ c hiệu chỉnh bở i số % do bộ vận hành MS, trong máy LC-UV-MS tại tr ườ ng Roskidle khoảng 25-50%.
