PERCOBAAN V BIOASSAY EKSTRAK BAHAN ALAM ( Cymbopogon nardus L) A. Tujua ujuan n Percobaa Percobaan n Tujuan Tujuan dari percobaan percobaan ini adalah : 1. Untuk Untuk menge mengetah tahui ui prins prinsip ip dasar dasar penguj pengujian ian ekstrak ekstrak bahan bahan alam. 2. Untuk
mengetahui
proses
uji
bioassay
dengan
menggunakan menggunakan metode Brine Shrimp Lethality Test (BST). B. Tin Tinjau jauan an Pu!a" Pu!a"a a Uji toksisi toksisitas tas akut akut adalah adalah suatu suatu penguj pengujian ian untuk untuk menetap menetapkan kan potens potensii toksisitas akut LD 50, menilai berbagai gejala toksik, spektrum efek toksik, dan mekanisme kematian. Tujuan uji toksisitas akut adalah untuk mendeteksi adanya toksisitas suatu zat, menentukan organ sasaran dan kepekaannya, memperoleh data data bahay bahayany anyaa setel setelah ah pemb pember erian ian suatu suatu senya senyawa wa seara seara akut akut dan dan untu untuk k memperoleh memperoleh informasi awal yang dapat digunakan digunakan untuk menetapkan menetapkan tingkat tingkat dosis yang diperlukan untuk uji toksisitas selanjutnya !"oeksmanto dkk #0$0%. &etode &etode uji toksisitas dilakukan dilakukan seara in vitro maupun in vivo. "alah satu metode metode toksisitas toksisitas in 'itro 'itro yang yang sering sering diguna digunakan kan adalah metode Brine Shrimp Letality Test Test !("LT%. &etode ("LT merupakan salah satu ara yang epat dan murah untuk skrining toksisitas dari ekstrak tanaman dengan menggunakan hewan laut yaitu lar'a udang Artemia udang Artemia salina Leah. Uji toksisitas dengan metode ("LT ini memiliki spektrum akti'itas farmakologi yang luas, prosedurnya sederhana, epat dan tidak membutuhkan biaya yang besar, serta hasiln ya dapat diperaya. Di sampin samping g itu, itu, metode metode ini sering sering dikaitk dikaitkan an dengan dengan metode metode penapi penapisan san senyawa senyawa antikanker. Dengan alasan)alasan tersebut, maka uji ini sangat tepat digunakan dalam mengawali penelitian bahan alam !*rengki dkk., #0$+%. (eberapa obat tradisional melibatkan penggunaan ekstrak tanaman mentah yang mungkin mengandung keragaman yang luas dari molekulnya, sering dengan efek biologis terbatas. amun, sebagian besar informasi informasi yang tersedia tersedia mengenai mengenai potensi obat tanaman ini tidak dilengkapi dengan data ilmiah yang kredibel.
Untuk alasan ini, beberapa penelitian telah dilakukan untuk menentukan toksisitas tanaman obat. "ebuah bioassay umum yang munul mampu mendeteksi spektrum yang luas dari bioakti'itas kini dalam ekstrak mentah tanaman adalah Brine Shrimp !-rtemia sp.% Lethality Assay !("L-%. ("L- digunakan sebagai indikator toksisitas umum dan juga sebagai panduan untuk mendeteksi antitumor dan senyawa pestisida. (iaya rendah dan kemudahan melakukan pengujiannya dan ketersediaan komersial telur udang air asin murah membuat ("L- sebuah tempat top metode yang sangat berguna. engujian ini telah teratat sebagai alat yang berguna untuk isolasi senyawa bioaktif dari ekstrak tumbuhan !/lowa, #0$%. "enyawa yang diduga memiliki akti'itas anti kanker, harus diujikan terlebih dahulu pada hewan perobaan. enelitian ini menerapkan metode Brine Shrimp Lethality Test !("T% dengan menggunakan lar'a udang Artemia salina leach sebagai hewan uji. &etode ini merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk penarian senyawa anti kanker baru yang berasal dari tanaman. !&utia, #0$0%. Uji toksisitas dilakukan sebagai tes awal untuk menentukan potensi produk alami biologis aktif dalam pengembangan obat)obatan. Brine Shrimp Lethality Test !("LT% dianggap sebagai sreening awal untuk kehadiran antitumor atau antikanker. enelitian ini bertujuan untuk mengetahui toksisitas, antikanker, dan potensi antioksidan !Utami dkk ., #0$+%. Uji ("T dilakukan dengan sedikit modifikasi. Telur -rtemia salina !sekitar 0 mg% ditempatkan ke dalam penetasan ruang dan disimpan di bawah aerator konstan selama #+ jam. "etelah menetas, nauplii aktif dikumpulkan dengan pipet Pasteur yang digunakan untuk pengujian. "ampel uji yang dibuat sebagai berikut. Dua puluh miligram setiap senyawa disintesis ditimbang, dilarutkan, dan dienerkan mengikuti prosedur pengeneran dijelaskan oleh &Laughlin untuk memberikan berbagai jumlah sampel sesuai dengan $.000 ppm, $00 ppm, $0 ppm, $ ppm, dan 0,$ ppm, masing)masing dalam rangkap tiga. (erdasarkan criterium Meyer bahwa zat murni dianggap beraun jika nilai L1 50 kurang dari 0 ppm !2udyanto dkk ., #0$+%.
. !lat dan Bahan $
-lat -lat)alat yang digunakan pada perobaan ini adalah3
#
a
-erator
b
(otol 'ial
4elas kimia $00 ml dan #50 ml
d
4elas ukur $0 ml
e
eranjang
f
Lampu pijar
g
/'en
h
ipet tetes
i
"enter
j
"poit $ ml dan 5 ml
k
6adah penetas
(ahan (ahan)bahan yang digunakan pada perobaan ini yaitu3 a
-kuades
b
-ir laut pantai nambo
7kstrak serei !Cymbopogun nardus.L%
d
7til asetat
e
*raksi ekstrak etil asetat
f
*raksi ekstrak metanol
g
*raksi ekstrak )heksan
h
n)9eksan
i
Lar'a udang Artemia salina Leah
j
&etanol
k
Tissu
l
D&"/ ! Dimethyl Suo!ide%
#. Proe$ur Kerja 1). Penetasan Larva
Telur udang -rtemia "alina7.Leah
mbil telur udang -rtemia "alina Leah seukupnya dan direndam dalam air suling selama $0 menit " isakan telur udang yang terapung dan yang tenggelam. Telur udang yang terapung dibuang karena tidak berisi, sedangkan y asukkan dalam wadah plastik berbentuk keruut, lalu ditambahkan air laut asukkan aerotor kedalam wadah penetes dan berikan ahaya lampu pijar iamkan selama +8 jam lar'a siap digunakan untuk penggujian.
Lar'a udang
2. Pembuatan Larutan Stok
*raksi Di timbang masing)masing fraksi heksan, fraksi etil asetat dan fraksi metanol sebanyak $5 mg Di larutkan masing)masing fraksi dengan pelarut D&"/ sebanyak $5 ml dalam tabung reaksi Di aduk hingga larut dan homogen
onsentrasi $000 ppm Di ambil :,5 ml larutan stok $000 ppm !untuk masing)masing fraksi% Di ukupkan dengan air laut $5 ml onsentrasi 500 ppm Di ambil :,5 ml larutan stok 500 ppm !untuk masing)masing fraksi% Di ukupkan dengan air laut $5 ml
onsentrasi #50 ppm Di ambil :,5 ml larutan stok #50 ppm !untuk masing)masing fraksi% Di ukupkan dengan air laut $5 ml onsentrasi $#5 ppm Di ambil$5 ml D&"/ !untuk kontrol negatif% onsentrasi 0 ppm
3. Pelaksanaan Uji
*raksi
$000 ppm pppppm 500 ppm
#50 ppm
$#5 ppm
0 ppm
Di ambil $ ml, di masukkan dalam 'ial, dan di lakukan seara triplo Di masukkan $0 ekor lar'a, di ukupkan 5 ml air laut Di diamkan selama #+ jam Di amati
9asil pengamatan;
E. Hai% Pen&a'a!an $. < ematian !&ortalitas%
#o.
1.
2.
,.
/. *.
Sampel
-elarut metanol
-elarut etil asetat
-elarut n" heksan
$ontrol negati3
$onsentrasi
%umlah &ar'a ati*eplikasi 1 2 ,
+ ortalitas
1 ppm
/
2
2
20
ppm
2
/
,0
2 ppm
,
,
1
2,
12 ppm
1
1
,
10
ppm
,
/
2
,
1 ppm
ppm
2
,
2
2,
2 ppm
,
,
,
,
12 ppm
2
2
1,
ppm
2
2
2
2
1 ppm
/
,
1
20
ppm
/
,
2
,
2 ppm
,
1
,
12 ppm
1
2
2
10
ppm
,
2
1
2
ppm
#. ilai robit
&og + ortalitas -robit $onsentrasi /4,5 1 ppm ,4 20 240 ppm ,0 /40
Sampel
$onsentrasi
-elarut metanol
2 ppm
24/
2,
/42
12 ppm
241
10
/4
ppm
140
,
/4/6
1 ppm
,4
42
ppm
240
2,
/42
2 ppm
24/
,
/4/6
12 ppm
241
1,
,460
ppm
140
2
/41
1 ppm
,4
20
/4,5
ppm
240
,
/4/6
2 ppm
24/
,
/4/6
12 ppm
241
10
/4
ppm
140
2
/41
ppm
"
"
-elarut etil asetat
-elarut n" heksan
$ontrol negati3
. 9asil -nalisis 2egresi
Probit vs Log Concentration (/) 0 .*+/ 1 -.2 R3 0 .4
,
robit of &ortality
+
&inear ()
*
.
*
*.
+
+.
,
,.
-
Log 1onentration
a. *raksi &etanol
Probit vs Log Concentration (/) 0 .44/ 1 +.5 R3 0 .4
,
robit of &ortality +
&inear ()
*
.
*
*.
+
+.
Log 1onentration
b. *raksi etil asetat
,
,.
-
Probit vs Log Concentration (/) 0 .+4/ 1 ,.55 R3 0 .
robit of &ortality
&inear ()
.
*
*.
+
+.
,
,.
-
Log 1onentration
. *raksi n)9eksan
+. ilai L150
6. Sa'7 e%
elarut metanol
elarut etil asetat
elarut n)heksan
onsentrasi
< &ortalitas
robit
$000 ppm
#:
+,=
500 ppm
:
+,?:
#50 ppm
#
+,#?
$#5 ppm
$:
+,05
50 ppm
0
+,+8
$000 ppm
?0
5,#5
500 ppm
#
+,#?
#50 ppm
0
+,+8
$#5 ppm
$
,8:
50 ppm
#0
+,$?
$000 ppm
#:
+,=
500 ppm
0
+,+8
#50 ppm
0
+,+8
$#5 ppm
$:
+,05
50 ppm
#0
+,$?
&
5,=5$ mg>ml
245.1 21 7gml
+,88? @g>ml
F. Perhitungan
$
elarut &etanol < Aumlah lar'a mati a
$000 ppm 4 +2 + 2 3
b
3
2,33
$#5 ppm 1 +1+3 3
=
1,66
50 ppm 3+ 4+ 2 3
#
3,66
=
3
e
=
#50 ppm 3 + 3 +1
d
2,66
500 ppm 2 +5 + 4
=
=
3
elarut 7til -setat < Aumlah lar'a mati a
$000 ppm 6 +6 + 6 3
b
500 ppm
=
6
2 +3+ 2 3
3
3
3
=
1,33
50 ppm 2 +2+2 3
=
$#5 ppm 2 + 0 +2
e
2,33
#50 ppm 3 + 3 +3
d
=
=
2
elarut n)heksan < Aumlah lar'a mati a
$000 ppm 4 +3 + 1 3
b
3
3
3
=
3
$#5 ppm 1 +2+2 3
e
=
#50 ppm 5 + 3 +1
d
2,66
500 ppm 4 +3 + 2
=
50 ppm
=
1,66
3 + 2+ 1 3
=
2
6. Pe'ba8aan Toksisitas adalah potensi dari suatu senyawa kimia untuk dapat menyebabkan kerusakan ketika senyawa tersebut mengenai atau masuk kedalam tubuh makhluk hidup. Toksisitas menandakan adanya efek toksik>raun yang terdapat pada bahan sebagai sediaan single dose atau ampuran. Uji toksisitas umumnya bertujuan untuk menilai risiko yang mungkin ditimbulkan dari suatu zat kimia toksikan. Uji toksisitas dari suatu senyawa kimia biasanya dibagi menjadi tiga kategori yakni u ji toksisitas akut yang dilakukan dengan
memberikan bahan kimia yang sedang diuji sebanyak satu kali atau beberapa kali dalam jangka 8aktu 2/ jam. Uji toksisitas
jangka
pendek
(dikenal
dengan
subkronik)
dilakukan dengan memberikan bahan tersebut berulang" ulang4 biasanya setiap hari atau 9
seminggu4 selama
jangka 8aktu kurang lebih 1+ dari masa hidup he8an4 yaitu , bulan untuk tikus dan 1 atau 2 tahun untuk anjing sedangkan uji toksisitas jangka panjang (kronik)4 dilakukan dengan memberikan bahan kimia berulang"ulang selama masa
hidup
he8an
coba
atau
sekurang"kurangnya
sebagian besar dari masa hidupnya4 misalnya 16 bulan untuk mencit4 2/ bulan untuk tikus4 dan 0"1 tahun untuk anjing dan monyet.
erobaan ini bertujuan untuk mengetahui efek toksik dari ekstrak rimpang jahe merah menggunakan hewan oba berupa lar'a udang. Uji toksisitas akut dilakukan untuk mengukur derajat efek toksik suatu senyawa yang terjadi dalam waktu singkat, yaitu #+ jam setelah pemberiannya dalam dosis tunggal. Aumlah kematian hewan uji dipakai sebagai ukuran untuk efek toksik suatu bahan !kimia% pada sekelompok hewan uji jika dalam hal ini hewan uji dipandang sebagai subjek, respon berupa kematian tersebut merupakan suatu respon diskretik. (erarti hanya ada dua maam respon yaitu ada atau tidak ada kematian. &etode yang digunakan pada perobaan ini adalah metode ("LT ! Brine Shrimp Lethality Test %. &etode ("LT merupakan uji toksisitas yang digunakan sebagai uji permulaan untuk mengetahui akti'itas dari suatu zat atau senyawa yang terkandung dalam suatu ekstrak atau suatu isolat murni. Uji toksisitas dengan metode ("LT ini memiliki spektrum aktifitas farmakologi yang luas, prosedurnya sederhana, epat dan tidak membutuhkan biaya yang besar, serta hasilnya dapat di peraya. ("LT juga merupakan salah satu metode yang banyak digunakan untuk penarian senyawa antikanker baru yang berasal dari tanaman. &etode ("LT telah terbukti memiliki korelasi dengan akti'itas antikanker. Lar'a udang yang digunakan adalah jenis Artemia salina L. roses pembenihan telur udang dilakukan dalam media air laut. 9al ini dilakukan sebagai simulasi dari habitat asli lar'a udang yaitu air laut. 7kstrak yang digunakan adalah ekstrak rimpang jahe merah yang dibuat larutan dengan $$ 'ariasi konsentrasi yang berbeda !ppm% hal ini bertujuan untuk mengetahui pada kadar berapa ekstrak rimpang jahe merah dapat memberikan efek toksik pada lar'a udang. "elain itu, untuk masing)masing konsentrasi ekstrak dilakukan dua kali pengulangan prosedur yang dilakukan.
yakni untuk memastikan keefektifan
ada prakteknya dilakukan perlakuan yang sama untuk semua 'ariasi konsentrasi yang telah dibuat. Larutan ekstrak yang dimasukkan dalam botol 'ial dilarutkan terlebih dahulu dengan sedikit air laut. emudian dimasukkan $0 lar'a udang kedalamnya. roses pengambilan lar'a udang dilakukan harus dengan ermat. 9al ini dikarenakan ukuran lar'a udang yang sangat keil sehingga diperlukan kehati)hatian dalam proses pemindahannya. (otol 'ial yang telah berisi $0 lar'a udang kemudian diukupkan dengan air laut hingga batas tera yang telah ditentukan. &asa inkubasi dilakukan selama #+ jam untuk melihat respon dari lar'a udang terhadap masing)masing konsentrasi.
9asil yang diperoleh berdasarkan pengujian yang dilakukan, nilai L150 fraksi metanol sebesar 5,=5$ mg>ml, fraksi etil asetat sebesar #,?=.$0#$ @g>ml dan fraksi n)heksan sebesar +,88? @g>ml. "uatu ekstrak dikatakan toksik jika memiliki nilai L150 !onsentrasi yang mampu membunuh 50< lar'a udang% kurang dari $000 Bg>ml setelah waktu kontak #+ jam. /lehnya itu, berdasarkan hal tersebut, maka hasil yang diperoleh untuk fraksi n)heksan ekstrak sereh !Cymbopogon nardus L.% bersifat toksik, sedangkan fraksi metanol dan fraksi etil asetat yang diperoleh bersifat tidak toksik.
asil
pengamatan
selama
2/
jam
perlakuan
menunjukkan adanya he8an coba yang mati dan yang tetap bertahan hidup. emeriksaan toksisitas senyawa aktif atau bahan dapat digunakan sebagai syarat uji keamanan suatu obat baru, sehingga dapat diketahui jumlah takaran yang tepat berdasarkan tingkat toksisitas dari bahan yang digunakan
. $esimpulan esimpulan yang diperoleh
berdasarkan perobaan yang telah
dilakukan yaitu3 $. rinsip dasar pengujian ekstrak bahan alam dengan pengujian bioassay adalah suatu test atau uji yang menggunakan organisme hidup untuk mengetahui efektifitas suatu bahan hidup ataupun bahan organik dan anorganik terhadap suatu organisme hidup dan daya bunuh in 'i'o dari senyawa bioaktif terhadap organisme hewan yang dapat digunakan untuk menapis ekstrak tumbuhan yang mempunyai bioakti'itas dan juga memonitor fraksi bioaktif selama fraksinasi dan pemurnian. #. Brine Shrimp Lethality Test !("LT% dapat dilakukan dengan menggunakan senyawa bahan alam terhadap lar'a udang Artemia Salina Leah. 9asil dari perobaan ini yaitu nilai L150 fraksi metanol sebesar 5,=5$ mg>ml, fraksi etil asetat sebesar #,?=.$0#$ @g>ml dan fraksi n)heksan sebesar +,88? @g>ml, untuk fraksi n)heksan ekstrak sereh !Cymbopogon nardus L.% bersifat toksik, sedangkan fraksi metanol dan fraksi etil asetat yang diperoleh bersifat tidak toksik.
;!
Sunanto4 .4 254 100 Resep Sembuhkan Hipertensi, Asam Urat, dan Obesitas4 -T. =le9 edia $omputindo4 %akarta. Utami, -.6., -. T. 6ahyudi, dan F. (atubara, #0$+, ToEiity, -ntianer and -ntioEidant -ti'ity of 7Etrats *rom &arine (ateria -ssoiated 6ith "ponge "aspis sp., %nternational (ournal o Pharma and Bio Sciences, Col. 5, o. +.
LAP!A" F#$%#A # P'!C(AA" # (#ASSA* '%S$!A% (A+A" ALA& ,Orthosiphon aristatus)
L'+ "A&A
- '/# SA!$#%A +
"#&
- 1A1102
%'LAS
-(
%'L&P%
- ## ,$UU+)
AS#S$'"
- !A+ A!A"#
U!USA" FA!&AS# FA%UL$AS FA!&AS# U"#'!S#$AS +ALUL' %'"A!# 214