PENGUKURAN KONSENTRASI DNA
A. TUJUAN Mahasiswa dapat melakukan pengukuran konsentrasi DNA dengan menggunakan spektrofotometer. B. DASAR TEORI Asam deoksiribonukleat atau lebih dikenal dengan DNA (deoxyribonucleid acid) adalah sejenis asam nukleat yang tergolong biomolekul utama penyusun berat kering setiap organisme. Di dalam sel, DNA umumnya terletak di dalam inti sel. Tetapi ada pula DNA yang terdapat di mitokondria, oleh karena itu disebut DNA mitokondria. Secara garis besar, peran DNA di dalam sebuah sel adalah sebagai materi genetik. Artinya, DNA menyimpan cetak biru bagi segala aktifitas sel. Dan ini berlaku umum bagi setiap organisme (Anonim, 2011). Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan metode spektrofotometri.
Uji
kuantitatif
DNA
adalah
analisis
untuk
menentukan
kandungan/jumlah DNA yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif (Larasati, 2011). Pengujian kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan menggunakan metode spektrofotometri.
Terdapat
beberapa
cara
yaitu
spektrofotometri
Vis
(visible),
spektrofotometri UV (ultra violet), Spektrofotometri UV-Vis (ultra violet – visible) dan Spektrofotometri Infra Red (Riyadi, 2009). Spektrofotometri merupakan suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi suatu senyawa berdasarkan kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan atau diabsorbsi (Riyadi, 2009). Pada praktikum kali ini digunakan spektrofotometri UV-VIS. Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan Visible. Sinar UV memiliki panjang
gelombang 190-380 nm. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan transparan. Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa preparasi. Namun perlu diingat, sampel keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sampel harus jernih dan larut sempurna. Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. Alat ini menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna juga untuk sample tak berwarna (Riyadi, 2011) Uji kuantitatif DNA dengan spektrofotometri UV-Vis, DNA murni dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin dan pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada 280 nm. Sehingga kemurnian DNA dapat dukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0. DNA hasil isolasi yang baik mempunyai tingkat kemurnian minimal 1,7, apabila kurang dari nilai tersebut maka dilakukan pemurnian ulang. Rumus perhitungan konsentrasi DNA adalah sebagai berikut: Abs 260nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA
C. ALAT & BAHAN
Alat 1. Speltrofotometer UV-VIS 2. Kuvet 3. Mikropipet
Bahan 1. Isolat DNA 2. Aquadest
D. PROSEDUR
Menentukan konsentrasi blangko: Masukkan 1 ml akuades ke dalam kuvet spektrofotometer untuk mengukur dengan sinar UV, lalu lakukan pembacaan pada panjang gelombang (λ) 260nm dan 280 nm.
Menentukan konsentrasi protein: Masukkan larutan DNA 10 µl ke dalam cuvet yang telah berisi 1 ml aquades, kemudian campur dengan baik.
Lakukan pembacaan spektrofotometer seprti paba penentusn konsentrasi blanko, ulangi langkah diatas untuk semua sampel larutan DNA.
Hitung jumlah DNA dengan asumsi 1 Abs260nm = 40µg DNA Rumus : ( Abs 260nm Lar. DNA – Abs 260 nm air X 40µg Jumlah larutan DNA plasmid (µl)
Menentukan kemurnian DNA: Hitung dengan menggunakan rumus: Abs 260 nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA
E. HASIL PENGAMATAN Pengukuran konsentrasi DNA Abs Blangko (aquadest): λ260 nm = -0,001 λ280 nm = 0,000 Sift Senin
Kelompok
Absorbansi λ 260 nm
λ 280 nm
1
0,055
0,012
2
0,084
0,091
3
0,078
0,121
4
0,005
0,007
5
0,003
0,015
6
0,045
0,028
Sift Jumat
Kelompok
Absorbansi λ 260 nm
λ 280 nm
1
-
-
2
0,028
0,019
3
0,078
0,018
4
0,041
0,011
5
0,032
0,035
6
-
-
F. PEMBAHASAN Pada praktikum pengukuran DNA pada Sift Jumat didapatkan konsentrasi masinh-masing kelompok. Pada kelompok 1 dan 6 tidak didapatkan data absorbansi karena sampel larutan DNA tidak mencukupi karena telah digunakan untuk melaksanakan percobaan pemotongan DNA. Untuk itu data kelompok 2 sampai 5 yaitu sebagai berikut: Kelompok 2: Konsentrasi DNA =
( Abs 260nm Lar. DNA – Abs 260 nm air ) Jumlah larutan DNA plasmid (µl)
=
0,028– (-0,001) 10 µl
=
X 40µg
0,029 10 µl
=
X 40µg
X 40µg
0,116 µg/ µl
Kelompok 3: ( Abs 260nm Lar. DNA – Abs 260 nm air ) Konsentrasi DNA =
=
Jumlah larutan DNA plasmid (µl)
0,078– (-0,001) 10 µl
=
0,079 10 µl
=
X 40µg
0,316 µg/ µl
X 40µg
X 40µg
Kelompok 4: Konsentrasi DNA =
( Abs 260nm Lar. DNA – Abs 260 nm air )
X 40µg
Jumlah larutan DNA plasmid (µl)
=
0,041– (-0,001) 10 µl 0,042
=
10 µl
= Kelompok 5:
X 40µg
X 40µg
0,168 µg/ µl ( Abs 260nm Lar. DNA – Abs 260 nm air ) X 40µg
Konsentrasi DNA =
=
Jumlah larutan DNA plasmid (µl)
0,032– (-0,001) 10 µl 0,033
=
10 µl
=
X 40µg
X 40µg
0,132 µg/ µl
Tingkat kemurnian DNA dari masing-masing kelompok yaitu sebagai berikut: Kelompok 2 : Abs 260 nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA
Tingkat kemurnian =
0,028 =
=
0,019
1,474
Kelompok 3: Tingkat kemurnian =
Abs 260 nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA 0,078
=
=
0,018
4,334
Kelompok 4: Tingkat kemurnian =
Abs 260 nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA
0,041 =
=
0,011
3,727
Kelompok 5: Tingkat kemurnian =
Abs 260 nm larutan DNA Abs 280 nm larutan DNA 0,032
=
=
0,035
0,914
Tingkat kemurnian dari kelompok 2 dan 5 tidak memenuhi syarat kemurnian karena tidak memasuki rentang kemurnian pada 1.8-2.0. Hal ini dapat disebabkan oleh : 1) ketidak telitian praktikan dalam melakukan isolasi DNA 2) Sampel yang digunakan pada saat perhitungan konsentrasi tidak memenuhi volume 10 l.
G. KESIMPULAN
Dari percobaan yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa: 1. Konsentrasi masing-masing sampel DNA adalah Kelompok 2: 0,116 µg/ µl , Kelompok 3: 0,316 µg/ µl , Kelompok 4 : 0,168 µg/ µl , dan Kelompok 5: 0,132 µg/ µl 2. Tingkat kemurnian dari kelonmpok 2 dan 5 tidak memenuhi syarat kemurnian karena tidak memasuki rentang kemurnian pada 1.8-2.0.
H. DAFTAR PUSTAKA
Fatchiyah, 2011. Modul Pelatihan Analisis Fingerprinting DNA Tanaman Dengan Metode RAPD. Laboratorium Sentral Ilmu Hayati Universitas Brawijaya, Malang.
Larasati,
P.
2011.
Quantifikasi
DNA
dan
http://puspalarasati.wordpress.com. [ Diakses tanggal 30 Mei 2012]
Analisis
Kualitas.
