LAPORAN PRAKTIKUM BIOKIMIA Pengaruh Inhibitor Terhadap Aktifitas Enzim
Oleh : Kelompok 4 - Offering C Desy Ratna Sugiarti
(130331614749) (130331614749)
Rita Nurdiana
(130331614740)* (130331614740)*
Sikya Hiswara
(130331614743) (130331614743)
Yuslim Nasru S.
(130331614748) (130331614748)
UNIVERSITAS NEGERI MALANG FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM JURUSAN KIMIA APRIL 2016
A. Tujuan Percobaan
Setelah mengikuti percobaan ini, mahasiswa diharapkan : 1) Mampu memahami pengaruh inhibitor terhadap aktifitas enzim. 2) Mampu menjelaskan peristiwa inhibisi kompetitif terhadap aktifitas enzim. B. Dasar Teori
Enzim adalah biomolekul berupa protein yang berfungsi sebagai katalis dalam suatu reaksi kimia organik. Enzim memiliki tiga karakteristik, yaitu yang Pertama, fungsi dasar enzim adalah untuk meningkatkan laju reaksi. Kebanyakan reaksi seluler terjadi sekitar satu juta kali lebih cepat daripada mereka tanpa adanya enzim. Kedua, sebagian besar enzim bertindak secara khusus dengan hanya satu reaktan (disebut substrat) untuk menghasilkan produk. Karakteristik ketiga dan yang paling luar biasa adalah bahwa enzim diatur dari keadaan aktivitas rendah ke aktivitas yang tinggi dan sebaliknya. Enzim bekerja dengan cara menempel pada permukaan molekul zat-zat yang bereaksi sehingga mempercepat proses reaksi. Percepatan reaksi terjadi karena enzim menurunkan energi pengaktifan yang dengan sendirinya akan mempermudah terj adinya reaksi. Enzim mengikat molekul substrat membentuk kompleks enzim substrat yang bersifat sementara dan lalu terurai membentuk enzim bebas dan produknya Kerja enzim dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya adalah substrat, suhu, keasaman, kofaktor dan inhibitor. Tiap enzim memerlukan suhu dan pH(tingkat keasaman) optimum yang berbeda-beda karena enzim adalah protein yang dapat mengalami perubahan bentuk jika suhu dan keasaman berubah. Di luar suhu atau pH yang sesuai, enzim tidak dapat bekerja secara optimal atau strukturnya akan mengalami kerusakan. Kerja enzim juga dipengaruhi oleh beberapa jenis molekul, salah satunya adalah inhibitor. Inhibitor merupakan suatu senyawa yang dapat menghambat atau menurunkan laju reaksi yang dikatalisis oleh enzim. Inhibitor dibedakan menjadi 2 yaitu inhibitor tidak dapat balik dan inhibitor dapat balik. Inhibitor irreversibel atau tidak dapat balik mengikat sisi aktif enzim melalui reaksi yang tidak dapat balik, sehingga inhibitor tidak dapat dipisahkan dari sisi aktif enzim. Keadaan ini menyebabkan enzim tidak dapat mengikat substrat atau inhibitor merusak beberapa komponen (gugus fungsi) pada sisi katalitik molekul enzim. Sedangakan inhibitor reversibel atau dapat balik, bekerja dengan mengikat sisi aktif enzim melalui reaksi reversibel dan inhibitor ini dapat dipisahkan atau dilepaskan kembali dari ikatannya. Inhibitor
dapat balik terdiri dari tiga jenis, yaitu inhibitor yang bekerja secara kompetitif, nonkompetitif, dan un-kompetitif. Dalam suatu campuran reaksi, inhibitor kompetitif akan mengikat sisi aktif enzim karena memiliki struktur tiga dimensi yang sama dengan substrat. Enzim yang telah mengikat inhibitor tidak dapat bereaksi dengan substrat untuk menghasilkan produk. Sedangkan enzim yang telah berikatan dengan substrat tidak dapat berikatan dengan inhibitor, akan tetapi menghasilkan hasil mengikuti reaksi kimia berikut ini :
Besarnya pengaruh inhibitor kompetitif ditentukan oleh konsentrasi inhibitor, konsentrasi substrat dan afinitas relatif substrat dan inhibitor terhadap enzim. Pada konsentrasi enzim tertentu konsentrasi substrat lebih rendah daripada inhibitor maka inhibitor lebih mampu berkompetisi mengikat enzim dibandingkan substrat. Sebaliknya jika konsentrasi substrat lebih tinggi maka inhibitor akan lebih sulit berkompetensi dalam mengikat substrat. Berdasarkan hal tersebut maka pengaruh inhibisi ini, jelas dapat diatasi dengan jumlah substrat yang berlebih. Sebagai contoh inhibitor kompetitif dalah malonat yang menghibisi reaksi yang dikatalis oleh enzim suksinat dehidrogenase. Pada daur asam sitrat, suksinat dehidrogenase mengkatalis oksidasi suksinat menjadi fumarat dengan mengubah C jenuh pada suksinat menjadi tidak jenuh atau berikatan rangkap. Reaksinya adalah sebagai berikut : -
COO CH2
-
COO
+ E-FAD
CH2
CH
+ E-FADH2
CH -
COO
-
COO
Malonat memiliki struktur yang mirip dengan suksinat yang dapat berikatan dengan pusat aktif enzim suksinat dehidrogenase membentuk kompleks EI sehingga tidak terbentuk fumarat.
C. Alat dan Bahan
1) Alat -
Tabung reaksi
-
Pipet tetes
-
Batang pengaduk
-
Gelas ukur
2) Bahan -
Metilen blue 0,05%
-
Homogenat hati
-
Buffer fosfat 0,1 M (pH 7,4)
-
Minyak parafin
-
Natrium suksinat 0,1 M
-
H2 O
-
Natrium malonat 0,1 M
D. Analisa Prosedur
No. Prosedur percobaan 1. Disiapkan 5 tabung reaksi. Tabung 1-4 dimasukkan metilen biru 0,05% sebanyak 0,5 mL.
2.
3. 4.
5.
6. 7. 8.
Ditambahkan H2O pada semua tabung reaksi masing-masing sebanyak 3 mL, 2,8 mL, 2,6 mL, 0,6 mL dan 6 mL. Ditambahkan buffer fosfat 0,1 M pH 7,4 pada semua tabung. Ditambahkan natrium suksinat 0,1 M pada tabung reaksi 1-3 sebanyak 2 mL, tabung 4 sebanyak 4 ml dan tabung 5 tidak ditambahkan Ditambahkan natrium malonat 0,1 M pada tabung reaksi 2-4 berturut-turut sebanyak 0,2 mL; 0,4 mL; 0,4 mL. Ditambahkan 2,5 mL homogenat hati pada masing-masing tabug. Diaduk dengan segera dan perlahan Ditambahkan beberapa minyak parafin untuk menutup permukaan larutan.
Analis prosedur Metilen biru sebagai indikator telah terjadinya pengoksidasian suksinat menjadi fumarat oleh enzim suksinat dehidrogease. Mekanismenya melalui reaksi redoks, metilen biru akan tereduksi menjadi bewarna coklat muda dan suksinat akan teroksidasi Untuk melarutkan senyawa-senyawa yang akan dicampurkan Untuk mempertahankan pH pada pH optimum kerja enzim Sebagai substrat yang nantinya mengikat sisi aktif dari enzim suksinat dehidrogenase Sebagai inhibitor kompetitif atau yang menghambat kerja dari enzim suksinat dehidrogenase Sebagai sumber enzim suksinat dehidrogenase Agar reaksi tidak hanya terjadi pada bagian tertentu dari reagen saja untuk menghindari kontak udara bebas degan larutan karena parafin memiliki massa jenis yang lebih ringan daripada air sehingga akan terbentuk lapisan parafin di atas lapisan larutan ,sehingga dengan adanya parafin , oksigen dari udara bebas tidak akan masuk ke dalam larutan karena metilen biru tereduksi, secara cepat dapat
9.
Di inkubasi semua tabung pada penangas air pada suhu 380C. Diamati perubahan warna pada tiap tabung setiap 5 menit.
teroksidasi kembali dengan kehadiran oksigen udara Untuk mengoptimalkan reaksi, untuk mengetahui laju reaksi yang paling cepat dan paling lambat untuk merubah warna biru menjadi warna seperti larutan standar.
E. Data Pengamatan Tabung Metilen biru H2O ( mL) Buffer fosfat Natrium 0,05% 0,1 M pH 7,4 suksinat 0,1 M 1 0,5 ml 3,0 2 mL 2 mL 2 0,5 ml 2,8 2 mL 2 mL 3 0,5 ml 2,6 2 mL 2 mL 4 0,5 ml 0,6 2 mL 4 mL 5 6,0 2 mL Ditambahkan 2,5 mL homogenat hati dan beberapa tetes minyak parafin waktu Tabung 1 Tabung 2 Tabung 3 Tabung 4 T= 0 Biru (-) Biru (-) Biru Biru T= 5 Biru (--) Biru (--) Biru (-) Biru (-) T= 10 Biru (---) Biru (--) Biru (-) Biru (-) T= 15 Biru (----) Biru (--) Biru (-) Biru (-) T= 20 Biru (-----) Biru (---) Biru (--) Biru (-) T= 25 Biru (-----) Biru (--) Biru (--) Biru (------) T= 30 Biru (------) Biru (-----) Biru (---) Biru (--) Biru (------) T= 35 Biru (------) Biru (----) Biru (--) T= 40 Biru (------) Biru (------) Biru (-----) Biru (----) T= 45 Biru (------) Biru (------) Biru (-----) Biru (------) T=50 Biru (------) Biru (------) Biru (------) Biru (------) T=55 Biru (------) Biru (------) Biru (------) Biru (------) T=60 Biru (------) Biru (------) Biru (------) Biru (------) Keterangan : Biru (-) = warna biru sedikit pudar Biru (------) = warna biru hilang
Natrium malonat 0,1 M 0,2 mL 0,4 mL 0,4 mL Tabung 5 Coklat muda Coklat muda Coklat muda Coklat muda Coklat muda Coklat muda Coklat muda Coklat muda Coklat muda Coklat muda Coklat muda Coklat muda Coklat muda
F. Pembahasan Pada percobaan ini dilakukan uji pengaruh inhibitor terhadap aktifitas enzim dengan substrat natrium suksinat dan inhibitor natrium malonat. Inhibitor natrium malonat dipilih karena natrium malonat memiliki struktur yang hampir sama dengan natrium suksinat yang dapat berkompetisi dengan natrium suksinat untuk berikatan dengan pusat aktif enzim suksinat dehidrogenase. Enzim suksinat dehidrogenase diperoleh dari homogenat hati sapi. Hati sapi ini harus dihomogenatkan agar semua enzim yang terdapat dalam hati sapi tersebut dapat terekstrak. Kemudian homogenat harus disimpan dalam keadaan dingin agar enzim yang berada dalam homogenat hati tidak rusak. Untuk mengetahui pengaruh inhibitor terhadap aktivitas enzim dilakukan variasi perlakuan pada 5 tabung reaksi de ngan satu tabung sebagai larutan standart.
Mula-mula dimasukkan 0,5 ml metilen biru pada tabung 1-4. Penambahan metilen biru ini berfungsi sebagai indikator pengoksidasian suksinat menjadi fumarat oleh enzim suksinat dehidrogenase. Mekanismenya melalui reaksi redoks sederhana, ketika s ubstrat suksinat mengikat sisi aktif enzim suksinat dehidrogenase maka akan teroksidasi dan terbentuk fumarat yang ditandai dengan tereduksinya metilen biru dari berwarna biru menjadi tidak berwarna dengan reaksi sebagai berikut :
Selanjutnya ditambahkan air, kemudian ditambahkan buffer fosfat 0,1 M pada pH 7,4 bertujuan untuk menjaga kondisi pH larutan , karena enzim suksinat dehidrogenase bekerja maksimum pada pH 7,4. Kemudian dimasukkan natrium suksinat 0,1 M sebagai substrat. Setelah itu ditambahkan natrium malonat sebagi inhibitor kompetitif. Kemudian ditambahkan beberapa tetes minyak parafin untuk metilen biru tidak teroksidasi kembali. selanjutnya di inkubasi pada penangas air pada suhu 38 0C. Kemudian diamati warnanya untuk mengetahui laju reaksi mana yang paling cepat untuk merubah warna biru menjadi warna seperti larutan standar. Untuk tabung 1,2, dan 3 volume natrium suksinat dibuat sama yaitu sebanyak 2 ml sedangkan natrium malonat dibuat bervariasi yaitu 0; 0,2 ml; dan 0,4 ml. Hasil pengamatan menunjukkan waktu yang diperlukan untuk hilangnya warna biru berturut-turut adalah 25 menit, 35 menit dan 45 menit. Pada tabung pertama hilangnya warna biru paling cepat karena tidak terdapat inhibitor yang menghalangi substrat untuk berikatan dengan sisi aktif enzim. Pada tabung kedua waktu yang diperlukan untuk menghilangkan warna bir u lebih lama dari tabung pertama, hal ini disebabkan adanya inhibitor malonat yang menempel pada sisi aktif enzim yang menyebabkan sisi aktif enzim tidak dapat bereaksi dengan dengan suksinat, sehingga reaksi oksidasi tidak dapat berlangsung. Pada tabung 3 waktu yang diperlukan untuk menghilangkan warna biru lebih lambat dibandikan tabung 2, hal ini disebabkan karena volume malonat yang ditambahkan pada tabung 3 lebih banyak dibandingkan tabung 2,
sehingga lebih banyak inhibitor yang menempel pada sisi aktif enzim, yang menyebabkan reaksi oksidasi suksinat menjadi fumarat lebih lambat. Pada tabung ke 3 dan ke 4, volume natrium suksinat dibuat berbeda yaitu 2ml dan 4ml, sedangkan natrium malonat volumenya dibuat sama yaitu 0,4 ml. Hasil pengamatan menunjukkan waktu yang diperlukan untuk menghilangkan warna biru pada tabung ke-3 yaitu 45 menit dan pada tabung ke-4 yaitu 50 menit. Seharusnya waktu yang diperlukan oleh tabung 4 lebih sedikit, karena volume substrat yang ditambhkan lebih banyak dibandingkan tabung 3. Kesalahan ini mungkin disebakan ketika mengocok larutan terlalu keras sehingga enzim mengalami kerusakan. Untuk tabung ke-5 digunakan sebagai standar warna sebagai pembanding dengan tabung 1-4. Natrium malonat memiliki struktur dan muatan yang sama dengan substrat normal natrium suksinat, tetapi natrium malonat tidak dapat didehidrogenasi oleh enzim. NaOOCCH2COONa (natrium malonat) NaOOCCH2CH2COONa (natrium suksinat) Besarnya pengaruh inhibitor kompetitif ditentukan oleh konsentrasi inhibitor, konsentrasi substrat dan afinitas relatif substrat dan inhibitor terhadap enzim. Pengaruh inhibitor kompetitif dapat diatasi dengan substrat berlebih. (Susanti, 2013) G. Kesimpulan 1. Natrium malonat sebagai inhibitor berpengaruh terhadap aktifitas enzim suksinat dehidrogenase yang terdapat di dalam homogenat hati yakni inhibitor dapat menghambat kerja enzim suksinat dehidrogenase dengan mengikat sisi aktif enzim. 2. Peristiwa yang terjadi pada inhibisi kompetitif terhadap aktifitas enzim ialah enzim yang telah mengikat inhibitor tidak dapat berekasi dengan substrat untuk menghasilkan produk, sedangkan enzim yang telah berikatan dengan s ubtrat tidak dapat berikatan dengan inhibitor, akan tetapi menghasilkan hasil mengikuti reaksi kimia berikut ini:
H. Daftar Pustaka
Imana. 2014. Pengaruh Inhibitor terhadap Aktivitas Enzim. Online. https://www.scribd.com/doc/209491801/Laporan-Suksinat-Dehidrogenase diakses pada 5 april 2016) Tim Dosen Biokimia UM.2015. Petunjuk Praktikum Biokimia Umum. Malang: Universitas Negeri Malang. Vika. 2015. Pengaruh Inhibitor terhadap Aktivitas Enzim. Online. (https://www.scribd.com/doc/261089534/pengaruh-inhibitor-terhadap-aktivitasenzim, diakses pada 5 april 2016.
