PATOLOGI ANATOMI Definisi Pathological anatomy is the study of changes in structures caused by disease Fungsi Pencegahan Penyakit Diagnosis Penyakit / kelainan tubuh Pengelolaan Penderita Tindak lanjut Tahap Pemeriksaan Bahan Pemeriksaan Teknik Pemeriksaan
TEKNIK PEMERIKSAAN MAKROSKOPIK Spesimen Teknik Pengambilan Spesimen Teknik Distribusi Spesimen Teknik Pemeriksaan Spesimen Interpretasi Hasil
TEKNIK PEMERIKSAAN MIKROSKOPIK (HISTOPATOLOGI) Histologi adalah teknik pemeriksaan jaringan normal pada level mikroskopik. Histopatologi adalah pemeriksaan jaringan untuk mengetahui ada/tidaknya perubahan pada struktur jaringan tersebut akibat proses penyakit. Histology is the technique of examination of normal tissues at microscopic level. Histopathology is examination of tissues for presence or absence of changes in their structure due to disease processes. Spesimen Jaringan hasil biopsi, contoh: - Ekstirpasi polip - Punch biopsi dermis - Wide eksisi tumor kulit ganas - Eksisi nevus Teknik Pengambilan Spesimen - Biopsi insisi : sebagian kecil tumor - Biopsi eksisi: seluruh tumor - Biopsi cakot/punch biopsy - Biopsi truncut : dengan jarum besar - Biopsi kerokan - Biopsi endoskopi - Biopsi laparoskopi - Biopsi operasi - Kuretase - dll Teknik Distribusi Spesimen - jaringan diletakkan pada buffer formalin (10%) dengan volume 10x besarnya jaringan, agar fiksasinya cukup. Jaringan yang lebih besar dari 1-2cm memerlukan insisi agar bahan fiksatif dapat penetrasi: dapat dilakukan dengan pola insisi ‘bread loaf’ sehingga didapatkan banyak potongan pada satu permukaan, namun permukaan yang lain tetap pada bentuknya. - Batas jaringan tidak boleh dirancukan akibat fiksasi, karena pada banyak kasus, hal ini merupakan bagian penting dari laporan dan dapat mempengaruhi penilaian onkologis mengenai perlu/tidaknya terapi lanjutan. - Selalu upayakan mengirimkan spesimen utuh. Dengan spesimen besar, awalnya fiksasi jaringan selama 48 jam, kemudian rendam dalam spons yang dibasahi formalin sebelum dikirimkan ke laboratorium. Jika spesimen terlalu besar, kirimkan samples yang dapat merepresentasikan jaringan tersebut, namun sisa jaringan disimpan hingga didapatkan hasil yang memuaskan. - Komunikasi dengan patologis sangat penting. Preparat harus dilengkapi dengan riwayat medis pasien, terutama terapi atau operasi yang pernah dijalani, karena ini esensial dalam menentukan diagnosis bagi patologis. Teknik Pemeriksaan Spesimen Blok parafin (HistoPA rutin)
Frozen section Histokimia pemeriksaan untuk mengetahui jenis zat kimia yang terdapat dalam sel atau jaringan tubuh. Hal ini terutama diperlukan oleh spesialis PA untuk memastikan diagnosis dari pada jaringan yang diperiksa nya. Imunohistokimia ditujukan untuk melihat adanya antigen atau antibodi dalam sel maupun jaringan. Pemeriksaan imunopatologi pada Lab. PA, bisa dilakukan pada jaringan yang sudah selesai diproses (blok parafin) atau pada jaringan yang masih segar. Umumnya menggunakan metode ABC (Avidin Biotin Complex) Interpretasi Hasil
Teknik HistoPA Rutin (Blok Parafin) Langkah-langkah : Fiksasi jaringan Fiksasi jaringan adalah metode mengawetkan sel-sel dan jaringan-jaringan pada keadaan hidup selama mungkin. Jaringan apapun yang diambil dari tubuh manusia terdekomposisi dengan cepat karena hilangnya aliran darah dan oksigen, akumulasi produk metabolisme, reaksi enzim-enzim autolisis, dan pembusukan oleh bakteri. Proses dekomposisi ini dihambat dengan proses fiksasi jaringan. Selama proses fiksasi, jaringan-jaringan berada pada keadaan statis secara fisik dan kimiawi. Sebagian besar bahan fiksatif bekerja dengan denaturasi atau presipitasi protein-protein dalam sel, atau dengan membuat komponenkomponen terlarut menjadi komponen yang tidak dapat terlarut. Efek yang dihasilkan dari proses fiksasi adalah : - Mencegah pembusukan dan autolisis - Mengeraskan jaringan, sehingga membantu pada proses pemotongan (cutting) - Membuat sel-sel menjadi tidak sensitif terhadap larutan hipertonik atau hipotonik - Bekerja sebagai mordant - Menginduksi kontras optik untuk pemeriksaan morfologi yang lebih jelas. Bahan fiksatif yang sering digunakan antara lain : 1. Formalin Formalin merupakan bahan fiksatif yang paling sering digunakan pada praktek rutin. Formalin tersedia secara komersial dalam bentuk larutan dari gas formaldehyde tersaturasi dalam air, dengan perbandingan berat/volume 40%. Untuk semua tujuan klinis, larutan 40% formaldehyde ini dianggap sebagai larutan formalin 100%. Untuk keperluan fiksasi jaringan, digunakan larutan formalin 10%. Larutan tersebut didapatkan dengan melarutkan 10 ml larutan formalin 100% ke dalam 90 ml aquades. Membutuhkan waktu 6-8 jam untuk memfiksasi jaringan setipis 4 mm pada temperatur ruang. Jumlah bahan fiksatif yang dibutuhkan adalah 15-20 kali volume spesimen. Keuntungan digunakannya formalin : dapat mempenetrasi jaringan dengan cepat; tidak mengubah warna asli jaringan; murah dan mudah didapatkan; bahan fiksatif paling baik untuk jaringan otak. Kerugian digunakannya formalin : menyebabkan pengerasan jaringan yang berlebihan; menyebabkan iritasi kulit, membran mukosa dan konjungtiva; menyebabkan pembentukan pigmen formalin pada jaringan yang mengandung banyak darah pada pH asam. 2. Glutaraldehyde Glutaraldehyde digunakan sebagai bahan fiksatif untuk pemeriksaan mikroskop elektron. Glutaraldehyde digunakan dalam bentuk larutan 4% pada suhu 4oC selama 4 jam untuk memfiksasi jaringan. Kerugian digunakannya glutaraldehyde : mahal; mempenetrasi jaringan lambat. 3. Picric acid (e.g. Bouin’s fluid) Cairan Bouin digunakan sebagai bahan fiksatif untuk needle biopsi renal dan testikular. Cairan Bouin mewarnai jaringan menjadi kuning. Cairan Bouin juga merupakan bahan fiksatif yang baik untuk pemeriksaan glikogen jaringan. Kerugian digunakannya cairan Bouin adalah : membuat jaringan keras dan rapuh; menyebabkan lisis eritrosit. 4. Alcohol (e.g. Carnoy’s fixative)
Alkohol secara umum digunakan sebagai bahan fiksatif untuk smear sitologi dan kuret endometrial. Bahan ini bekerja dengan mendenaturasi protein-protein sel. Baik metil dan etil alkohol dapat digunakan. Metil alkohol digunakan dalam bentuk larutan 100% selama 20-30 menit. Etil alkohol digunakan dalam bentuk larutan 95% (Carnoy’s fixative : 300 ml etil alkohol murni + 150 ml chloroform + 50 ml glacial acetic acid). Fiksatif Carnoy baik untuk memfiksasi glikogen dan disolusi lemak. 5. Osmium tetraoxide Osmium tetraoksida digunakan sebagai bahan fiksatif untuk jaringan saraf dan untuk pemeriksaan mikroskop elektron. Bahan ini merupakan fiksatif terbaik untuk jaringan lemak. Bahan ini digunakan dalam bentuk larutan 2%. Larutan ini menyebabkan warna kehitaman pada jaringan. Dehidration Dehidrasi merupakan proses dimana air dari sel dan jaringan dihilangkan, kemudian ruangan tersebut digantikan dengan lilin (wax). Dehidrasi dilakukan dengan melewatkan spesiman melalui alkohol yang bergradasi : 70%, 80%, 95%, alkohol absolut. Clearing Clearing merupakan proses dimana alkohol dari jaringan dan sel dihilangkan dan digantikan dengan cairan yang dapat terlarut dengan lilin dan membuat jaringan tidak berwarna (transparan). Xylene merupakan bahan clearing yang paling sering digunakan. Bahan lain yang dapat digunakan antara lain toluene, benzene (karsinogenik), chloroform (beracun), dan minya kayu cedar (mahal dan sangat kental). Impregnation Impregnation merupakan proses dimana ruangan kosong pada sel dan jaringan setelah pengeluaran air, digantikan dengan paraffin wax. Lilin ini mengeraskan jaringan, yang membantu pada proses pemotongan (cutting). Impregnation dilakukan dalam paraffin wax yang memiliki titik leleh 56oC (54-62oC). Tissue processors Alat prosesor jaringan otomatis saat ini dapat melakukan mulai dari proses fiksasi, dehidrasi, clearing dan impregnation. Alat ini dapat berupa sistem hidraulic (open) atau vacuum (closed). Prosesor vacuum memiliki keuntungan tidak terdapat bahaya kontaminasi aroma toksik terhadap laboratorium seperti pada sistem hidraulic. Sistem vacuum juga dapat menghemat waktu pemrosesan jaringan. Embedding and Blocking Penempelan (embedding) jaringan dilakukan dalam lilin molten wax. Lilin blok secara konvensional dibuat dengan metallic L (Leuckhart’s mould); sekarang cetakan plastik dengan warna-warna berbeda digunakan untuk membuat lilin blok (fig. 2.3). Cetakan diletakkan diatas ubin rata. Molten wax kemudian dituangkan ke dalam celah di dalam cetakan. Jaringan/spesimen yang telah diproses diletakkan di dalam lilin dengan menyertakan nomor identitas, pemeriksaan dilakukan pada permukaan yang menghadap ke bawah. Lilin tersebut kemudian dibiarkan mengeras. Penempelan dan pencetakan (embedding and blocking) juga
dapat dilakukan di dalam alat khusus yaitu embedding centre. Alat ini memiliki reservoir lilin wax, area pemanasan untuk cetakan baja, dispenser wax, dan lembaran panas dan dingin yang terpisah (fig. 2.4). Section cutting (microtomy) Mikrotom merupakan alat yang digunakan untuk memotong sediaan. Terdapat 5 jenis mikrotom, yaitu : (1) Rotary; merupakan mikrotom yang paling sering digunakan. Di dalamnya, pisau mikrotom tetap pada tempatnya saat blok jaringan digerakkan (fig. 2.5). (2) Sliding; digunakan pada sediaan beku. Di dalamnya, blok jaringan tetap pada tempatnya saat pisau digerakkan. (3) Freezing. (4) Rocking; merupakan mikrotom sederhana, pisau tetap pada tempatnya saat blok jaringan digerakkan. (5) Base-sledge; digunakan untuk jaringan yang sangat keras atau blok yang besar, misalnya pada sediaan otak dan jantung. Prosedur mikrotomi diawali dengan meletakkan blok paraffin di dalam mikrotom rotary. Sediaan dipotong secara manual dengan ketebalan 5-6µm. Potongan-potongan tersebut diambil dari pisau menggunakan forcep atau sikat bulu unta, kemudian diapungkan di dalam air (waterbath) dengan temperatur yang dijaga pada suhu 40-45oC (sedikit dibawah titik leleh lilin wax). Hal ini dapat membantu menghilangkan lipatan-lipatan pada potongan. Potongan-potongan tersebut kemudian diambil dan diletakkan diatas slide kaca, kemudian diletakkan pada oven dengan temperatur 56oC selama 20-30 menit untuk pengeringan dan adhesi yang baik. Potongan-potongan tersebut kemudian dilapisi dengan pengawet (misalnya albumin telur, gelatin, poly-L-lysine, dll). Potongan-potongan tersebut siap untuk diwarnai. Pewarnaan Rutin (H & E) Pewarnaan rutin dilakukan dengan haematoxyllin dan eosin (H&E). Hasil akhirnya akan didapatkan nukleus yang berwarna biru; sitoplasma, otot, kolagen yang berwarna pink; eritrosit, keratin, dan koloid protein yang berwarna pink. Prosedur pengecatan : 1. Slide diletakkan di dalam pewarna haematoxyllin selama 8-10 menit. 2. Cuci dalam air 3. Diferensiasi (membuang kelebihan pewarna secara slektif) dilakukan dengan meletakkan slide di dalam larutan alkohol asam 1% selama 10 detik. 4. Cuci dalam air. 5. Blueing (memberi warna biru pada slide) dilakukan dengan meletakkan slide pada Cairan Scott’s yang mengalir (mengandung sodium bikarbonat dan magnesium sulfat) atau larutan lithium karbonat selama 2-10 menit. 6. Counterstain dengan larutan eosin 1% selama 1-3 menit. 7. Cuci dalam air mengalir. 8. Slide di dehidrasi dengan melewatkannya pada serangkaian gradasi alkohol hingga terakhir pada xylene, 2-3 celupan pada tiap larutan. 9. Slide diletakkan pada DPX (dextrene polystyrene xylene) atau Canada balsam.
Teknik Frozen Section Pembuatan sediaan menggunakan teknik Frozen section (potong beku) merupakan prosedur diagnostik yang cepat untuk jaringan, sebelum dilakukan tindakan bedah radikal. Metode ini juga digunakan untuk menunjukkan substansi-substansi tertentu di dalam sel dan jaringan, m isalnya lemak dan enzim. Prosedur ini dapat dilakukan pada ruang operasi, di dekat meja operasi. Keuntungan dari prosedur ini antara lain : cepat (waktu yang dibutuhkan dari pemberian spesimen hingga terwarnai, sekitar 10 menit); dapat dilakukan pewarnaan apa saja; pengecilan jaringan yang minimal dibandingkan dengan sediaan blok parafin; dapat menunjukkan lemak dan enzim. Kerugian dari prosedur ini antara lain: sulit untuk memotong sediaan secara serial; tidak dapat mempertahankan jaringan untuk pemeriksaan jangka lama; potongan lebih tebal; detil struktural lebih terdistorsi (akibat kurangnya medium pelekatan/embedding). Untuk metode potong beku, hasil yang baik didapatkan dari proses pembekuan secara cepat pada jaringan segar yang belum terfiksasi. Dua metode yang digunakan untuk mendapatkan sediaan potong beku : 1. Freezing microtome menggunakan gas CO2 Keuntungan: murah; membutuhkan tempat yang kecil; peralatan portabel. Kerugian: potongan tebal; gas CO2 dapat keluar selama prosedur; saluran penghubung dapat tersumbat CO2 yang mengeras. 2. Refrigerated microtome (cryostat) Pada cyrostat, mikrotom diletakkan pada kabinet yang terkontrol suhunya (-30oC). Keuntungan: potongan lebih tipis; kontrol suhu yang lebih baik; peralatan portabel. Kerugian: mahal. Pengecatan pada metode potong beku dapat dilakukan dengan beberapa jenis pewarna: 1. Rapid H & E Cuci sediaan dengan air mengalir. Diferensiasi dengan alkohol asam 1% (dicelupkan satu kali dengan cepat) Cuci dalam air. Quick blueing dengan melewatkan sediaan pada uap ammonia, atau dengan dicelupkan pada larutan blueing. Cuci dalam air mengalir. Counterstain dengan larutan eosin 1% selama 3-6 detik. Cuci dalam air mengalir. Dehidrasi dengan melewatkan sediaan pada alkohol 95% dan alkohol absolut, satu celupan pada setiap larutan. Clearing dengan melewatkan sediaan pada xylene. Mount dengan DPX. Pemeriksaan di bawah mikroskop. 2. Toluidine blue Letakkan sediaan dalam toluidine blue 0.5% selama ½ - 1 menit Cuci dalam air
Disusun dalam gliserin, kemudian diberi cover slip Diperiksa di bawah mikroskop
3. Special stains Pewarnaan khusus digunakan untuk spesimen tertentu. Pewarnaan bergantung pada keadaan fisik, kimiawi, atau perbedaan kelarutan antara pewarna dengan jaringan atau sel yang diperiksa. Beberapa pewarna khusus yang sering digunakan di laboratorium antara lain: Sudan black/oil red digunakan untuk mewarnai lemak. van Gieson digunakan untuk mewarnai serat kolagen. Masson’s trichrome digunakan untuk mewarnai jaringan otot. Reticulin digunakan untuk mewarnai serat retikulin. Congo Red digunakan untuk mewarnai amyloid, protein fibrin di substansi ekstraselular. Periodic acid-Schiff (PAS) digunakan untuk mewarnai glikogen dan mukopolisakarida. Methyl violet merupakan pewarna metakromatin, digunakan untuk mewarnai amyloid dalam jaringan. Perl’s reaction digunakan untuk mewarnai besi.
TEKNIK PEMERIKSAAN SITOPATOLOGI Sitologi merupakan teknik pemeriksaan sel-sel tubuh, baik yang diambil dari jaringan epitel permukaan yang terlepas atau sel-sel dari jaringan lain yang diambil dengan teknik yang berbeda. Sitologi merupakan teknik pemeriksaan yang mudah dan murah untuk skrining pembengkakan dan benjolan (lumps and bumps). Pemeriksaan ini diindikasikan untuk sebagian besar massa eksternal yang palpabel, dan beberapa massa internal atau perubahan organ general dengan bantuan USG. Sitologi juga dapat memeriksa cairan dari rongga tubuh, pembilasan (misalnya bronkoalveolar lavage), dan analisa cairan serebrospinal. Spesimen Exfoliative cytology (saluran kandungan wanita, saluran respiratori, saluran cerna,saluran urin, cairan pleura, cairan peritoneal, cairan pericardial, cairan serebrospinal, cairan semen) Aspiration cytology (massa palpabel/non-palpabel : limfonodi, payudara, tiroid, kelenjar saliva, massa jaringan lunak, tulang, dll) Imprint cytology (jaringan segar dieksisi saat operasi, yang belum di fiksasi, komplementer terhadap frozen section) Teknik Pengambilan Spesimen FNAB Pap Smear Bronkoalveolar lavage Gastric lavage/brushing Paracentesis Teknik Distribusi Spesimen - Fiksasi dengan alkohol 96% - Cytopreparation Cytopreparation is the science of controlling cytomorphology for diagnostic applications. It encompasses all those materials and methods that interact with cells from specimen collection through microscopy, and that substantially influence every cytologic preparation’s final number, mix, and distribution of cells, and their final size, shape, thickness, chemical composition, chromatin distribution pattern, color, transparency, and visibility. Teknik Pemeriksaan Spesimen Persiapan spesimen Pengambilan spesimen dan persiapan slide merupakan langkah penting, sebab sel-sel dapat rusak dan terdistorsi saat membuat preparat sehingga interpretasinya menjadi sulit atau hampir tidak mungkin.
Staining the slide Dried Examining the specimen Interpretasi Hasil
Exfoliative cytology Sitologi eksfoliatif merupakan pemeriksaan sel-sel yang diambil dari permukaan jaringan epitel pada rongga tubuh atau cairan tubuh. Spesimen ini dapat diambil dengan cara scrapping, brushing, atau washing. Prinsip dari teknik ini adalah, bahwa kecepatan pengelupasan sel-sel meningkat sejalan dengan meningkatnya penyakit. Spesimen yang digunakan adalah : 1. Female genital tract pap smear 2. Respiratory tract expectorant (sputum), brushing (BB), washing (BW) and bronchioalveolar lavage (BAL) 3. Gastrointestinal tract scraping the surface with a metallic or wooden spatula (rongga mulut), brushing or lavage during fibreoptic endoscopy 4. Urinary tract urinary sediment examined from voided urine/catheterised urine or washings of the urinary bladder obtained at cystoscopy 5. Body fluids (pleural, peritoneal, pericardial, CSF and semen) paracentesis 6. Buccal smears for sex chromatin rongga mulut Persiapan sediaan : 1. Fiksasi Fixative used is either equal parts of ether and 95% ethanol, or 95% ethanol alone, 100% methanol, or 85% isopropyl alcohol. Fixation time of 10-15 minutes at room temperature is adequate. Smears may be left in fixative for 24 hours or more. Smears should be transported to the laboratory in fixative solution in coplin jars. 2. Pewarnaan Papanicolaou Stain This is the best stain for routine cytodiagnostic studies. In this, haematoxylin gives nuclear stain while OG-6 and EA-50 are two cytoplasmic counterstains. H & E Stain This is the same as that used for histological sections. In this, haematoxylin is nuclear stain and eosin is cytoplasmic counterstain. Romanowsky Stain Leishman’s stain, Giemsa and May-Grunwald-Giemsa (MGG) are usually used; the last one is most commonly used. 3.
Aspiration Cytology Pada pemeriksaan sitologi aspirasi, spesimen diambil dari jaringan sakit dengan metode fine needle aspiration (FNA) atau biopsi aspirasi (ABC). FNA or ABC digunakan untuk mendiagnosis massa palpabel maupun non-palpabel. Massa palpabel, yaitu : limfonodi, payudara, tiroid, kelenjar saliva, massa jaringan lunak, tulang. Massa non-palpabel didapat dari rongga abdomen, thorax, atau retroperitoneum. Prosedur FNA diawali dengan mengambil spesimen dari pasien dengan aspirasi cairan dari massa pada pasien dengan Pemegang Franzen, syringe, dan needle. Cairan aspirasi diletakkan pada kaca slide, jika spesimen semi-solid terlebih dulu ditekan pada kaca slide kemudian dipulas. Metode fiksasi dan pewarnaan sama seperti sitologi eksfoliatif.
Pap Smear
TEKNIK PEMERIKSAAN MIKROSKOP ELEKTRON Spesimen Teknik Pengambilan Spesimen Teknik Distribusi Spesimen Teknik Pemeriksaan Spesimen Interpretasi Hasil
TEKNIK PEMERIKSAAN PATOLOGI FORENSIK Otopsi klinik adalah pemeriksaan yang dilakukan terhadap jenazah yang meninggal karena sakit, untuk mengetahui secara lebih pasti antara lain tentang penyebab kematian, penyakit yang diderita sebelumnya dan mekanisme terjadinya kematian. Spesimen Teknik Pengambilan Spesimen Teknik Distribusi Spesimen Teknik Pemeriksaan Spesimen Interpretasi Hasil
