4QM1 SECCION 1
*LOPEZ RAMIREZ STEPHANY
*MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLOGICAS DEPARTAMENTO DE BIOQUIMICA DR. GUILLERMO CARVAJAL SANDOVAL PRACTICA 7: OBTENCIÓN DE GLUCÓGENO A PARTIR DE HÍGADO DE RATA Y SU CARACTERIZACIÓN QUÍMICA
1.-
Sacrificar *OBJETIVOS una rata rata una Se realizará el aislamiento y purificación del glucógeno a con eter partir del hígado de un organismo vivo y se(procurand identificará la (procurand composición de los productos por medio de hidrólisis o no o no ácida y enzimática por medio de reacciones excitarla) químicas características.
2.- Extraer rapidamente *INTRODUCCION el higado higado y y el El glucógeno es la forma de almacenamiento lavarlo al de la glucosa en los tejidos animales. Se chorro de agua encuentra principalmente en el hígadoagua y en el músculo representando hasta un 10% un 1- y 3.- ypesar pesar 3.y 2% de su peso húmedo, respectivamente. cortar rapidamente el Está formado por unidades de glucosa unidas higado en por enlaces α(1-4) y ramificaciones α(1-6). pedazos pequeños 4.- colocar los pedazon es un mortero mortero previamete sumergido en hielo. 5.- Añadir acido tricloroacetico (TCA) 10% en (TCA) al al 10% en proporcion de 1ml/g 1ml/g de de tejido tejido hepatico, hepatico, triturar triturar El glucógeno actúa como reguladoreldehigado la hasta formar una formar una glucosa sanguínea, almacenándola como pasta pasta glucógeno durante una buena alimentación homogenea. 6.(glucogenogénesis) y liberándola por centrifugar el centrifugar el fosforolisis (glucogenolisis) durante el ayuno, homogenizad ya que en esta situación no hay absorción o o durante durante 5 5 a 2000 intestinal. La duración del glucógeno min hepático en ayunas es de aproximadamente 24 h. rpm. A 7.-Decantar el partir de este momento, la concentración en 7.-Decantar el .un vaso de sangre se mantiene por síntesis de glucosa a 250 ml y partir de sustancias distintas a los mantenerlo mantenerlo carbohidratos en hielo.
13.- Desechar
el sobrenadante y resuspender el precipitado con 5 ml de agua destilada
12.-
Centrifugar a 2000 rpm durante 5 min. 11.- Añadir 2 volumenes de volumenes de etanol por volumen de sobrenadante. sobrenadante. agitar esta mezcla y dejar en reposo reposo hasta hasta que que el glucogeno flocule 10.- Decatar el liquido sobrenadante y reunirlo con el obteido en el paso 7.
14.14.- Volver Volver a a precipitar con 2 volumenes volumenes de etanol. 15.15.centrifugar centrifugar a a 2000 rpm durante 3 min. min. 16.16.- Decantar Decantar y suspender con la menor cantidad posible de alcohol alcohol absoluto y pasarlo a un vidrio reloj vidrio reloj para que seque y cristalice cristalice
9.- dejar reposar por 5 min y centrifugar a 2000 rpm. 8.- Lavar el mortero y pisilo con 10 ml de TCA al 5% y en este liquido este liquido reuspender en el precipitado de de centrifugacion aterior aterior
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*Explicación de cada paso: 13.- El sobrenadante se desecha pues no contiene ningún compuesto de interés.
1.- La rata no debe excitarse puesto que si esto sucede esta empezara a segregar glucógeno lo que ocasionara que obtengamos menos de lo estimado.
14 y 15.- se repite el procedimiento para que el precipitado sea el mayor posible y obtengamos mayor cantidad de glucógeno.
2.- El Hígado debe extraerse de manera rápida puesto que entre más nos tardemos se producirán enzimas que degraden el glucógeno esta se tiene que lavar para quitar la sangre pues esta es una impureza para nuestra extracción de glucógeno.
16.- Se decanta el precipitado en una charolita y se le agrega etanol para deshidratarlo y este cristalice. *Caracterización química del glucógeno.
3.- Se debe pesar el hígado pues necesitamos este dato para el cálculo de rendimiento, TUBO 1 se cortara en pedazos Glucógeno (ml) 2 pequeños para que sea más HCl 1N (ml) 2 sencillo triturarlo. HCl 2N (ml) HCl 4N (ml) 4 y 5.- El tratamiento posterior Amilasa con. con ácido tricloroacético (TCA) (ml) hace que precipiten las Amilasa 1:2 (ml) proteínas y ácidos nucleicos de la mezcla. NaCl al 5% Agua dest. Incubar 30min
6.-Se centrifuga para que todos los componentes que no necesitas queden en el precipitado que se formara como proteínas, mezcla de células y la arena que se utilizó para triturar. 7.- Se decanta el sobrenadante para que en el obtengamos el glucógeno, y de igual manera se encontraran en esta agua y TCA. 8.- Se lava el mortero y el pistilo con el TCA para que recolectemos la pasta homogénea que quedo en ellos. 9.- se centrifuga de nuevo por la misma razón del paso 6. 10.- se decanta el sobrenadante para juntarlo con el sobrenadante inicial para poder obtener la mayor cantidad de glucógeno posible. 11.-Se le agrega etanol para que se separe el glucógeno del sobrenadante y se precipite.
2 2
3 2
4 2
5 2
6 2
a) Preparar 15mL de una solución de glucógeno de 5mg/ml. b) Preparar una serie de tubos según la tabla.
2 2 2 2 1got a
1gota
2 92°C
37°C
*RESULTADOS Rendimiento, Porcentaje de glucógeno presente en la rata.
Charola= 1.3851g Charola con Glucógeno= 1.9114g Glucógeno= (1.9114g-1.3851g)= 0.5263g peso seco Peso de Hígado= 14g Peso de hígado 14g 0.5263g
100% X
% de glucógeno
100% X
X=
3.75% de glucógeno presente en el hígado de nuestra rata
Caracterización química.
12.- Se centrifuga para que el glucogeno quede precipitado.
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*MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA Prueba Ninhidrin a
Biuret
Molish
Acida Hidrolisis
1 N
2 N
4 N
Fehling Lugol Seliwanof f
+ -
+ -
+ -
Testigo Glucógeno sin hidrolizar +
+
+
+
-
Enzimática
Observaciones Negativo Nos indica que nuestro problema no hay aminoácidos, ya que es una reacción característica para grupos amino libres. Negativo En nuestro problema no hay presencia de proteínas debido a q la reacción es para identificar proteínas y péptidos de cadena menor a 3 unidades de a.a. Positivo Se identifico que nuestro problema es un carbohidrato. La reacción de Molish es general para carbohidratos.
Imagen
Blanco
Conc.
1:2
Agua
+ -
+ -
-
+
+
-
*ANALISIS DE RESULTADOS Prueba de Fehling En la hidrólisis ácida como en la hidrólisis enzimática se obtuvieron resultados positivos en los tubos hidrolizados, esta prueba se realiza para identificar los carbonilos potencialmente libres que estén involucrados en enlaces glucosidicos (azucares reductores) gracias a esto podemos decir que en nuestra muestra probablemente hay presencia de glucosa, maltosa o fructosa. En el tubo testigo del glucógeno sin hidrolizar dio negativo, debido a que sus grupos están bloqueados debido a los enlaces alfa-1,4 y alfa-1,6; no posee iones libres par que se lleve a cabo la reacción.
Prueba de Seliwanoff Los resultados fueron positivos para 5 tubos, el tubo testigo del glucógeno dio negativo debido a que no se hidrolizo. En esta prueba podemos diferenciar aldosas de cetosas, las cetosas dan rápido y las aldosas lento, por lo tanto podemos decir que el azúcar presente es una aldosa (glucosa). Prueba del lugol
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*LOPEZ RAMIREZ STEPHANY *MENDOZA GARCES DANIA FERNANDA Cascada del glucógeno
Dio positivo en el tubo testigo del glucógeno, debido a que al no ser hidrolizado el glucógeno es capaz de atrapar al lugol por ser un polisacárido lineal, formando caltratos. *CONCLUSIONES
-Los seres vivos almacenan glúcidos en forma de polisacáridos, que sirven como materiales de reserva como es el caso del glucógeno en los animales. -El glucógeno contiene unidades de glucosa unidas por enlaces glicosídicos alfa-1,4 y alfa-1,6. -Se caracterizó al problema por reacciones químicas, dando como resultado la identificación del glucógeno. *PREGUNTA EXTRA
*BIBLIOGRAFIA *Lehninger, Albert, Nelson, David L. (1993). Principios de Bioquímica´. Segunda Edición, Ediciones Omega, Barcelona, España.
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