Modulo proceso de biorremediacion.pdf

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA – UNAD Escuela de Ciencias Agrícolas, Pecuarias y del Medio Ambiente Procesos de Bioremediación

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA - UNAD ESCUELA DE CIENCIAS AGRÍCOLAS, PECUARIAS Y DEL MEDIO AMBIENTE

358025 – PROCESOS DE BIOREMEDIACIÓN

(Sinke & van Moll, 2011)

Autor: Bio. PhD. RAÚL HERNANDO POSADA

BOGOTÁ 2012

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ÍNDICE DE CONTENIDO

ÍNDICE DE CONTENIDO ........................................................................................................... 2 ÍNDICE DE CUADROS ............................................................................................................... 5 ÍNDICE DE FIGURAS................................................................................................................. 6 ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO ............................................. 8 INTRODUCCIÓN GENERAL ...................................................................................................... 9 UNIDAD 1. CARACTERIZACIÓN DE CUERPOS Y CONTAMINANTES....................................... 12 CAPÍTULO 1. GENERALIDADES. ........................................................................................ 12 Lección 1. Introducción. ............................................................................................... 12 Lección 2. Conceptos básicos de bioremediación. ....................................................... 15 Lección 3. Características de los suelos: físicas, químicas y biológicas. ....................... 18 Lección 4. Características del agua: pH, aspectos físicos, químicos y aspectos microbiológicos............................................................................................................. 23 Lección 5. Ventajas y desventajas de la bioremediación. ............................................ 26 CAPÍTULO 2. CONTAMINANTES.................................................................................... 29 Lección 6. Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de Hidrocarburos (alifáticos aromáticos=BTEX, PAHs). ............................................................................. 30 Lección 7. Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de Hidrocarburos clorados (PCBs, TCE, PCE, insecticidas, herbicidas). ..................................................... 34 Lección 8. Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de Compuestos nitroaromáticos (TNT y otros). ..................................................................................... 37 Lección 9. Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de metales pesados. 40 Lección 10. Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de compuestos organofosforados, cianuros, fenoles. ........................................................................... 43 CAPÍTULO 3. PROCESOS QUE INTERVIENEN EN LA BIOREMEDIACIÓN. ........................... 46 Lección 11. Interacciones microbianas......................................................................... 46 Lección 12. Adaptacion, aclimatación y bioacumulación. ............................................ 49 Lección 13. Biodisponibilidad y detoxificación. ............................................................ 52 Lección 14. Biodegradabilidad...................................................................................... 55 Lección 15. Sorción y biosorción. ................................................................................. 58 UNIDAD 2. ESPECIES EMPLEADAS PARA LA BIOREMEDIACIÓN. .......................................... 62 CAPÍTULO 4. BACTERIAS Y ALGAS. .................................................................................... 63 Lección 16. Introducción. ............................................................................................. 63 Lección 17. Metabolismo aerobio. ............................................................................... 66 2


Lección 18. Metabolismo anaerobio. ........................................................................... 70 Lección 19. Metabolismo de metales. .......................................................................... 74 Lección 20. Aplicaciones. .............................................................................................. 77 CAPÍTULO 5. HONGOS Y LEVADURAS (MICORREMEDIACIÓN)......................................... 80 Lección 21. Introducción. ............................................................................................. 80 Lección 22. Metabolismo.............................................................................................. 83 Lección 23. Micorremediación con micorrizas. ............................................................ 86 Lección 24: Degradación de plaguicidas, insecticidas y organoclorados. .................... 89 Lección 25. Aplicaciones. .............................................................................................. 92 CAPÍTULO 6. PLANTAS (FITOREMEDIACIÓN). ................................................................... 96 Lección 26. Introducción. ............................................................................................. 96 Lección 27. Metabolismo.............................................................................................. 99 Lección 28. Clases. ...................................................................................................... 103 Lección 29. Procesos involucrados en la fitoremediacion. ........................................ 108 Lección 30. Aplicaciones. ............................................................................................ 112 UNIDAD 3. TÉCNICAS DE BIOREMEDIACIÓN. ..................................................................... 117 CAPITULO 7: ATENUACIÓN NATURAL. ........................................................................... 118 Lección 31. Introducción. ........................................................................................... 118 Lección 32. Parámetros de diseño.............................................................................. 121 Lección 33. Funcionamiento....................................................................................... 124 Lección 34. Posibles costos......................................................................................... 128 Lección 35. Parámetros de monitoreo y seguimiento. .............................................. 130 CAPÍTULO 8. BIOESTIMULACIÓN. ................................................................................... 134 Lección 36. Introducción ............................................................................................ 134 Lección 37. Parámetros de diseño.............................................................................. 136 Lección 38. Funcionamiento ....................................................................................... 139 Lección 39. Posibles costos......................................................................................... 142 Lección 40. Parámetros de monitoreo y seguimiento. .............................................. 143 CAPÍTULO 9. BIOAUMENTACIÓN. ................................................................................... 146 Lección 41. Introducción. ........................................................................................... 146 Lección 42. Parámetros de diseño.............................................................................. 149 Lección 43. Funcionamiento....................................................................................... 152 Lección 44. Posibles costos......................................................................................... 154 3


Lección 45. Parámetros de monitoreo y seguimiento. .............................................. 157 BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 161

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ÍNDICE DE CUADROS Cuadro 1: Principales características del agua. 24 Cuadro 2: Límites permisibles para metales pesados, cianuros y contaminantes en agua de acuerdo a la Universidad Autónoma de México (UAM, 2000). 25 Cuadro 3: Ventajas y desventajas de la bioremediación. 26 Cuadro 4: Ventajas y desventajas de la fitoremediación con respecto a otros métodos de remediación. 27 Cuadro 5: Comparativo de las técnicas ex-situ de bioremediación (Villaseñor Roa, 2011). 28 Cuadro 6: Límites máximos permisibles para hidrocarburos específicos en suelos según la norma oficial mexicana NOM -138-SEMARNAT/SS-2003 (SEMARNAT, 2005). 31 Cuadro 7: Límites permisibles de Cadmio, Niquel y Plomo en suelos de Ecuador. 41 Cuadro 8: Resumen de los umbrales de contaminación para elementos traza en la comunidad andaluza. 41 Cuadro 9: Estándares de referencia para medir la biodegradabilidad en USA y Europa. 57 Cuadro 10: Géneros fúngicos que contienen especies que degradan hidrocarburos poliaromaticos (PAHs)(Al-Turki, 2009). 81 Cuadro 11: Degradación de benzo(a)pyrenos por aislamientos fúngicos (Juhasz & Naidu, 2000). 90 Cuadro 12: Ventajas y desventajas de la fitoremediación (Delgadillo-López et al., 2011). 98 Cuadro 13: Ejemplos de plantas que fitodegradan contaminantes orgánicos (DelgadilloLópez et al., 2011). 99 Cuadro 14: Mecanismos de fitoremediación (Delgadillo-López et al., 2011). 108 Cuadro 15: Tecnologías de fitoremediación aplicables a diferentes tipos de contaminantes1,2 (EPA, 2000). 110 Cuadro 16: Parámetros de monitoreo una vez implementada la fitoremediación, adaptado de EPA (2000). 111 Cuadro 17: Ejemplo de métodos de remediación. Comparación de costos, tomado de Delgadillo-López et al. (2011). 113 Cuadro 18: Costo estimado de la fitoremediación en el sitio Carswell. 114 Cuadro 19: Costos comparativos de diferentes tecnologías de remediación por unidad de suelo, adaptado de Adriano (2001). 128 Cuadro 20: Estructura química y biodegradabilidad (EPA, 1994b). 151

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ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1: Algunos tipos de estructura de suelo. 19 Figura 2: Movilidad de iones de acuerdo al pH del suelo. 20 Figura 3: Molécula de agua. 23 Figura 4: Estructuras, fórmulas químicas y pesos moleculares de 16 poluyentes PAHs de acuerdo a la EPA (NRC, 1997). 31 Figura 5: Benceno, Tolueno, Etilbenceno y Xileno. 32 Figura 6: Estructura de los PCBs. Dos anillos fenilos rodeados por cloro. 34 Figura 7: Estructura química del DDT y DDE. 36 Figura 8: Algunos compuestos nitroaromáticos naturales y sintéticos (xenobióticos) constituidos por un anillo bencénico como principal componente estructural. 38 Figura 9: Estructura química del Malation (Ortiz-Hernández & Sánchez-Salinas, 2010). 43 Figura 10: Grupo fenol y algunos derivados (Garric, 1979). 45 Figura 11: Adaptación y evolución en el humano. 49 Figura 12: Niveles crecientes de acumulación de xenobióticos como DDT en tejidos animales. 51 Figura 13: Interacción de los metales pesados con las células de plantas (Navarro-Aviño et al., 2007). 54 Figura 14: Esquema de las reacciones de acuerdo a Torres Delgado & Zuluaga Montoya (2009). 66 Figura 15: Ruta de degradación (via catecol) de compuestos aromáticos (Eweis et al., 1998) utilizada por bacterias como Pseudomonas putida. 67 Figura 16: Transformación bioquímica de los compuestos nitroaromáticos (Gomez Cruz, 2009). 68 Figura 17: Rutas aeróbicas oxidativas de degradación del anillo aromático de los compuestos nitroaromáticos. 68 Figura 18: Dehalogenación reductiva de tetracloruro de carbono y tetracloroetileno. 70 Figura 19: Reacciones iniciales durante la degradación anaeróbica de hidrocarburos saturados y aromáticos. 71 Figura 20: Reducción de los compuestos nitroaromáticos. 72 Figura 21: Reducción del nitrobenceno catalizada por la nitrobenceno reductasa (Tipo I) de Pseudomoas pseudoalcaligenes. 73 Figura 22: Interacción entre metales y microorganismos explicando la precipitación, acumulación, producción o liberación de sustancias y participación en el ciclo de carbono. Adaptado de Ledin (2000). 75 Figura 23: Metabolitos intermediarios formados durante la degradación aerobia de TNT por Phanerochaete chrysosporium (Spain, 1995). 83 Figura 24: Transformaciones fungicas del benzo(a)pyreno. 84 Figura 25: Mecanismo enzimático propuesto para Trichoderma spp. durante la degradación de cianuro (Argumedo-Delira et al., 2009; Ezzi & Lynch, 2005). 84 6


Figura 26: Degradación de Fenantreno y Pireno por Cyclothirium sp. (da Silva, Esposito, Moody, Canhos, & Cerniglia, 2004) 85 Figura 27: Mecanismos de tolerancia al estrés pormetales pesados desarrollado por la simbiosis MA. 86 Figura 28: Esquema de la fitoacumulación (EPA, 2000). 103 Figura 29: Esquema del proceso de rhizofiltración (EPA, 2000), 104 Figura 30: Esquema del proceso de fitoextracción y fitoacumulación (EPA, 2000). 104 Figura 31: Esquema del proceso de fitovolatilización (EPA, 2000). 105 Figura 32: Esquema del proceso de fitodegradación (EPA, 2000). 106 Figura 33: Esquema del proceso de rhizodegradación (EPA, 2000). 107 Figura 34: Diseño experimental en Carswell (Forth Texas), tomado de EPA (2000) 114 Figura 35: Procesos presentes en la atenuación natural (Field, 2005) 123 Figura 36: Rutas comunes de biodegradación (ITRCWG & RTDF, 1999). 126 Figura 37: Técnica de Landfarming, modificado de (EPA, 1994a). 126 Figura 38: Diagrama de flujo para evaluar la implementación de la atenuación natural, adaptado de ITRCWG & RTDF, (1999). 132 Figura 39. Proceso de bioremediación in-situ de agua y suelo. 137 Figura 40. Localización geográfica del vertimiento EXXON VALDEZ en Alaska y foto del proceso de bioremediación. 140 Figura 41: Representación gráfica de un sistema de biopilas alargadas (Velasco & Volke Sepúlveda, 2003) 146 Figura 42: Unidades de tratamiento (Ercoli, 2008). 148

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ASPECTOS DE PROPIEDAD INTELECTUAL Y VERSIONAMIENTO El contenido didáctico del curso académico Procesos de Bioremediación fue diseñado por Raúl Hernando Posada A. quien es Biólogo, con un magister en microbiología y doctorado en Ecología. Se ha desempeñado como investigador y coordinador en la empresa pública y privada, también como docente universitario y consultor, al momento de la elaboración de este material, es docente de la Universidad Autónoma y la Corporación Universitaria Minuto de Dios. Para citar este material por favor hacerlo de la siguiente manera: Posada, R.H (2012). Procesos de Bioremediación. Módulo didáctico. Bogotá: Universidad Nacional Abierta y a Distancia – UNAD.

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INTRODUCCIÓN GENERAL El desarrollo humano en las últimas décadas ha estado muy relacionado con la extracción de los recursos naturales, en el proceso se han creado sustancias químicas no existentes y/o de difícil descomposición. Entre estas sustancias se encuentran muchos productos para la agricultura contra enfermedades y plagas, ampliamente utilizados por muchos años en grandes extensiones de terreno en países desde tercermundistas hasta del primer mundo, lamentablemente solo hasta hace pocos años se ha encontrado sus efectos perjudiciales contra los humanos y el ambiente; esto sumado a su acumulación en suelo y aguas ha llevado a grandes problemas ambientales. También podemos citar al petróleo y sus derivados, los cuales aunque han sido la principal fuente de energía en los últimos años, también se encuentran entre los productos más tóxicos y de los cuales es muy frecuente escuchar derrames en ambientes naturales, con graves consecuencias ambientales. Por otro lado el desarrollo de materiales resistentes y de poca reactividad química se ha buscado como una propiedad para solucionar problemas relacionados con la conservación de alimentos, su transporte, conservación de edificaciones y desarrollo de las ciudades; esta propiedad ha llevado a que se acumulen grandes cantidades de basuras de carácter permanente. A lo anterior le podemos sumar los residuos de minería, los vertimientos de metales pesados tanto a las aguas como al suelo, ocasionando intoxicaciones a animales, incluido el hombre y a vegetales tanto de la región adyacente, como aguas abajo. Estos minerales producto de la minería o utilizados en su extracción pueden acumularse en los tejidos y ocasionar también graves problemas de fertilidad y de desarrollo animal y vegetal, motivo por el cual es importante controlarlos desde su origen. Bajo este panorama tan desolador hay alternativas de remediación cultural y natural y es precisamente de este segundo a que hace referencia el presente curso. Microorganismos como bacterias, algas y hongos u organismos más grandes como setas, helechos, plantas acuáticas y árboles, o sus enzimas (en caso de ser muy altas las concentraciones contaminantes), nos ayudan a reducir o eliminar estos compuestos tóxicos y perjudiciales para el ambiente y los humanos. Con su ayuda ha sido posible remediar los problemas de contaminación en el proceso denominado bioremediación, sin embargo son muchos los esfuerzos infructuosos producto de la inexperiencia o del desconocimiento de los procesos. Los procesos de bioremediación están en auge y constituyen un excelente negocio, sin embargo es necesario conocer los detalles de su funcionamiento para poder determinar cuál de todos es el más adecuado dependiendo del problema específico y las condiciones ambientales. El conocimiento adquirido ha servido para desarrollar herramientas de interés biotecnológico como por ejemplo, el uso de las bacterias, o parte de ellas en procesos de biomineria (extracción de metales de interés usando bacterias), de bioproducción de 9


sustancias de interés tales como bioplásticos o biopolímeros, energía (electricidad), sustancias de interés farmacológico, o enzimas que realizan procesos químicos de una forma más eficiente y más respetuosa con el medio ambiente que la industria química. Este módulo se estructura en 3 unidades, equivalente a 9 capítulos y 45 lecciones, y a través de su contenido se fomentan competencias relacionadas con la comprensión de la enorme importancia la bioremediación y su nivel de complejidad, al mismo tiempo que diferencia el campo de acción de su formación académica del de otros programas que, de igual forma, toman como objeto de estudio los tratamientos biológicos, pero desde la perspectiva del tratamiento de aguas residuales, como uno de los tratamientos secundarios o terciarios. En este documento se comenzará en la primera unidad con los conceptos básicos del ambiente, de los contaminantes, de bioremediación. En la segunda unidad se verán en detalle los organismos más importantes involucrados en estos procesos, su metabolismo, clases, procesos involucrados y sus aplicaciones. Finalmente en el tercer capítulo se retomarán las técnicas más importantes de bioremediación existentes en la actualidad, el proceso de selección del proceso más adecuado, los parámetros a tomar en cuenta, parámetros de diseño, funcionamiento y los posibles costos involucrados. Existen abundante información en la web, sin embargo solo unas pocas páginas se pueden consultar en forma académica, acerca de los procesos de bioremediación en general o de los procesos de contaminación ambiental directamente relacionados, lamentablemente la mayoría se encuentran en inglés, entre ellas se encuentran: La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA, por su sigla en inglés). http://www.epa.gov/nscep/index.html El grupo de discusión en bioremediación. http://www.bioremediationgroup.org/ Revista Internacional de contaminación ambiental. http://www.revistas.unam.mx/index.php/rica/index Con este panorama de aplicación y utilidad, dejamos las puertas abiertas al conocimiento y la instrucción, con miras a la apropiación del conocimiento y una correcta utilización futura en Colombia o donde se requiera. Bienvenidos!

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UNIDAD 1 Nombre de la CARACTERIZACIÓN DE CUERPOS Y CONTAMINANTES. Unidad CAPÍTULO 1

GENERALIDADES.

Lección 1

Introducción.

Lección 2

Conceptos básicos de bioremediación.

Lección 3

Características de los suelos: físicas, químicas y biológicas.

Lección 4

Características del agua: pH, aspectos físicos, químicos y aspectos microbiológicos.

Lección 5

Ventajas y desventajas de la bioremediación.

CAPÍTULO 2

CONTAMINANTES.

Lección 6 Lección 7 Lección 8 Lección 9 Lección 10

Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de Hidrocarburos (alifáticos, aromáticos = BTEX, PAHs). Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de Hidrocarburos clorados (PCBs, TCE, PCE, pesticidas, herbicidas). Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de Compuestos nitroaromáticos (TNT y otros). Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de metales pesados. Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de compuestos organofosforados, cianuros, fenoles.

CAPÍTULO 3

PROCESOS QUE INTERVIENEN EN LA BIOREMEDIACIÓN.

Lección 11

Interacciones microbianas.

Lección 12

Adaptacion, aclimatación y bioacumulación.

Lección 13

Biodisponibilidad y detoxificación.

Lección 14

Biodegradabilidad.

Lección 15

Sorción y biosorción.

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UNIDAD 1. CARACTERIZACIÓN DE CUERPOS Y CONTAMINANTES. CAPÍTULO 1. GENERALIDADES. En el campo ambiental existen muchas disciplinas que entrecruzan conocimientos, tales como biología, microbiología, ecología, ingeniería ambiental, ingeniería sanitaria, ingeniería agroecológica entre otros y los conceptos acerca de los tópicos ambientales difieren en mayor o menor medida en función de la formación que se está brindando. Sin embargo el ambiente es solo uno y aunque existen muchos conceptos existe una única realidad tangible, motivo por el cual es importante comprender claramente los conceptos básicos a utilizar en el transcurso del documento, de esta forma los estudiantes tendrán nociones comunes y podrán comprender y diferenciar mejor los procesos naturales y antrópicos. Se comenzará con los conceptos básicos de bioremediación, suelos, agua y los beneficios de diferentes métodos de bioremediación; luego se continuará con los diferentes tipos de contaminantes, sus propiedades, composición y toxicidad, para finalizar con los principales procesos que se deben de tener en cuenta en la bioremediación para que sea efectiva, cualquiera que sea el procedimiento a utilizar. Lección 1. Introducción. La bioremediación, como su nombre lo indica (bio=vida, remediación=arreglo o remediación) corresponde a el arreglo del ambiente con seres vivos, mas estrictamente hablando, se refiere a los procesos de degradación de contaminantes o transformación de ambientes contaminados con el uso de organismos vivos o sus derivados. Actualmente se conoce como bioremediación a los procesos que utilizan las habilidades de los organismos vivos para degradar y/o transformar contaminantes ambientales tanto en ecosistemas terrestres como acuáticos hasta niveles que no representen peligro al humano o al ambiente (Garbisu, Amézaga, & Alkorta, 2002). Para la bioremediación se utiliza el potencial metabólico de los microorganismos (bacterias, hongos y plantas) para transformar contaminantes en compuestos más simples, poco o nada contaminantes, con el fin de realizar una mineralización (Compuesto menos tóxico + CO2 + H2O), una transformación parcial, la humificación de residuos o de agentes contaminantes y una alteración del estado redox de los metales y por lo tanto se puede usar para limpiar terrenos o aguas contaminadas (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008). La biorremediación se ha centrado en la explotación de la diversidad genética y versatilidad metabólica que caracteriza principalmente a las bacterias (bioremediación), así como también a los hongos (micorremediación) y plantas (fitorremediación) para transformar contaminantes en productos inocuos o, en su defecto, menos tóxicos, que pueden entonces integrarse en los ciclos biogeoquímicos naturales (Garbisu et al., 2002), 12


o para almacenar estos contaminantes en sus tejidos, retenerlos a nivel de suelo en forma no perjudicial o volatilizarlos (fitoremediación). Estrictamente hablando, el uso de organismos vivos para el tratamiento de contaminantes ambientales no siempre se refiere a bioremediación, por ejemplo, un sistema de tratamiento de efluentes o un sistema de compostaje no son biorremediación, son tratamientos biológicos o mixtos para evitar la contaminación, en cambio la biorremediación siempre se utiliza para revertir un daño. Sin embargo el compostaje es una técnica amplia y con muchas variaciones, si se utiliza como método para revertir un daño, empleando material extraído de un sitio contaminado en mezcla con material no contaminado si se puede hablar de un uso para bioremediación, pero como lo veremos posteriormente, solo es aplicable en casos específicos. Tanto el tratamiento de residuos como la biorremediación usan microorganismos, pero lo distintivo de la biorremediación es la aplicación de una tecnología a posteriori, una vez que se ha producido el daño ecológico. La naturaleza tiene mecanismos de defensa contra cualquier inclemencia (física, química o biológica), lo que se conoce como capacidad de resiliencia, pero esta defensa o tolerancia tiene ciertos límites, los cuales, de ser superados por factores externos producen daños irreparables al ambiente. En muchas ocasiones los ecosistemas son tan seriamente alterados, que los mecanismos de recuperación naturales son demasiado lentos y hacen que el ambiente demore prolongados periodos para recuperarse; lamentablemente y afortunadamente son muchos los mecanismos de recuperación, los cuales dependen de las características físicas, químicas y biológicas de cada sitio específico, y en general del ambiente, haciendo casi imposible hacer predicciones de los tiempos requeridos para su recuperación total. Existen muchas referencias de fracasos al intentar aplicar modelos predictivos elaborados para reactores a procesos de biorremediación de aguas y suelos contaminados. Por ejemplo, uno de los tratamientos más habituales que se realizan cuando se aborda la biorremediación de una zona contaminada es la introducción de una cepa o población microbiana que posea las rutas degradativas necesarias para metabolizar el contaminante a eliminar (Garbisu et al., 2002), cuando en realidad el mejor mecanismo pudo haber sido la fitoremediación con especies vegetales específicas o una combinación de tratamientos. Gran parte de los elementos contaminantes son producidos de forma natural, pero muchos de estos son de origen sintético o artificial (hidrocarburos alifáticos, aromáticos, como BTEX, PAHs; hidrocarburos clorados como PCBs, TCE, PCE, pesticidas y herbicidas; compuestos nitroaromáticos como TNT; metales pesados; compuestos organofosforados, cianuros y fenoles), en cualquiera de los casos se convierten en contaminantes solo cuando superan los límites máximos permisibles, principalmente para la salud humana, de acuerdo a la legislación ambiental de cada país, siendo diferente los niveles permisibles 13


para un mismo contaminante en suelos y en aguas, así como entre diferentes países, los cuales se verán con cada contaminante en este mismo capítulo. Muchos organismos son capaces de degradar compuestos o sustancias contaminantes gracias a que su estructura química es similar a la de otras sustancias de las cuales se alimenta naturalmente como fuente de carbono, este potencial reposa en su dotación genética, la cual muchas veces es desconocido, de esta manera el organismo adapta su metabolismo para degradar sustancias nocivas al ambiente. En ambientes severamente contaminados la ausencia de otras fuentes de nutrientes obliga a los microorganismos mejor dotados a degradar los contaminantes, pero debido a que no es su alimento favorito o por encontrarse en muy altas concentraciones, puede repercutir en el funcionamiento de los microorganismos. En un ambiente súbitamente contaminado, las concentraciones de la sustancia a degradar generalmente son muy altas y los organismos deben de pasar por un proceso de aclimatación o adaptación a las nuevas condiciones para poder sobrevivir e iniciar su proceso de biodegradación, o esperar largos periodos a que los niveles de contaminación disminuyan, motivo por el cual el inicio de este proceso de forma natural es demorado y la descontaminación puede ser un proceso prolongado. Gran parte de los microorganismos aislados e incluso algas deben pasar por este proceso en condiciones de laboratorio, para probar sus límites de tolerancia y su capacidad como biodegradadores de cada elemento, esto se hace mediante aproximaciones a concentraciones crecientes de los diferentes contaminantes, para posteriormente poder ser utilizados en condiciones de campo. Caso contrario suele suceder con las plantas superiores, las cuales se pueden adaptar a las condiciones del entorno en zonas contaminadas y al no incorporar los contaminantes en su metabolismo, utilizan diferentes mecanismos para aislar o retener los contaminantes en sus tejidos. Muchos materiales nunca lograran ser degradados, pero para aquellos que si, existen diferentes métodos para lograr este objetivo dependiendo de los contaminantes y las herramientas disponibles. La bioremediación ha venido ocupando un lugar cada vez más importante al respecto, debido principalmente a los costos implicados, la eficacia de los procesos y los subproductos del tratamiento. No se pueden descartar las limitantes a los procesos biológicos y hace falta mucho conocimiento al respecto, pero es una alternativa poco invasiva y ambientalmente amigable con el entorno.

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Lección 2. Conceptos básicos de bioremediación. En la primera lección ya abarcamos el concepto de bioremediación y lo diferenciamos de los tratamientos biológicos o mixtos, en done se hace claridad que la bioremediación se refiere a la recuperación a posteriori y no constituye un programa preventivo. Sin embargo aunque no es tema de la bioremediación, se hace necesario aclarar que son los tratamientos primarios y secundarios, los cuales suelen citarse frecuentemente en los tratamientos de residuos; y es que cuando se habla de tratamiento de residuos generalmente se habla de tratamientos de primario a terciario, en donde el tratamiento primario corresponde a procedimientos mecánicos de separación de los desechos y el secundario corresponde generalmente a la remoción de materia orgánica por procesos químicos y/o biológicos. El objetivo principal de los tratamientos primarios es remover aquellos contaminantes que se pueden sedimentar, como sólidos, arenas, arcillas o aquellos que pueden flotar como las grasas, mientras el objetivo principal de los tratamientos secundarios es la reducción de la Demanda Bioquímica de Oxígeno (DBO). La demanda bioquímica de oxígeno o DBO es un término que sirve para explicar cuanto material es susceptible de ser consumido o destruido por microorganismos, debido a que son estos los que consumen bioquímicamente los residuos; generalmente es evalúa en un periodo de 5 días, por eso la convención más frecuentemente encontrada es DBO5. Existe un término muy asociado, la Demanda Química de Oxígeno (DQO), la cual es diferente al DBO y corresponde a la cantidad de materia que es posible ser consumida por métodos químicos, es decir que incluye a la DBO y por lo tanto es más alta que ésta; incluyendo lo que pueden degradar los organismos vivos y algún otro material degradable por procesos no biológicos. Al realizar bioremediación existen dos grandes grupos de tratamientos, dados por su nomenclatura en latín y son “ex-situ” e “in-situ” y se refieren al lugar de tratamiento. Insitu se refiere al tratamiento en el sitio donde existe el problema del contaminante, bien sea una mina y sus alrededores, como los cuerpos de agua, ríos o lagos que sean afectados, en este proceso el material a tratar no es removido mecánicamente del sitio donde está depositado, solo por fenómenos naturales; consiste en estimular la actividad de la población microbiana degradadora nativa del suelo, por adición y manejo de nutrientes y oxígeno. Mientras ex-situ se refiere a los tratamientos en los cuales el material a tratar, bien sea agua, suelo, turba, entre otros, es llevado de forma voluntaria al sitio donde se va a realizar el tratamiento, generalmente es una planta de procesamiento o un sitio preparado con este fin. Existen varios modos de biorremediación in-situ: forma aeróbica, forma anóxica o anaeróbica y cometabólica. La primera se refiere al requerimiento de oxígeno para que se desarrolle, ha demostrado que es la más eficiente para reducir niveles de contaminantes 15


alifáticos (como hexano) e hidrocarburos aromáticos del petróleo (como benceno y naftaleno) muy frecuentes en gasolinas y gasoil. Los modos anaeróbicos o anóxicos son los que no requieren oxígeno para ser desarrollados, a cambio se usa otro aceptor de electrones como los metales, a menudo usados para la remediación de otros compuestos tales como solventes clorados, pero generalmente son más lentos que los aeróbicos rompiendo los hidrocarburos del petróleo (Manacorda & Cuadros, 2005). El proceso denominado “cometabolismo” ó “cooxidación” consiste en la transformación de aquellos compuestos orgánicos, que no pueden ser utilizados como fuente de carbono ó energía por los microorganismos, pero pueden ser potencialmente degradados por enzimas generadas por los mismos, para metabolizar otras sustancias (Pellini, 2006). El uso del término “cometabolismo” se encuentra en discusión en el ámbito científico, ya que algunos autores utilizan este término sólo si el cosustrato se encuentra presente durante la metabolización del compuesto secundario (aquel que no aporta nutrientes y energía para el crecimiento). Sin embargo, el término cometabolismo, ha sido el más ampliamente empleado para describir el proceso donde un compuesto es transformado fortuitamente, sin ser utilizado como sustrato para el crecimiento ó como fuente de energía. Generalmente, los productos del cometabolismo son metabolitos ó subproductos parcialmente oxidados ó transformados, que pueden ser utilizados por otros microorganismos y de esta forma continuar hasta la degradación completa del compuesto contaminante (Pellini, 2006). Permeabilidad es un término empleado para referirse a la capacidad del suelo de retener un determinado líquido sin alterar su estructura interna, siendo una superficie impermeable aquella que no permite el paso de agua y permeable aquella que si lo permite. En bioremediación se utiliza con la permeabilidad al agua o a diferentes materiales tóxicos que se encuentran en forma líquida y es muy importante con respecto a los cuerpos de agua para consumo. Se denomina migración a todo desplazamiento de cualquier contaminante que se produce desde un lugar de origen a otro destino y lleva consigo un cambio de la ubicación. Muy relacionado está el término lixiviación, el cual conserva el significado ecológico que indica el desplazamiento hacia los ríos y mares de los contaminantes, generalmente no en forma superficial sino a través de las capas del suelo. Algunos términos se siguen utilizando por su nombre en inglés, como: Landfarming o laboreo del terreno: La técnica consiste en dispersar el contaminante a biodegradar sobre la capa arable (15-20 cm superficiales) de un terreno destinado a tal fin (Manacorda & Cuadros, 2005).

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Biosparging: es definida por Wilson (1999) como un método in-situ que combina el efecto de la ventilación y la adición de nutrientes con la utilización de microorganismos autóctonos para degradar compuestos orgánicos absorbidos por el suelo en la zona saturada (Torres Rodríguez, 2003). Compost o composta: es el producto que se obtiene del apilamiento y descomposición de materia orgánica de forma controlada. La composta se forma de desechos orgánicos, que en bioremediación se mezclan con los productos contaminantes para lograr su descomposición por procesos aeróbicos. Bioventeo: Consiste en la inyección de aire y oxígeno al suelo para estimular la biodegradación aeróbica del contaminante. El proceso de bioventeo estimula la actividad biológica in-situ y promueve la biorremediación (Manacorda & Cuadros, 2005). Biofiltración: Es un proceso que se basa en la entrada de aire contaminado a birreactores en los cuales la flora microbiana convierte los contaminantes orgánicos volátiles en dióxido de carbono, agua y biomasa (Torres Rodríguez, 2003). Lodo: es una mezcla de agua, microorganismos y nutrientes, con residuos sedimentables (Riser-Robers, 1996), suele utilizarse en plantas de tratamiento para los procesos finales. La concentración de microorganismos es una medida de la población de hongos, bacterias y/o algas, generalmente se expresa en unidades por gramo, mililitro o centímetro cúbico. Inhibición: es la interrupción de alguna respuesta, en bioremediación suele usarse para el crecimiento o reproducción de los organismos, bien sean microscópicos o macroscópicos. Biodegradar: se refiere al proceso de descomponer un compuesto en los elementos químicos que lo conforman, debido a la acción de agentes biológicos bajo condiciones ambientales naturales. Biodisponibilidad: es la disponibilidad de una sustancia a ser degradada por los organismos vivos, un fenómeno que afecta de forma negativa a la biodisponibilidad de los contaminantes es el envejecimiento o “ageing” que se define como la pérdida de la biodegradabilidad de los compuestos a lo largo del tiempo en el suelo (aunque la población microbiana mantenga intacto su potencial catabólico), el cual es más importante en suelos con elevado contenido en materia orgánica (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009).

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Lección 3. Características de los suelos: físicas, químicas y biológicas. El suelo es algo más que la superficie donde sembramos las plantas y donde se construyen los edificios, el suelo es un sistema dinámico, un sistema vivo con muchos componentes de tipo físico, químico y biológico, en cuyo interior todos los detalles de su composición afectan y son afectados por el entorno y en el cual todos los componentes interactúan para mantener un equilibrio dinámico. A continuación se nombraran secuencialmente y en negrilla las propiedades físicas, químicas y biológicas más importantes. La porosidad corresponde a los espacios del suelo llenos de aire y/o agua. Los macroporos no retienen el agua contra la fuerza de la gravedad, y por lo tanto son los responsables del drenaje y la aereación del suelo; los microporos son los que retienen agua, parte de la cual es disponible para las plantas. La porosidad total o espacio poroso del suelo, es la suma de macroporos y microporos. Las características del espacio poroso, dependen de la textura y la estructura del suelo (Rucks, García, Kaplán, Ponce De León, & Hill, 2004). La textura es la proporción de arena, limo y arcilla. Se dice que un suelo tiene una buena textura cuando la proporción de los elementos que lo constituyen le dan la posibilidad de ser un soporte capaz de favorecer la fijación del sistema radicular de las plantas y su nutrición. Cuando en la textura domina la fracción arcilla, en la porosidad total del suelo hay muchos más micro-poros que cuando domina la fracción arena. Lo anterior se comprende claramente, si se piensa que entre las microscópicas partículas de arcilla los espacios son pequeños; en cambio entre las partículas de arena los poros son mayores (Rucks et al., 2004). La textura tiene un impacto directo sobre las propiedades físicas, químicas y biológicas del suelo, ya que la mayoría de los procesos de bioremediación la realizan los microorganismos y la actividad de estos predomina en las arcillas, y por consiguiente influye en las tecnologías de remediación (Pellini, 2006). La estructura del suelo es el arreglo de las partículas del suelo, siendo las partículas, no solo la arena, limo y arcilla, sino también los agregados o elementos estructurales que se forman por la agregación de las fracciones granulométricas (Rucks et al., 2004). En la Figura 1 se muestran algunos tipos de estructura; la estructura granular o migajosa presenta unidades esféricas o casi esféricas, con bordes y caras más o menos redondeados. Los contactos entre estas unidades se dan en pocos puntos y queda mucho espacio entre ellos. Si las unidades mayores son «desarmadas», se ve que están compuestas por unidades más pequeñas que poseen las mismas características. Se desprende de lo anterior que las partículas secundarias tienen porosidad interna – cosa que no ocurre en los granos de arena (Rucks et al., 2004).

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Figura 1: Algunos tipos de estructura de suelo. A. Prismática, B. Columnar, C. Bloques angulares, D. Bloques subangulares, E. Laminar, F. Granular (Rucks et al., 2004). La permeabilidad es la facilidad o dificultad con la que un líquido puede fluir a través de un medio permeable. La permeabilidad de un suelo es uno de los factores que controla la efectividad de tecnologías in-situ. En general, una baja permeabilidad en el suelo disminuye la efectividad de la mayoría de las tecnologías de remediación (Pellini, 2006). La temperatura es uno de los factores ambientales más importantes que afecta la actividad metabólica de los microorganismos y la tasa de biodegradación. Generalmente, las especies microbianas crecen a intervalos de temperatura entre 20 y 30 ºC, decreciendo la biodegradación por desnaturalización de las enzimas a temperaturas superiores a 40 ºC e inhibiéndose a inferiores a 0ºC. Aunque en general la velocidad de degradación aumenta con la temperatura, alcanzando en el compostaje los 65 oC (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008; Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). El carbono es la fuente principal de alimento y se relaciona con casi todas las propiedades edáficas, generalmente se le conoce como materia orgánica y generalmente es el contaminante; un artículo muy completo que relaciona el carbono orgánico con las propiedades del suelo fue publicado por Martínez H, Fuentes E, & Acevedo H. (2008). Entre los macro-elementos o elementos que deben estar en grandes cantidades para el desarrollo normal de las plantas y microorganismos están el fósforo y el nitrógeno, el primero de los cuales se suele fijar a los suelos, mientras el segundo generalmente es bastante abundante en el suelo. Ambos elementos son importantes por formar parte de todos los tejidos de microorganismos y plantas. La dosificación de nitrógeno y fósforo se realiza en función de la concentración del contaminante C:N:P (100:10:1)(Torres Delgado 19


& Zuluaga Montoya, 2009). La fuente de fósforo interviene en la formación de compuestos energéticos (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008). Otros nutrientes esenciales como el Ca2+, Na+, Fe2+ y SO42- están presentes en cantidades suficientes en el suelo; mientras que el calcio, magnesio, potasio, titanio, manganeso, sodio, níquel y azufre se presentan en pequeñas cantidades. Además es importante destacar que la acción de los nutrientes inorgánicos puede estar limitada debido a la interacción química con los minerales del suelo (el amonio se puede unir a las arcillas por intercambio catiónico y el fosfato puede unirse y precipitar con iones calcio, hierro y aluminio) (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). El pH es importante para el desarrollo de los organismos degradadores. En consecuencia, cuanto mayor sea la diversidad de microorganismos existentes, potencialmente mayor será el rango de tolerancia. No existen unas condiciones preestablecidas que sean óptimas en todos los casos; en general, el pH óptimo para las bacterias heterótrofas es neutro (pH 6-8), mientras que es más ácido para los hongos (pH 4-5). El pH óptimo establecido para procesos de biodegradación es neutro (pH 7,4-7,8) (Dible & Bartha, 1979; Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008). Así mismo el pH también afecta directamente en la solubilidad del fósforo y en el transporte de metales pesados en el suelo, entre más ácido el suelo, mas soluble es el fósforo (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). El pH también influye en la disponibilidad de los denominados metales pesados (Figura 2).

Figura 2: Movilidad de iones de acuerdo al pH del suelo. (http://reformaminera.files.wordpress.com/2008/05/metales-pesados.pdf)

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La humedad es el contenido de agua en el suelo, es importante ya que actúa como medio de transporte de nutrientes y oxigeno a la célula y es parte del protoplasma microbiano, un exceso de humedad produce deficiencia de oxígeno, un déficit impide el desarrollo de los microorganismos (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008). La humedad del suelo puede limitar de forma severa la biodegradación, fundamentalmente en suelos superficiales afectados por oscilaciones importantes en el contenido de agua. No obstante el nivel óptimo de humedad depende de las propiedades de cada suelo y el tipo de contaminación (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). Los metales y sales en altas concentraciones intoxican a los microorganismos. En el caso de los metales se puede aumentar el pH para inmovilizar el metal. Si se tienen suelos muy contaminados con metales o sales se debería diluir con suelo limpio para reducir la concentración (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008). El oxígeno en el suelo no es continuo y está localizado en los poros separados por los sólidos, este aire tiene generalmente una humedad más alta que la de la atmósfera. El contenido de anhídrido carbónico (CO) es por lo general más alto y el del oxígeno más bajo que los hallados en la atmósfera. La mayor parte de los contaminantes son degradados con mayor extensión y rapidez de forma aeróbica (O2 como aceptor final de electrones), ya que en ausencia de O2, y en presencia de aceptores de electrones alternativos (NO3-, SO42-, CO2, Mn4+ y Fe3+) los contaminantes pueden ser degradados, pero con unas tasas de biodegradación muy inferiores a las aeróbicas (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). La diversidad de microorganismos ayuda a que exista un mayor potencial de degradación de sustancias tóxicas, bien sea por la producción de enzimas o biosurfractantes o por la presencia de proteínas de superficie (moléculas de adhesión, receptores y/o transportadores de contaminantes) que puedan facilitar la degradación de los contaminantes. Suelos con mayor diversidad de organismos es más factible que se pueda desarrollar el proceso de bioremediación más fácilmente en forma natural. Aunque la porción de los organismos vivos solamente ocupan un 1% del suelo, son los responsables en la mayoría de los casos de los procesos de biodegradación en todo el suelo. Entre los organismos a los que se ha encontrado propiedades de degradación de contaminantes se encuentran hongos macroscópicos y microscópicos, bacterias, algas, micobacterias y plantas, y la presencia de uno no impide la presencia de otros, incluso en ocasiones trabajan de manera sinergística; de tal manera que el trabajo conjunto puede ser más eficiente que el trabajo de un solo organismo, como suele suceder con plantas y microorganismos a nivel de raíz, por lo tanto entre más diverso sea un sistema, mayor posibilidad tiene de degradar diversos contaminantes.

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Finalmente, es importante resaltar las propiedades emergentes del sistema suelo, las cuales son producto de las interacciones entre todos sus componentes, entre estas propiedades emergentes se encuentran la capacidad de bioremediación, biosorción o la capacidad de resiliencia o resistencia ante impactos externos.

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Lección 4. Características del agua: pH, aspectos físicos, químicos y aspectos microbiológicos. En 1781 el científico inglés Henry Cavendish (1731 – 1810) descubrió que el elemento agua no es un elemento simple, sino complejo y susceptible de descomponerse en oxígeno e hidrógeno. Pocos años más tarde el químico francés Gay-Lussac (1778 – 1850) confirmó la teoría de Cavendish, al lograr obtener agua a partir de la mezcla de dos volúmenes de hidrógeno con uno de oxígeno. El hecho vendría a confirmar que el agua es un compuesto químico, un conjunto de dos moléculas formadas a su vez por encadenamiento de dos átomos de hidrógeno con uno de oxígeno, de ahí la formula que se emplea para designarla sea H2O. Las propiedades del agua pesada (con deuterio) difieren ligeramente de las del agua ligera, pero ambas poseen un momento eléctrico que se manifiesta en sus propiedades físicas y eléctricas, es por ellos que el agua es del tipo de líquidos polares. Se adopta para su representación, un modelo triangular que debido al carácter electronegativo del oxígeno el ángulo que forman los enlaces H-O-H es de 105o aproximadamente. La estructura del agua depende de su estado físico, el estado gaseoso (vapor) corresponde exactamente a la formula H2O y, en especial al modelo angular indicado (Figura 3a). Los estados condensados (líquido y sólido) son más complicados y esta complicación explica sus propiedades anormales; en estado sólido, la disposición elemental consiste en una molécula de agua central y cuatro periféricas, tomando el conjunto la forma de un tetraedro (Figura 3b).

A. B. Figura 3: Molécula de agua. A. en estado líquido (tomado de http://www.kalipedia.com/ecologia/tema/graficosmolecula-agua.html?x1=20070417klpcnatun_87.Ees&x=20070417klpcnatun_97.Kes), B. En estado sólido (tomado de http://www.diasporaweb.es/13.html). En el agua en estado líquido hay una asociación entre varias moléculas por enlaces especiales llamados enlaces de hidrógeno: cada átomo de hidrógeno de una molécula de 23


agua, se une al átomo de oxígeno de la molécula vecina; en el espacio la estructura es tetraédrica; al respecto hay una animación muy sencilla en la dirección: (http://www.ucm.es/info/diciex/proyectos/agua/estructura_moleculas.html). En el Cuadro 1 se pueden observar las principales características del agua. Cuadro 1: Principales características del agua. Peso molecular (g/mol) Temperatura crítica (oC) Punto de ebullición a 1 atmósfera de presión (oC) Punto de fusión a 1 atmósfera de presión (oC) Conductividad eléctrica (µSiemens/m) a 20oC en estado “puro”. Agua con sales (electrolitos) posee mayor CE, a mayor temperatura mayor CE Densidad a 0oC en estado líquido (g/cm3) Densidad a 4oC en estado líquido (g/cm3) Densidad a 100oC en estado líquido (g/cm3) Densidad de agua de mar (35 g/dm3) a 0oC en estado líquido. Conforme la temperatura aumenta o disminuye a partir de los 4oC, disminuye la densidad. Capacidad calorífica a 15oC (cal/mol oC) Calor de vaporización (Kcal /mol) Calor específico (cal/g) Calor de fusión (Kcal/mol) Estos valores, relativamente muy elevados, hacen que el agua sea muy buena termorreguladora. Viscosidad cinemática a 0oC (m2/s) Dificultad que ofrece un líquido para que algo se mueva a través de él, si aumenta la temperatura, entonces disminuye la viscosidad, si existe concentración de sales, entonces aumenta. Con un pequeño aumento de presión y baja temperatura, disminuye la viscosidad (comportamiento anómalo). Turbidez (mg /L SiO2, m de disco Secchi, JTU, UNF) Dificultad en la transmisión de la luz, producida por partículas coloidales y en suspensión. La transparencia depende de la longitud de onda de la luz que la atraviesa, rayos UV pasan fácilmente, rayos IF penetran poco, el agua absorbe bastante el anaranjado y el rojo, de allí la coloración verde-azul.

18.16 374.1 100 0 4.2 * 10-6 0.99987 1.0000 0.95838 1.0281

18.0 9.719 0.999 1.435

1.792

La gran estabilidad del agua en la naturaleza, sumado a sus propiedades eléctricas y a su constitución molecular, le confieren el poder de disolver variados compuestos minerales, productos orgánicos, de mezclarse con líquidos miscibles o inmiscibles, así también el de disolver un buen número de gases. La disolución de sólidos (sales) esta favorecida por las reacciones ácido-base, las reacciones de oxidación-reducción, la hidratación y la hidrólisis. La velocidad de disolución depende de factores, tales como la concentración real en el agua, la superficie de contacto que aumenta al triturar y al mezclar, la agitación, el tiempo y la temperatura puesto que a mayor temperatura, mayor velocidad de disolución. 24


Los límites permisibles para muchos elementos tóxicos o no, disueltos en el agua dependen del uso que se le piense dar al agua y del elemento en cuestión, como se puede observar en el Cuadro 2. Cuadro 2: Límites permisibles para metales pesados, cianuros y contaminantes en agua de acuerdo a la Universidad Autónoma de México (UAM, 2000).

Entre los elementos importantes para el crecimiento algal, en particular Chlorella vulgaris (alga bioremediadora), se encuentra el contenido de P y N, así como su relación estequiométrica, los cuales determinan su tasa de crecimiento, siendo ambos elementos limitantes del crecimiento y no se pueden considerar por separado (Aguirre Ramírez, Palacio Baena, Correa Ochoa, & Hernández Atilano, 2007).

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Lección 5. Ventajas y desventajas de la bioremediación. Se pueden hacer varios comparativos respecto a las ventajas y desventajas de la bioremediación. Por ejemplo se puede comparar la bioremediación con respecto a los métodos mecánicos de remediación, también entre la fitoremediación y los otros métodos de bioremediación; cualquiera que sea la comparación son más las ventajas que las desventajas tanto económicas como ambientales. Comenzaremos con el punto de vista más general, comparando la bioeremediación con los métodos clásicos de remediación. A continuación en el Cuadro 3 se presenta un compendio de las ventajas y desventajas de la bioremediación a partir de varios autores como (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008; Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009; Villaseñor Roa, 2011). Cuadro 3: Ventajas y desventajas de la bioremediación. Ventajas Generalmente solo origina cambios físicos menores sobre el medio. Permite la revegetalización natural. Puede ser útil para retirar algunos de los compuestos tóxicos del petróleo. Ofrece una solución más simple y completa que las tecnologías físicas o químicas, como la incineración utilizada para remover sustancias tóxicas del suelo. Es menos costosa que otras tecnologías. Puede aplicarse in-situ o ex – situ. Es más efectiva que otros métodos, pudiendo lograr la detoxificación completa. Como subproducto se obtiene un suelo útil para la agricultura. Apenas se generan residuos y los que se generan en su mayoría no son tóxicos. Es un proceso natural, aceptado por la opinión pública y normativas medioambientales. Mientras que los tratamientos físicos y buena parte de los químicos están basados en transferir la contaminación entre medios

Desventajas Para muchos tipos de vertidos su efectividad no ha sido determinada. De muy difícil aplicación en el mar. El tiempo necesario para la actuación es largo. Su implementación es específica para cada lugar contaminado; requiriendo de diversos factores del sitio como la presencia de microorganismos activos y condiciones de crecimiento adecuadas. El seguimiento y control de la velocidad y/o extensión del proceso son dispendiosos. Dificultad para predecir el funcionamiento de este tratamiento. El nivel de contaminantes no debe ser tóxico para los microorganismos; en el caso de hidrocarburos debe ser <30%. Es aplicable casi solo a compuestos biodegradables. Es difícil predecir el tiempo de requerido para un proceso adecuado. Es difícil de extrapolar condiciones del laboratorio o planta piloto al sitio final a remediar. La biodegradación incompleta puede generar intermediarios metabólicos inaceptables, con un poder contaminante similar o incluso

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gaseoso, líquido y sólido, en la biorremediación se transfiere poca contaminación de un medio a otro; lo que ocasiona es su degradación final. Cuando se utiliza correctamente no produce efectos adversos significativos.

superior al producto de partida y algunos compuestos contaminantes son tan resistentes que pueden incluso inhibir la biorremediación. Requiere investigación multidisciplinaria para determinar y optimizar las condiciones de biorremediación. No requiere de equipamiento especializado Su optimización requiere información para su aplicación, es poco invasiva y sustancial acerca del lugar contaminado y las generalmente no requiere componentes características del vertido. estructurales o mecánicos que signifiquen una amenaza para el medio.

Conociendo las ventajas y desventajas de la bioremediación en comparación con los tratamientos mecánicos, físicos y químicos, se puede observar mejor las ventajas y desventajas solamente de la fitorremediación en comparación con otros métodos de remediación (Agudelo Betancur, Macias Mazo, & Suárez Mendoza, 2005)(Cuadro 4). Cuadro 4: Ventajas y desventajas de la fitoremediación con respecto a otros métodos de remediación. Ventajas La fitorremediación utiliza las capacidades existentes de las plantas y de los sistemas que apoyan para limpiar los suelos, siendo más rentable que los métodos usados tradicionalmente para la recuperación de suelos contaminados. La fitorremediación implica menos trabajo y no perturba los alrededores naturales del sitio de la contaminación. Los metales absorbidos por las plantas, pueden ser extraídos de la biomasa cosechada y después ser reciclados. Puede reducir la entrada de contaminantes en el ambiente, porque los contaminantes quedan atrapados en las plantas. Se puede utilizar para limpiar una gran variedad de contaminantes, por su capacidad de absorción de estos en sus raíces. Es una buena manera de hacer uso de los recursos naturalmente existentes.

Desventajas La fitorremediación trabaja lo mejor posible cuando los contaminantes están al alcance de las raíces de las plantas, típicamente de tres a seis pies de profundidad para las herbáceas y 10 a 15 pies para los árboles. El metal pesado ó el contaminante emplea el ciclo natural de plantas y por lo tanto toma tiempo. Algunas plantas absorben muchos metales venenosos, lo que implica un riesgo potencial a la cadena alimenticia

Finalmente se hace un comparativo entre los métodos de bioremediación ex-situ, en varios aspectos de utilidad y costos (Cuadro 5): 27


Cuadro 5: Comparativo de las técnicas ex-situ de bioremediación (Villaseñor Roa, 2011). Técnica Biopilas

Bioreactores

Compostaje

Landfarming

Descripción Se utilizan cuando la sustancia contaminante es demasiado volátil como para ser tratada por landfarming, ya que las emisiones gaseosas serían demasiado altas o también se usa cuando se requiere acelerar el proceso de bioremediación. El tratamiento se aplica para la eliminación de Carbono Orgánico Volatil (COV), de no halogenados e hidrocarburos. Los COV halogenados, los compuestos semivolátiles y los pesticidas también pueden ser tratados mediante esta tecnología, pero la eficiencia del proceso puede disminuir y puede ser solo aplicable a ciertos compuestos dentro de estos grupos. Cuesta entre 160 y 210 dólares el m3 de suelo. Se aplica a explosivos, PAHs y plaguicidas. Se requieren bioreactores secuenciales aeróbicos/anaeróbicos, los cuales mejoran la remediación de PCBs y de algunos explosivos. Cuesta entre 160 y 210 dólares el m3 de suelo. Se aplica a explosivos y PAHs. Se debe mantener las condiciones de aireación, humedad y temperatura. Para la aireación se utiliza la mezcla mecánica de montones, mezcla estática e inyección y bombeo en pilas. Se debe controlar la emisión de VOCs. Los costos van entre 150 y 220 dólares por m3 de suelo. Se aplica a hidrocarburos del petróleo no VOCs, combustibles, PCP y algunos plaguicidas. Degrada, transforma e inmoviliza contaminantes. Se deben recoger y tratar las escorrentías y los lixiviados. Cuesta 150 dólares el m3 de suelo.

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CAPÍTULO 2. CONTAMINANTES. Contaminante es un concepto muy amplio y se considera como tal cualquier agente que tiende a modificar el equilibrio natural del medio ambiente y además puede incidir sobre la biosfera. Es importante conocer que se conoce como xenobiótico a toda sustancia extraña o ajena a las que proceden del metabolismo de los seres vivos, por lo tanto, contaminantes de naturaleza química y que suelen producir efectos tóxicos, o al menos alteraciones en el normal funcionamiento de las células vivas. Entre los contaminantes más abundantes en el medio y perjudiciales para los sistemas biológicos se pueden destacar los metales pesados y algunas sustancias orgánicas: plaguicidas, hidrocarburos halogenados y no halogenados, PCBs, DBF y DBD, residuos químicos tóxicos, junto con las radiaciones nucleares, etc. Su riesgo radica en su persistencia y consecuente acumulación, en la formación de asociaciones químicas complejas, en su capacidad de reacción y a veces, como consecuencia, su toxicidad creciente. Un tóxico es cualquier sustancia que causa efectos adversos a los organismos vivos y ejerce ese efecto con una relación dosis-respuesta. De acuerdo a la dosis, la toxicidad puede ser aguda cuando causa mortalidad en el 50% de la población de estudio (DL50) o crónica o de efecto lento (tumores, úlceras, irritaciones, etc.); además está sometida a una fuerte influencia de factores externos (dieta, medio ambiente, forma de administración, etc) e internos (edad, sexo, condiciones fisiológicas, genéticas, etc).

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Lección 6. Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de Hidrocarburos (alifáticos aromáticos=BTEX, PAHs). Los hidrocarburos alifáticos poliaromáticos (PAHs) se encuentran en todas partes, siendo producidos de forma natural y principalmente antrópicamente. Las principales fuentes son los incendios de bosques (Blumer & Youngblood, 1975), erupciones volcánicas (Ilnitsky, Mischenko, & Shabad, 1977) y la degradación de los materiales biológicos (White & Lee, 1980). Las principales fuentes antropogénicas son la quema de carbón, producción de petróleo, automóviles, incineradores comerciales y calefactores en base a madera (Lesage & Jackson, 1992) y asfalto (Lacasaña Navarro, González Alzaga, Rodriguez Barranco, & Daponte Codina, 2008; Quinn, 2012). Además de estas fuentes contaminantes, el humo del tabaco es considerado como la principal fuente de contaminación por PAHs y benceno en ambientes interiores, pudiendo incrementar considerablemente su exposición con respecto a ambientes libres de humo (Adgate, Chuch, & Ryan, 2004; Lacasaña Navarro et al., 2008; Quinn, 2012). Los Hidrocarburos Aromáticos Polinucleares o Policiclicos son conocidos mas comúnmente como PAHs por su sigla en inglés, son subproductos orgánicos del procesamiento del petróleo o de su combustión incompleta. Muchos son carcinógenos a bajas concentraciones. Aunque son relativamente insolubles en agua, su carácter peligroso para la vida acuática y el humano los hace merecedores de evaluarse en aguas potables y de desecho (Eaton, Clesceri, Rice, & Greenberg, 2005; Van Metre, Mahler, Scoggins, & Hamilton, 2006). Son sustancias orgánicas neutras, no polares con dos o más anillos de benceno en varias configuraciones. Estados Unidos ha incluido 16 PAHs en la lista de poluyentes de alta prioridad a ser monitoreados en aguas y residuos (NRC, 1997), y aunque existen cientos de ellos, los dos más comunes son el benzo(a)pireno y el naftaleno (Quinn, 2012), los más peligrosos aparecen listados en la Figura 4.

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Figura 4: Estructuras, fórmulas químicas y pesos moleculares de 16 poluyentes PAHs de acuerdo a la EPA (NRC, 1997). Los hidrocarburos pueden llegar a ser un gran contaminante, sin embargo existen límites permisibles, los cuales son establecidos de acuerdo a criterios en cada país, como se muestra en el Cuadro 6. Cuadro 6: Límites máximos permisibles para hidrocarburos específicos en suelos según la norma oficial mexicana NOM -138-SEMARNAT/SS-2003 (SEMARNAT, 2005).

En Ecuador, los límites permisibles para la identificación y remediación de suelos contaminados en la industria de hidrocarburos son diferentes, se evalúa los hidrocarburos totales (mg/kg), los cuales deben ser: para uso agrícola (<2500), para uso industrial (<4000) y para ecosistemas sostenibles (<1000) (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008). Pueden continuar en el aire, agua y suelo por meses o años y entre los síntomas a corto plazo se incluye la irritación ocular, nauseas, vómito, diarrea y confusión y aunque no son claros los efectos a largo plazo, estos pueden incluir, cataratas, enfermedades renales y del hígado, rompimiento de los glóbulos rojos e incluso en animales de laboratorio ha inducido cáncer (Quinn, 2012). En el trabajo de (Botello, Villanueva, Diaz, & Pica, 1995) realizado en un puerto de OaxacaMéxico, se encontró que las cantidades de PAHs se incrementaron en varios órdenes de magnitud, lo que indico un importante proceso de bioacumulación de estos compuestos, y sobre todo de aquellos conformados por 4 o 5 anillos bencénicos, los cuales se consideran como carcinógenos ambientales, con sus consecuentes efectos e impactos en las pesquerías (efectos deletéreos de tipo sub-letal en camarones – reducción en la tasa de crecimiento, en la viabilidad de los gametos e irregularidades en el desarrollo larvario). 31


BTEX es una abreviación usada para cuatro compuestos aromáticos volátiles encontrados en los productos del petróleo: Benceno, Tolueno, Xileno y Etilbenceno (Figura 5), los cuales son encontrados juntos en suelos contaminados (Communities, 2012).

Figura 5: Benceno, Tolueno, Etilbenceno y Xileno. El benceno es usado en la producción de materiales sintéticos y productos para el consumidor, tales como caucho sintético, plásticos, nailon, insecticidas y pinturas. El tolueno es usado como un solvente para pinturas, cubiertas, gomas, aceites y resinas. El etilbenceno puede estar presente en productos para el consumidor como pinturas, tintas, plásticos y pesticidas. Los xilenos son usados como solventes para impresión, cauchos e industrias de impresión (Communities, 2012). Los límites permisibles para el BTEX son de 0.005, 1.0, 0.7 y 10 mg/L respectivamente. En México los límites máximos permisibles para BTEX en agua potable son 0.05, 0.3, 0.7 y 0.5 mg/L respectivamente (Acuña Askar et al., 2008). La exposición a BTEX en población general se produce fundamentalmente por inhalación o por contacto, más que por otras vías como la ingestión a través de alimentos o bebidas contaminadas. Por su carácter cancerígeno, el benceno ha sido catalogado como Categoria A por la Internacional Agency for Research on Cancer (Lacasaña Navarro et al., 2008). Es un contaminante ambiental ubicuo (Wallace, 1989) y se han constatado efectos graves en la salud de los trabajadores expuestos al mismo. Con relación a estos efectos, la exposición al benceno puede producir leucemia aguda no linfocitica y una variedad de otros desordenes hematologicos. El nivel de riesgo establecido por la Organización Mundial de la Salud está entre 3,8 y 7,5 casos de leucemia mieloide por cada millón de personas expuestas durante toda su vida a 1 Bg/m3 de benceno (Lacasaña Navarro et al., 2008). Además de los efectos cancerígenos del benceno también se han descrito otros daños en la salud asociados con la exposición a altas dosis de estos Compuestos Orgánicos Volátiles (COVs), tales como efectos respiratorios (asma), hematologicos (anemia, trombocitopenia, 32


leucopenia, pancitopenia, anemia aplástica), inmunológicos, neurológicos y reproductivos y de desarrollo (ATSDR., 2007; Lacasaña Navarro et al., 2008).

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Lección 7. Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de Hidrocarburos clorados (PCBs, TCE, PCE, insecticidas, herbicidas). Un compuesto organoclorado, hidrocarburo clorado, clorocarbono o compuesto orgánico clorado es un compuesto químico orgánico, es decir, compuesto por un esqueleto de átomos de carbono, en el cual, algunos de los átomos de hidrógeno unidos al carbono, han sido reemplazados por átomos de cloro, unidos por enlaces covalentes al carbono. Su amplia variedad estructural y las propiedades químicas divergentes conducen a una amplia gama de aplicaciones. Muchos derivados clorados son controvertidos debido a los efectos de estos compuestos en el medio ambiente y la salud humana y animal, siendo en general dañinos para los seres vivos, pudiendo llegar a ser cancerigenos. Muchos de ellos se emplean por su acción insecticida o pesticida. Muchos compuestos organoclorados han sido aislados de fuentes naturales que van desde las bacterias hasta los seres humanos. Los compuestos orgánicos clorados se encuentran en casi todas las clases de biomoléculas, incluyendo alcaloides, terpenos, aminoácidos, flavonoidess, esteroidess, y ácidos grasos. Los organoclorados, incluyendo las dioxinas, se producen en ambientes de alta temperatura como los incendios forestales. Las dioxinas se han encontrado en cenizas conservadas de incendios provocados por rayos anteriores a la producción de dioxinas sintéticas. Además, muchos hidrocarburos clorados simples como el diclorometano, cloroformo, y tetracloruro de carbono se han aislado a partir de algas marinas. La mayor parte del clorometano presente en el medio ambiente es producido naturalmente por descomposición de restos biológicos, incendios forestales y volcanes. En la legislación para la provincia de Buenos Aires (Argentina) hay un extenso listado de contaminantes de diferentes orígenes incluidos productos de desinfección, componentes orgánicos (como hidrocarburos clorados) e inorgánicos con sus límites tolerables, a los cuales puede acceder mediante la siguiente liga (ITAM, 2009). Los PCBs o Bifenilos policlorados son compuestos volátiles solubles en tejido graso, usados habitualmente como disolventes, aislantes o refrigerantes. Son hasta 200 sustancias diferentes, con distinto grado de cloración y de sustitución (Figura 6).

Figura 6: Estructura de los PCBs. Dos anillos fenilos rodeados por cloro. 34


C=Carbono, Cl=Cloro. El número de átomos de Cl varía de 1 a 10 (Arbeli, 2009). La familia incluye cerca de 200 compuestos con estructura de bifenilo y que están clorados en un grado variable. Generalmente en los PCBs comercializados se encuentran alrededor de 50 o más de estos congéneres. La situación de los Cl sustituyentes permiten o impiden la rotación de los anillos. Presentan estabilidad inercial química (muy lenta degradación físico-química y biológica), no son volátiles, resisten oxidación ácida y básica, son difícilmente hidrolizables, hidrófóbicos, lipofílicos, presentan una baja evaporación. Son resistentes al calor (estables hasta los 200oC), son difícilmente combustibles, buenos conductores de calor, son buenos aislantes eléctricos (alta constante dieléctrica). Adicionalmente son absorbidos por los suelos, sedimentos y acuíferos, pudiendo formar complejo con los suelos, produciendo bioacumulación y biomagnificación. Se absorben por los pulmones y sobre todo por vía cutánea, los compuestos menos clorados desaparecen antes, son más degradables, también son más tóxicos. Los mas clorados son más persistentes y bioacumulables en el tejido adiposo y tienen también menor poder tóxico. En los humanos atraviesan la barrera hematoencefálica y la placenta; retrasan el crecimiento y aceleran el metabolismo de drogas. Los compuestos altamente clorados producen modificaciones en hígado, alteran los ciclos reproductivos e inducen malformaciones. La degradación de PCB ha sido estudiada ampliamente. Sin embargo, su aplicación en campo es aún muy limitada. En general, es recomendable usar un esquema constituido por un proceso de degradación anaeróbica, seguido por uno de degradación aeróbica, complementado todo esto con la totalidad de la comunidad microbiana que es esencial para degradar un amplio rango de congéneres, además de un gran número de productos de degradación. La complejidad de la remediación de sitios contaminados con PCB requiere de conocimientos detallados y, por tanto, es necesario seguir investigando y mejorando la biodisponibilidad de PCB, la deshalogenación reductiva y el proceso de degradación aeróbica para superar las barreras relacionadas con la biorremediación de sitios contaminados con PCB (Arbeli, 2009). Los PCB han sido reemplazados por los éteres de difenilo polibromados (PBDE), que poseen una toxicidad y problemas de bioacumulación similares. Su bioremediación se desarrolla con microorganismos como Phanerochaete, Acinetobacter y Alcalígenes. El DDT y DDE (Dicloro-difenil-etano) se encuentran entre los insecticidas clorados, son demasiado persistentes y tienden a acumularse en diferentes cadenas alimentarias (Figura 7). Debe distinguirse el efecto agudo de la exposición crónica a bajas dosis en animales y humanos; si bien es frecuente encontrar casos de alergias en áreas urbanas limítrofes con campos fumigados, siendo el problema que se pueden absorber de forma cutánea por 35


piel, mucosa o tracto digestivo y pasar de allí al hígado, siendo metabolizados y pasando a formar parte de las células grasas; en algunas especies de aves causa problemas reproductivos (como adelgazamiento de la cáscara de huevo). Los insecticidas clorados desarrollados orgánicamente son de una estructura molecular similar a la de los hidrocarburos clorados, aunque se diferencian de estos últimos en que son estimulantes del sistema nervioso central. No hay que olvidar que algunos de estos insecticidas clorados se acumulan en la vida silvestre y de ahí pueden pasar al ser humano.

Figura 7: Estructura química del DDT y DDE. La mayoría de los hidrocarburos clorados de bajo peso molecular como el cloroformo, diclorometano (DCM), dicloroeteno (DCE) y tricloroetano (TCE) son disolventes útiles. Estos disolventes tienden a ser relativamente no polares, por lo que son inmiscibles con el agua y eficaces en aplicaciones de limpieza, tales como desengrasado y limpieza en seco. La exposición a altos niveles de clorometano puede causar problemas serios al sistema nervioso, incluso convulsiones y coma. También puede afectar al hígado, los riñones y el corazón. Esta sustancia se ha encontrado en por lo menos 172 de los 1,467 sitios de la Lista de Prioridades Nacionales identificados por la Agencia de Protección Ambiental (EPA) (A. ATSDR, 2008). Algunos de los síntomas por exposición a clorometanos incluyen dificultad para mantener el equilibrio, visión doble o borrosa, mareo, fatiga, cambios de personalidad, confusión, temblores, movimientos incoordinados, náusea o vómitos. Estos síntomas pueden durar meses o años. En condiciones de laboratorio los ratones machos que respiraron aire que contenía clorometano (1000000 ppb) durante 2 años desarrollaron tumores en los riñones, sin embargo los ratones hembras y ratas de ambos sexos no desarrollaron tumores. No se sabe si el clorometano puede producir esterilidad, abortos, defectos de nacimiento o cáncer en seres humanos. La EPA considera al clorometano como posiblemente carcinogénico en seres humanos (Grupo C) en base a evidencia limitada de carcinogenicidad en animales (A. ATSDR, 2008).

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Lección 8. Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de Compuestos nitroaromáticos (TNT y otros). Según Cazar & Lombeida (2011), los nitro-derivados (o nitrocompuestos o compuestos nitro) son compuestos que tienen el grupo nitro (–NO2) en su componente estructural, éste se encuentra presente en numerosos compuestos orgánicos. Son a menudo altamente explosivos, impurezas o una manipulación inapropiada pueden fácilmente desencadenar una descomposición exotérmica violenta. Los nitro-derivados en general se caracterizan por:  Poseer momentos dipolares elevados (altamente insoluble en agua): contienen un átomo de nitrógeno cargado positivamente y dos átomos de oxígeno cargados negativamente, la gran electronegatividad de los oxígenos hace que la mayor densidad electrónica se sitúe sobre los dos átomos de oxígeno.  Tienen puntos de ebullición anormalmente altos comparados con los valores de compuestos de peso molecular similar.  Son líquidos o sólidos a la temperatura ambiente.  En su mayoría son solubles en solventes orgánicos.

Los nitro-derivados se pueden organizar en dos grupos: los compuestos nitroaromáticos (nitrocompuestos aromáticos) y los nitroalifáticos (nitrocompuestos alifáticos), tienen pocos usos directos que no sean en la fabricación de explosivos o como disolventes (Cazar & Lombeida, 2011; Gomez Cruz, 2009). Los compuestos nitroaromáticos se emplean en la industria química para la fabricación de productos de consumo. Entre ellos se encuentran las espumas flexibles de poliuretano, fabricados a partir de 2,4– y 2,6–dinitrotoluenos (DNT) que se usan en la industria de colchones, ropa de cama, muebles, tintes y en bolsas de aire de automóviles; plaguicidas como el paratión (dietil–p– nitrofenilmonotiofosfato) y el dinoseb (2–sec–butil–4,6– dinitrofenol); explosivos convencionales como el TNT (2,4,6–trinitrotolueno) y el ácido pícrico (2,4,6–trinitrofenol), que se han empleado como cargas explosivas en proyectiles navales o altos explosivos sintéticos como la Goma–2; y los mono y dinitrofenoles, que se encuentran como subproductos de la síntesis de plásticos, barnices, colorantes, disolventes y fármacos (Luckenbach & Epel, 2005; Pérez–Reinado, 2005; M. D. D. Roldán, Pérez–Reinado, Castillo, & Moreno–Vivián, 2008). También se han utilizado como 37


propulsores de cohetes, aditivos de gasolina – aceites lubricantes (Chamberlain, 1976; Gomez Cruz, 2009). Algunos compuestos nitroaromáticos como los nitrofuranos son utilizados como agentes antimicrobianos (nitrofurazona, furazolidona y nitrofurantoína). Es intermediario para producir aminas, son básicos para la producción de los fármacos como el acetaminofén. Uno de los nitroaromáticos naturales es el antibiótico cloramfenicol (Cazar & Lombeida, 2011; Chamberlain, 1976; Gomez Cruz, 2009)(Figura 8).

Figura 8: Algunos compuestos nitroaromáticos naturales y sintéticos (xenobióticos) constituidos por un anillo bencénico como principal componente estructural. Muchos compuestos con grupo(s) nitro son tóxicos y/o mutagénicos, según revelan estudios en varios organismos, incluyendo bacterias, algas, plantas, invertebrados y mamíferos (Rieger & Knackmuss, 1995; Robidoux, Hawari, Thiboutot, Ampleman, & Sunahara, 1999; Schäfer & Achazi, 1999) por consiguiente, varios compuestos nitroaromáticos están incluidos como agentes contaminantes prioritarios, según la Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (Gomez Cruz, 2009) Los derivados aromáticos de la hidroxilamina pueden reaccionar con las biomoléculas, incluyendo el DNA, causando efectos tóxicos y mutagénicos. También, se ha propuesto 38


que los efectos genotóxicos están asociados a los derivados de la hidroxilamina (Gomez Cruz, 2009; Mastandrea et al., 2005). En mamíferos, los compuestos nitroaromáticos se transforman en metabolitos que son transformados por la microflora intestinal. La microflora intestinal a través de enzimas llamadas nitrorreductasas tienen un papel clave en el metabolismo de los productos nitroaromáticos exógenos a los cuales se expone el hospedador. Las nitrorreductasas pueden reducir la mutagenicidad generando compuestos inocuos (Aiub, Mazzei, Pinto, & Felzenszwalb, 2006; Gomez Cruz, 2009; Mittal, Brar, & Soni, 2008). En el caso de los dinitropirenos, los efectos tóxicos se pueden producir como resultado de la reacción de arilaminas con otras moléculas, como la oxihemoglobina (proteína de la sangre que ayuda al transporte de oxígeno). Ambas, tanto la arilamina como la oxihemoglobina, se oxidan en presencia del oxígeno, formando un ciclo redox para producir ferrihemoglobina e hidroxilamina, que puede reaccionar otra vez con la oxihemoglobina (H. Singh, Purnell, & Smith, 2007; Umbreit, 2007), causando su inactivación debido a la formación de puentes sulfonamidas (Gomez Cruz, 2009; L. Liu, Wagner, & Hanna, 2008). También se ha descrito la genotoxicidad y la carcinogenicidad potencial del TNT en seres humanos expuestos a este explosivo y se ha encontrado la formación de uniones de hemoglobina con amino– derivados del TNT (Jones, Liu, Sepai, Yan, & Sabbioni, 2005). El ataque del TNT a las proteínas puede causar efectos citotóxicos en el hígado (Y. Y. Liu, Lu, Stearns, & Chiu, 1992). Además, algunos compuestos nitroaromáticos actúan como desacoplantes de la fosforilación oxidativa, inhibiendo la síntesis de moléculas energéticas como ATP, como ocurre en el caso del 2,4–dinitrofenol y del ácido pícrico (Gomez Cruz, 2009; Hanstein & Hatefi, 1974). Se ha demostrado la transformación microbiana de los compuestos nitroaromáticos (Boopathy & Manning, 1996; Spain, Wyss, & Gibson, 1979). Aunque existen algunas bacterias que mineralizan ciertos compuestos nitroaromáticos (Blasco et al., 1999; Nishino, Spain, & He, 2000), como Desulfovibrio y Clostridium, en general las características recalcitrantes y tóxicas de estas sustancias plantean una amenaza para el ambiente y para la salud (Gomez Cruz, 2009; M. D. D. Roldán et al., 2008).

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Lección 9. Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de metales pesados. Se definen como “metales pesados” aquellos elementos químicos que presentan una densidad igual o superior a 5 g/cm3 cuando están en forma elemental, o cuyo número atómico es superior a 20 (excluyendo a los metales alcalinos y alcalinotérreos) (Vardanyan & Ingole, 2006). Su presencia en la corteza terrestre es inferior al 0.1% y casi siempre menor del 0.01%. Se pretende indicar con este término aquellos metales que, siendo elementos pesados, son “tóxicos” para la célula. Sin embargo en realidad cualquier elemento que a priori es beneficioso para la célula, en concentraciones excesivas puede llegar a ser tóxico (Navarro-Aviño, Aguilar Alonso, & López-Moya, 2007). Junto a ellos hay otros elementos que, aunque son metales ligeros o no metales, se suelen englobar con ellos por orígenes y comportamientos asociados; es este el caso de Arsénico (As), Boro (B), Bario (Ba) y Selenio (Se). Los metales pesados se clasifican en dos grupos: 1) Oligoelementos o micronutrientes: Necesarios en pequeñas cantidades para los organismos, pero tóxicos una vez pasado cierto umbral; incluyen As, B, Co, Cr, Cu, Mo, Mn, Ni, Se y Zn. 2) Sin función biológica conocida: Son altamente tóxicos, e incluyen Ba, Cd, Hg, Pb, Sb y Bi (Navarro-Aviño et al., 2007). Los elementos pertenecientes a estos dos grupos también varían según los diferentes autores. Además, cuando se habla de metales pesados tampoco se especifica el estado del elemento, es decir, si se trata del elemento puro, o de algunos o la totalidad de sus diversos estados de oxidación (compuestos), que no presentan las mismas propiedades físicas, químicas, tóxicas ni ecotóxicas. Este aspecto complica todavía más su clasificación. Por ejemplo, algunos compuestos de cromo hexavalente (Cr+6) son citados como carcinógenos humanos, pero prácticamente no se encuentra información sobre cánceres ocasionados por exposición a ese metal puro (Navarro-Aviño et al., 2007). La toxicidad está causada frecuentemente por la imposibilidad del organismo afectado para mantener los niveles necesarios de excreción. Estos elementos muestran una elevada tendencia a bioacumularse y a biomagnificarse a través de su paso por los distintos eslabones de las cadenas tróficas, debido a que los niveles de incorporación sufren un fuerte incremento a lo largo de sus sucesivos eslabones, siendo en los superiores donde se hallan los mayores niveles de contaminantes. A este proceso se le denomina biomagnificación; es decir, muchas toxinas que están diluidas en un medio, pueden alcanzar concentraciones dañinas dentro de las células, especialmente a través de la cadena trófica (Delgadillo-López, González-Ramírez, Priego-García, Villagómez-Ibarra, & Acevedo-Sandoval, 2011; Navarro-Aviño et al., 2007). En concentraciones elevadas, ocasionan graves problemas en el desarrollo, crecimiento y reproducción de los seres vivos (Delgadillo-López et al., 2011; Roy et al., 2005)

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La causa primaria del elevado nivel de toxicidad a nivel químico es que los metales pesados poseen una gran capacidad para unirse con moléculas orgánicas. En efecto, estos efectos tóxicos en sistemas biológicos dependen de reacciones con ligandos que son esenciales para su asimilación, y estos ligandos están, a su vez, presentes en gran abundancia en la célula, ya sea formando parte de moléculas de mayores dimensiones, ya sea como moléculas aisladas. En este sentido, cabe destacar la gran afinidad que muestran los metales pesados, como principales ligandos, por grupos sulfidrilo, radicales amino, fosfato, carboxilo e hidroxilo. El resultado de estas uniones ligando-metal puede ser muy perjudicial para la célula, destacándose por: (1) la acción genérica sobre proteínas por inhibición de la actividad o por rompimiento en la estructura de las mismas, (2) el desplazamiento de elementos esenciales de su metabolismo normal, produciendo deficiencias, y (3) la catálisis de reacciones de generación de moléculas ROS (Reactive Oxigen Species) o radicales libres que provocan fenómenos de estrés oxidativo (NavarroAviño et al., 2007) y que en la actualidad se suelen asociar a diferentes tipos de cáncer. Los valores límites o de tolerancia definida son en su mayoría adoptados de la reglamentación de otros países ya que faltan estudios específicos para cada metal, de tal manera que son muy variables y dependen del uso del suelo o del agua; así, son muy diferentes los niveles permisibles para consumo humano que para uso agrícola, industrial o de ecosistemas. Los límites permisibles para la identificación y remediación de suelos contaminados en la industria de hidrocarburos en Ecuador se resumen en el Cuadro 7. Cuadro 7: Límites permisibles de Cadmio, Niquel y Plomo en suelos de Ecuador. Parámetro

Unidad

Uso agrícola*

Uso industrial

Cadmio Niquel Plomo

mg/kg mg/kg mg/kg

<2 <50 <100

<10 <100 <500

Ecosistemas sostenibles <1 <40 <80

* Valores permisibles basados en protección de suelos y cultivos (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008). Mientras en el Cuadro 8 se encuentran los valores límites para la comunidad andaluza en España, en donde se incluyen mas metales y los valores límites suelen diferir. Cuadro 8: Resumen de los umbrales de contaminación para elementos traza en la comunidad andaluza. Los valores representan concentraciones totales y están expresados en mg/kg (Aguilar, Dorronsoro, Galán, & Gómez Ariza, 1999), citado por Galán Huertos & Romero Baena, (2008).

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Mientras que para fuentes líquidas para consumo humano, los límites son mas restringidos: Bario (0.1 mg/litro), Cadmio (0.005 mg/litro), Cromo (0,05 mg/litro), Plomo (0.05 mg/litro). Finalmente las enfermedades y síntomas que genera los niveles tóxicos son muy variados y debido al conjunto de reacciones químicas descritas hasta ahora, la toxicidad de los metales pesados se puede definir como elevada, tanto para microorganismos como para animales y plantas. Los metales pesados pasan del suelo a las plantas, y de ahí a los mamíferos. En humanos, en general, crean problemas en los tejidos reproductivos y en desarrollo (Navarro-Aviño et al., 2007). Entre los efectos conocidos tenemos (para los metales pesados que suponen un mayor problema): As: bronquitis; cáncer de esófago, laringe, pulmón y vejiga; hepatoxicidad; enfermedades vasculares; polineuritis. El efecto tóxico se produce al interaccionar con el ADN o con proteínas, alterando el metabolismo (Navarro-Aviño et al., 2007; Ordoñez, 2012). Cd: bronquitis; enfisema; nefrotoxicidad; infertilidad; cáncer de próstata; alteraciones neurológicas; hipertensión; enfermedades vasculares y óseas. En el ambiente, el cadmio es peligroso porque muchas plantas y algunos animales lo absorben eficazmente y lo concentran dentro de sus tejidos (Navarro-Aviño et al., 2007). Hg: alteraciones neurológicas y del sistema respiratorio. En realidad todas las formas de mercurio son potencialmente tóxicas, pero el vapor de mercurio la forma más peligrosa, dado que puede difundir a través de los pulmones hasta la sangre y luego hasta el cerebro, donde puede causar daños importantes (Navarro-Aviño et al., 2007). Pb: alteraciones neurológicas, nefrotoxicidad, anemia, cáncer de riñón. La anemia es el primer síntoma de envenenamiento crónico producido por el plomo en los animales (Navarro-Aviño et al., 2007). 42


Lección 10. Clasificación, composición, propiedades y toxicidad de compuestos organofosforados, cianuros, fenoles.

Figura 9: Estructura química del Malation (Ortiz-Hernández & Sánchez-Salinas, 2010). Los pesticidas organofosforados (OF) constituyen un grupo ampliamente usado, son compuestos muy heterogéneos que comparten una estructura química fosfórica derivada de ácidos. Actualmente hay 140 compuestos OF usados como pesticidas y como reguladores del crecimiento de planas alrededor del mundo. Estos compuestos son componentes de mas de 100 tipos diferentes de pesticidas comercialmente disponibles (tales como Paraoxon, Parathion, Caoumaphos y Diazinon, Figura 9), y ha sido estimado que cerca de 1500 diferentes OF han sido sintetizados durante el siglo pasado (Kang, Choi, & J., 2006; Ortiz-Hernández & Sánchez-Salinas, 2010). Muchos compuestos OF sintéticos son altamente tóxicos y son inhibidores poderosos de la acetilcolinesterasa, una enzima vital envuelta en la neurotransmisión, en forma de sustitutos de acetilcolina (Bakry, El-Rashidy, Eldefrawi, & Eldefrawi, 2006; Grimsley, Rastogi, & Wild, 1998). Los organofosfatos pueden también causar efectos neurotóxicos demorados, los cuales no son debidos a la inhibición de la acetilcolinesterasa. La función de otras esterasas encontradas en animales no es aún bien entendida. En la presencia de OF, estas enzimas son fosforiladas e inactivadas. Una vez el 80% de la enzima es inactivada, usualmente dentro de cuatro días después de la exposición, los síntomas potencialmente letales pueden ser observados, incluyendo debilidad de los músculos del cuello, diarrea y dificultad respiratoria (Ortiz-Hernández & Sánchez-Salinas, 2010). Para la bioremediación de organofosforados se usa Agrobacterium radiobacter Por su parte el cianuro es un término general que se aplica a un grupo de sustancias químicas que contienen carbono y nitrógeno, con una conformación R-CΞN, donde R es el grupo radical que se puede sustituir y CΞN es el grupo Ciano. Los compuestos de cianuro contienen sustancias químicas (de origen humano) que se encuentran presentes en la naturaleza o que han sido producidas por el hombre. Existen más de 2,000 fuentes naturales de cianuro, entre ellos, distintas especies de artrópodos, insectos, bacterias, algas, hongos y plantas superiores como la yuca y el sorgo. Las principales formas de cianuro producidas por el hombre son el cianuro de hidrógeno gaseoso y el cianuro sólido 43


de sodio y de potasio. Debido a sus propiedades únicas, el cianuro se utiliza en la fabricación de partes metálicas y en numerosos productos orgánicos comunes como los plásticos, las telas sintéticas, los fertilizantes, los herbicidas, los tintes y algunos productos farmacéuticos (Logsdon, Hagelstein, & Mudder, 2001). Son sustancias muy reactivas y participan en las reacciones de adición nucleofílica, pueden ser sólidos, líquidos o gaseosos y su punto de ebullición es mayor que el de los alcoholes. No obstante a pesar de su abundancia en muchas plantas y animales, el cianuro es una sustancia "potencialmente" letal en la medida en que se use sin tomar precauciones necesarias. Actúa a través de la inhibición de ciertas células, bloqueando el proceso de respiración celular. Ello podría conllevar a posibles problemas en el corazón o en el cerebro producto de la falta de oxigenación en el organismo. El envenenamiento por cianuro, dependerá de la cantidad a la que haya estado expuesta una persona, la forma de exposición y la duración de la misma. Dependiendo de ella se presenta síntomas como: respiración rápida, dolor de cabeza, náuseas, convulsiones, presión sanguínea baja, pérdida de la conciencia entre otros. Los cianuros son relativamente móviles en el suelo. Una vez en el suelo, el cianuro puede ser removido a través de varios procesos. Algunos compuestos de cianuro en el suelo pueden formar cianuro de hidrógeno y evaporarse, mientras que otros serán transformados a otras sustancias químicas por los microorganismos en el suelo. Consecuentemente, los cianuros generalmente no se filtran hacia el agua subterránea. Sin embargo, se ha detectado cianuro en aguas subterráneas de unos pocos vertederos y en sitios para disposición de residuos industriales. Las concentraciones altas de cianuro que se encuentran en algunos filtrados de vertederos y en la basura que se almacena en algunos sitios son tóxicas para los microorganismos del suelo. Debido a que estos microorganismos ya no pueden transformar el cianuro a otras formas químicas, el cianuro puede pasar a través del suelo hacia el agua subterránea. Por su parte los fenoles (Figura 10) son un grupo de compuestos orgánicos que presentan en su estructura un grupo funcional hidroxilo unido a un radical arilo. Por lo tanto, la fórmula general para un fenol se escribe como Ar – OH. Los fenoles se nombran, generalmente, como derivados del miembro más sencillo de la familia que es el fenol o hidroxibenceno. Para algunos fenoles, suelen emplearse nombres comunes como cresoles (metilfenoles), catecol (o-dihidroxibenceno), resorcinol (mdihidroxibenceno) y e hidroquinona (p-dihidroxibenceno).

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Figura 10: Grupo fenol y algunos derivados (Garric, 1979). Los fenoles sencillos son líquidos o sólidos, de olor característico, poco hidrosolubles y muy solubles en solventes orgánicos. Algunos se usan como desinfectantes, pero son tóxicos e irritantes (Garric, 1979). Debido a su mayor acidez, los fenoles reaccionan con bases fuertes como el hidróxido de sodio formando fenóxidos. Siendo un aromático, el fenol se comporta como tal de acuerdo al mecanismo de sustitución electrofílica. Las quinonas son los productos de oxidación de ciertos difenoles, preparadas utilizando agentes oxidantes suaves como cloruro férrico, óxido de plata o incluso aire. Algunos compuestos biológicos que intervienen en etapas importantes de los procesos biológicos de oxidación – reducción contienen un sistema quinoide. Un ejemplo importante es la ubiquinona o Coenzima Q o CoQ, que interviene en una de las etapas de la cadena de transporte electrónico, donde se realiza la producción celular de ATP. En la vitamina K2, uno de los factores de coagulación sanguínea también aparece un rasgo estructural quinoide (Garric, 1979). Algunos fenoles importantes son (Garric, 1979): El fenol es un sólido cristalino, incoloro, ligeramente soluble en agua y de olor característico. Poderoso germicida al igual que sus derivados. Se absorbe a través de la piel. Es tóxico y cáustico. Los cresoles son menos tóxicos que el fenol y de propiedades farmacológicas idénticas a las del fenol. El resorcinol es un bactericida y fungicida. Localmente, precipita las proteínas. En su acción general, se parece al fenol con mayor excitación central. El hexilresorcinol es un antiséptico, inodoro y no mancha. Es irritante a los tejidos. La hidroquinona se usa para aclarar la tez en áreas de la piel oscurecida (pecas y lunares). Conviene ensayar la sensibilidad del paciente antes de iniciar el tratamiento para descartar reacción alérgica. El p-clorofenol tiene propiedades y usos similares a las del fenol. Es un antiséptico mas poderoso que el fenol, pero sus acciones cáusticas y tóxicas son también mayores. El hexaclorofeno es un bis-fenol policlorado. Es un eficaz bactericida y se ha empleado en forma diluida en la fabricación de jabones antisépticos y desodorantes. Es tóxico por vía bucal y tópica. 45


CAPÍTULO 3. PROCESOS QUE INTERVIENEN EN LA BIOREMEDIACIÓN. Son variados los procesos que intervienen en la bioremediación y los organismos de los que más se conoce son las bacterias ya que es la tecnología de bioremediación mas difundida. Menos información es conocida acerca de los procesos relacionados con hongos, algas y plantas, por lo tanto serán vistos en menor detalle dentro de cada apartado. Estos procesos se relacionan con diversos aspectos de los organismos, de los contaminantes y del entorno, para que la biota pueda realizar la bioremediación, tales como la expresión enzimática que hace que los contaminantes sean más disponibles para ser degradados, o hacer mas biodisponible los contaminantes, la aclimatación ante las altas concentraciones de éstos, la detoxificación, la biodegradabilidad de los contaminantes y la sorción o retención por parte del suelo. Lección 11. Interacciones microbianas. La ecología es un campo que está adquiriendo importancia debido a que estamos sintiendo los efectos y estamos padeciendo las consecuencias de no cuidar el medio ambiente. La ecología abarca muchos aspectos tanto visibles como invisibles; invisible es todo aspecto que no podemos ver a simple vista pero podemos saber que existe por sus resultados, como sucede con los aspectos microbiológicos del suelo, los cuales no podemos observar pero si podemos a largo plazo observar su efecto. Toma en cuenta aspectos bióticos y abióticos y las relaciones existentes entre ellos, para comprender el funcionamiento de todo sistema y de esta manera poder aplicar este conocimiento para cumplir con los objetivos de bioremediación deseados. El éxito de cualquier tratamiento de bioremediación depende no solo de factores abióticos como el pH, temperatura, potencial de reducción y la disponibilidad de agua y nutrientes, sino también de factores bióticos tales como la competencia microbiana, amensalismo, parasitismo y depredación que pueden limitar el crecimiento y desarrollo de las poblaciones inoculadas. Comenzando con las interacciones organismo-ambiente, son importantes de tener en cuenta algunos factores del entorno, en especial cuando los tratamientos se realizan en el sitio de contaminación “in-situ”.  Abundancia de hidrocarburos biodegradables (lineales de cadena sencilla) y escasa presencia de resinas y asfaltenos muy pesados en la mezcla.  Concentraciones bajas de contaminantes, que no sean tóxicas o inhibitorias para el crecimiento de los bioremediadores. 46


 Adecuada oxigenación, la mayoría de los bioremediadores requieren oxígeno para funcionar adecuadamente, los organismos que trabajan sin oxígeno son menos eficientes.  pH entre 6 y 8, por arriba o debajo de estos límites principalmente los microorganismos crecen menos o son menos eficientes, así mismo la producción de enzimas en muchas ocasiones requieren un pH específico del medio para poderse producir.  Temperaturas superiores a 15oC e inferiores a 40oC, aunque se ha dado biodegradación a temperaturas muy bajas (zonas articas) y muy altas (compostaje), la velocidad del proceso se ve severamente reducida.  Porosidad media para permitir la circulación de agua y oxígeno.  Elevada permeabilidad del suelo para permitir la reducción de altas concentraciones de contaminantes y la circulación de aire.  Mineralogía uniforme, suelos arcillosos o arenosos afectan la eficiencia del proceso, debido a la inmovilización de nutrientes esenciales para que los microorganismos realicen la biodegradación o al lavado de estos elementos. Son preferibles suelos francos o arcillosos y homogeneidad mineralógica.  Homogeneidad hidrogeológica, esto nos permite saber cual va a ser el proceso de irrigación adecuado para el crecimiento de los organismos. Debemos combinar el enfoque tradicional proveniente del campo de la ingeniería (que toma en cuenta solo aspectos ambientales como los mencionados anteriormente) con un planteamiento más ecológico, que reconozca desde el comienzo que la naturaleza es heterogénea y que se apoye en los principios que rigen el comportamiento de poblaciones biológicas naturales (la ecología microbiana ha experimentado avances espectaculares en los últimos años). De esta manera, el campo de la biorremediación sufriría un cambio drástico pero, a su vez, muy beneficioso, pues supondría un avance de gran magnitud en el conocimiento de los procesos de degradación de contaminantes y su aplicación con fines ambientales. Las interacciones bióticas son un factor clave en todo proceso biológico y en la biodegradación por involucrar organismos vivos, deben ser abordadas para entender y poder manejar este proceso. Las interacciones se refieren al efecto conjunto de dos o más organismos para suplir una función que cada organismo por separado no podría cumplir o sería menos eficiente; esto incluye relaciones simbióticas, quimitacticas y de cometabolismo, tanto entre microorganismos así como también entre microorganismos y plantas. La biodegradación de componentes orgánicos es catalizada por enzimas, las enzimas son generalmente específicas para cada sustancia a degradar y es por ello, que para una mezcla compleja de compuestos, como son el petróleo ó sus derivados, o para una contaminación de minería, será necesaria una gran variedad de enzimas para biodegradar totalmente los componentes orgánicos y/o disponer de los metales pesados. De esta forma, la biodegradación de un compuesto es típicamente un proceso gradual, 47


que implica la participación de varias especies de organismos, generalmente organizados en asociaciones, consorcios ó cohortes, antes de que muchos compuestos recalcitrantes puedan se mineralizados (Pellini, 2006). La quimiotaxis es la habilidad que tienen algunos microorganismos, incluidas bacterias y hongos, para detectar y responder a compuestos producidos por otros organismos. Este fenómeno puede intervenir o tener importancia a muchos niveles diferentes, como puede ser a nivel fisiológico, supervivencia o incluso intervenir a nivel poblacional. Por ejemplo la quimiotaxis interviene en la formación de nódulos en las raíces de legumbres por especies de Rhizobium, Agrobacteruim etc... Estas plantas producen exudantes que contienen moléculas que pueden actuar como señales quimio-atrayentes y que son capaces de inducir la expresión en estas bacterias de genes relacionados con la formación de estas asociaciones. También se presenta entre muchas plantas y hongos de micorriza (con función simbiótica) y entre plantas y microorganismos edáficos. Las raíces de las plantas segregan una gran cantidad de sustancias las cuales estimulan la interacción entre hongos de micorriza arbuscular y la raíces, simultáneamente promueven el crecimiento de bacterias y hongos (principalmente benéficos para la planta) a su alrededor, creando una zona con mayor densidad de organismos que el resto del suelo, llamada rizósfera. Debido a la abundancia de organismos y su diversidad en la rizósfera es más factible encontrar organismos con potencial biodegradador en esta zona; de hecho es muy frecuente este tipo de interacciones para procesos de bioremediación de hidrocarburos. Mientras la relación simbiótica micorrícica es una característica que ha permitido y/o potenciado el tratamiento de la contaminación con metales pesados, gracias a que aumenta la tolerancia de las plantas a estos metales en sus tejidos o participan en su retención en los tejidos del hongo.

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Lección 12. Adaptacion, aclimatación y bioacumulación. Todos los organismos vivientes son diferentes y son estas diferencias las que los hacen tan valiosos. Algunas de esas grandes diferencias se encuentran entre grandes grupos, como son organismos microscópicos (observables solo por microscopio y estereoscopio) y macroscópicos (observables a simple vista), en donde los primeros tienen ciclos de vida cortos y los segundos son relativamente largos. Poniendo un ejemplo las bacterias pueden duplicarse al cabo de cerca de una hora, de tal manera que en un dia se tienen 24 generaciones, en una semana 168, en un año 8760 generaciones y en cada generación existe la posibilidad de mutaciones genéticas, logrando una tasa de mutación muy alta con respecto a otros organismos. Por otro lado, las plantas solo alcanzan a dejar una generación, aproximadamente a los tres meses si son de ciclo reproductivo corto, logrando solo 4 posibles generaciones al año. En este punto se encuentran dos conceptos claves, el primero es adaptación y consiste en el ajuste de una población durante generaciones a cambios medioambientales asociados (al menos en parte) a los cambios genéticos que resultan de la selección impuesta por el propio cambio ambiental (Figura 11). De esta manera los microorganismos (bacterias, hongos, actinomicetes) son los que logran una mejor adaptación a las condiciones del entorno en menor tiempo y es el motivo por el cual es muy probable encontrar microorganismos con capacidad de degradar compuestos tóxicos, una vez son expuestos a estas condiciones, como pueden ser los repentinos derrames de crudo, explotaciones mineras y exposición a desechos tóxicos en suelos y aguas.

Figura 11: Adaptación y evolución en el humano. Es importante aclarar que los microorganismos que no tengan la dotación genética para degradar los agentes contaminantes no lo van a hacer al exponerse a éstos, solo los que tengan el potencial lo van a hacer; no van a adquirir esta capacidad por exponerse a los contaminantes, pero tampoco indica que van a morir al no poderlo descomponer o degradar. Es posible que sobrevivan al poder utilizar otras fuentes de alimento directamente disponibles, o fuentes que se vuelvan disponibles al haber una degradación parcial del contaminante principal, en un mecanismo de cometabolismo como fue explicado anteriormente. 49


Este es uno de los principios en los que se basa una de las técnicas empleadas para obtener aislamientos microbianos aptos para la bioremediación. A partir de muestras de material contaminado se hacen aislamientos de organismos, con la esperanza de que algunos de estos tengan la capacidad de degradar el contaminante en estudio y posteriormente poder potencial su capacidad con miras a utilizarse industrialmente cuando existan vertimientos similares a donde fue aislado. Sin embargo el concepto de adaptación no debe confundirse con el de aclimatación (FAO, 2004). El segundo concepto es aclimatación, la cual es la adaptación de un organismo vivo (planta, animal o microorganismo) a un cambio medioambiental que le somete a un estrés fisiológico, y aunque tiene que ver con la dotación genética de los organismos, la aclimatación no tiene que ver con los cambios generacionales (FAO, 2004). Este concepto se aplica principalmente a organismos macroscópicos, y haciendo alusión a la bioremediación, se refiere a aquellos organismos que son expuestos lentamente a un contaminante, cuya concentración incrementa paulatinamente, como suele suceder en explotaciones mineras. Principalmente las plantas, no tienen la opción de migrar a nuevas locaciones evitando los contaminantes, de forma que solo les queda la opción de aclimatarse o intoxicarse por la alta concentración de los contaminantes. Pero la aclimatación es un proceso gradual, en el cual los organismos primero son expuestos a bajas concentraciones, las cuales se incrementan por la acumulación en el sustrato (suelo o medio de cultivo) y poco a poco va siendo mayor; los organismos que sobrevivan se dice que están aclimatados a las condiciones del entorno, incluidos los contaminantes. En fitoremediación (remediación con plantas), la tolerancia a altas concentraciones de contaminantes, sin una intoxicación notoria, es un indicativo de aclimatación y de un posible mecanismo de tolerancia, muy probablemente conducente a un mecanismo de bioremediación. Esta aclimatación usa la dotación genética existente en las plantas, para tomar los contaminantes y disponer de ellos, bien sea incorporarlos en su metabolismo, excluyéndolos de éste, detoxificandolos o englobándolos de forma que no causen alguna alteración fisiológica. Finalmente, no todos los mecanismos de tolerancia conducen a la desintegración de los contaminantes en materiales mas simples sin efecto tóxico, algunos de estos simplemente son acumulados en los organismos, produciendo diferentes síntomas dependiendo del tipo y concentración del contaminante y del organismo en cuestión que acumula estos elementos. Muchos derivados del petróleo y metales pesados como cadmio, plomo y mercurio se pueden acumular en los tejidos grasos de los animales, en vacuolas y paredes celulares de plantas, en un proceso conocido como bioacumulación, sin efectos notorios a menos que sobrepasen los límites tolerables; sin embargo las concentraciones de estos 50


contaminantes pueden fácilmente aumentar en los niveles superiores de la cadena alimenticia (Figura 12).

Figura 12: Niveles crecientes de acumulación de xenobióticos como DDT en tejidos animales. Algunos ejemplos de bioacumulación se presentan con uranio por la bacteria Pseudomonas aeruginosa, el cual fue detectado íntegramente en el citoplasma, al igual que en la levadura Saccaromyces cerevisiae. Algunas levaduras son capaces de acumular importantes concentraciones de metales empleando sistemas de transporte activo. En Colombia se han observado algunos problemas ambientales, debido al exceso de xenobióticos o algunos problemas de bioacumulación progresiva de estos en cuerpos de agua. Las repercusiones son notirias debido a la mortandad de peces, hecho que afecta notablemente a las poblaciones costeras y que son debidas a vertimientos de contaminantes xenobióticos en los cuerpos de agua, la absorción y acumulación de estos en el plancton y la posterior incorporación e incremento de su concentración en peces.

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Lección 13. Biodisponibilidad y detoxificación. La biodisponibilidad es un factor del entorno relacionado con la disponibilidad del contaminante para ser accedido por los organismos que van a descomponerlo. La toxicidad y biodisponibilidad de los productos de la degradación no siempre se conocen y pueden movilizarse o bioacumularse en animales (Agudelo Betancur et al., 2005). Dos características microbianas pueden aumentar esta biodisponibilidad y podrían ser utilizadas en tecnicas de biorremediación. Los hidrocarburos son moléculas hidrofóbicas que forman micelas entre ellas y son altamente insolubles en agua. Esto hace que la superficie de contacto que tienen los microorganismos diminuya en gran medida, por lo tanto reduce la biodisponibilidad del sustrato. Para que ocurra la degradación de hidrocarburos es necesario que estos entren en contacto directo con la membrana celular de los microorganismos para que el xenobiótico sea interiorizado y puedan actuar las enzimas oxigenasas (las primeras que actúan en el proceso de bioremediación). Para que los hidrocarburos sean más disponibles se requiere de surfactantes que hagan ese papel. Algunos microorganismos pueden producir algunos de éstos de forma natural y estos biosurfactantes se pueden clasificar en dos grupos  De bajo peso molecular: suelen ser glicolípidos (azúcar + lípido). El mas estudiado es el rhamnolipido producido por diversas especies de Pseudomonas. La función principal de estos biosurfactantes es reducir las tensiones entre las fases (aguaroca por ejemplo). Las Pseudomonas son bacterias productoras de este tipo de biosurfactantes. Algunos microorganismos productores de biosurfactantes extracelulares solubilizan y facilitan la penetración de los hidrocarburos a través de la pared celular hidrofílica; contienen además enzimas degradadoras de hidrocarburos en la membrana citoplasmática (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009).  De alto peso molecular: Son producidos por diferentes especies y suelen ser polisacáridos, proteínas, lipoproteínas, lipopolisacáridos o mezclas de estos polímeros. Estos biosurfactantes no son tan eficaces reduciendo tensiones entrefases, pero si son buenos emulsionantes. Además se ha demostrado que son eficaces a bajas concentraciones y tienen una considerable afinidad por el sustrato; entre estos se encuentra el Alasan, producido por Acinetobacter radioresistens. Las funciones de estos biosurfactantes a la hora de aumentar la biodisponibilidad serían:  Dispersar el petróleo aumentando la superficie de contacto.  Aumentar la biodisponibilidad de compuestos hidrofóbicos.  Son selectivos. 52


 Brindan mayor eficiencia para aumentar la biodisponibilidad de compuestos hidrofóbicos.  Son menos estables, por lo tanto más biodegradables. La detoxificación por su parte es el proceso mediante el cual una sustancia se transforma de tóxica a no tóxica; los metales no se pueden descomponer en sustancias más sencillas por no ser biodegradables, sin embargo lo que hacen las plantas y algunos microorganismos es convertir los metales en forma tóxica mediante oxidación o reducción a su forma no tóxica. Dentro de las biotecnologías modernas es común escuchar de detoxificación de metales pesados por parte de las plantas. La detoxificación es observable en bacterias sulfatorreductoras o sulfooxidantes mediante la precipitación reductora usando enzimas. Muchos de los organismos utilizan los metales como aceptores de electrones en su respiración anaerobia (sin oxígeno), acoplando su reducción con la oxidación de compuestos orgánicos (reducción disimilatoria). Las formas oxidadas más solubles se reducen a formas menos solubles y a su vez menos bioactivas, las cuales luego se excretan al exterior de la célula dando como resultado la detoxificación y/o precipitación del contaminante. Se ha comprobado con uranio (U), cromo (Cr), vanadio (V), selenio (Se), molibdeno (Mo), cobre (Cu), oro (Au), mercurio (Hg), plata (Ag) y tecnecio (Tc). Los mecanismos de tolerancia en plantas varían entre las especies y están determinados por el tipo de metal, eficiencia de absorción, traslocación y secuestro. Las fases del proceso por el cual las plantas incorporan y acumulan metales pesados son las siguientes (Delgadillo-López et al., 2011): Fase I. Transporte de los metales pesados al interior de la planta y, después, al interior de la célula. La raíz constituye el tejido de entrada principal de los metales, los cuales llegan por difusión en el medio, mediante flujo masivo o por intercambio catiónico. La raíz posee cargas negativas en sus células, debido a la presencia de grupos carboxilo, que interaccionan con las positivas de los metales pesados, creando un equilibrio dinámico que facilita la entrada hacia el interior celular, ya sea por vía apoplástica o simplástica (Navarro-Aviño et al., 2007). Fase II. Una vez dentro de la planta, las especies metálicas son secuestradas o acomplejadas mediante la unión a ligandos específicos (Figura 13). Entre los quelantes producidos por las plantas se encuentran los ácidos orgánicos (ácidos cítrico, oxálico y málico), algunos aminoácidos (histidina y cisteína) y dos clases de péptidos: fitoquelatinas y metalotioneínas. Las fitoquelatinas son ligandos de alta afinidad que tienen como sustrato al glutatión (Navarro-Aviño et al., 2007).

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Las metalotioneinas son polipéptidos de unos 70-75 aminoácidos con un alto contenido en cisteína, aminoácido capaz de formar complejos con cationes mediante el grupo sulfidrilo y tienen una marcada afinidad por las formas iónicas de Zn, Cd, Hg y Cu (Navarro-Aviño et al., 2007).

Figura 13: Interacción de los metales pesados con las células de plantas (Navarro-Aviño et al., 2007). Fase III. Corresponde a la compartimentalización y detoxificación, proceso por el cual, el complejo ligando-metal queda retenido en la vacuola (Navarro-Aviño et al., 2007). Uno de los aspectos más importantes de la acumulación de metales pesados es el que se refiere al proceso de complejación. Un complejo o compuesto de coordinación es el resultado de la interacción de un átomo central, esto es, un ion metálico con orbitales de valencia vacíos que puede actuar como aceptor de electrones, y una o varias bases dadoras de electrones con pares de electrones libres. La planta utiliza este mecanismo de complejación en el interior de la célula para detoxificar (amortiguar) los metales pesados, uniendo a ellos ligandos para formar complejos (Navarro-Aviño et al., 2007). En plantas también se puede encontrar que incrementan la polaridad de los xenobióticos, lo cual aumenta su difusibilidad y por tanto puede incrementar su velocidad de excreción. Además, muchas sustancias tóxicas que ven incrementada su polaridad se convierten en sustratos accesibles para posteriores reacciones de detoxificación, reacciones que, por otra parte, no serían posibles de no incrementar la polaridad (Navarro-Aviño et al., 2007).

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Lección 14. Biodegradabilidad. La biodegradabilidad ha sido definida como la capacidad intrínseca de una sustancia a ser transformada en una estructura química más simple por vía microbiana. En el mismo sentido una sustancia es biodegradable cuando puede ser descompuesta con cierta rapidez por organismos vivientes (bacterias, hongos, gusanos e insectos), de los cuales los más importantes bacterias aerobias. Lo contrario corresponde a sustancias no biodegradables, como plásticos, latas, vidrios que no se descomponen o desintegran, o lo hacen muy lentamente. Algunos órganoclorados, los metales pesados, algunas sales, los detergentes de cadenas ramificadas y ciertas estructuras plásticas no son biodegradables. Sin embargo el que una sustancia pueda ser degradada o descompuesta no implica que es biodegradable, ya que los procesos químicos y físicos del ambiente pueden producir degradación de ciertas sustancias, sin que intervengan organismos vivos. Muchos productos artificiales son biodegradables, pero otros (insecticidas organoclorados y detergentes "duros") son muy resistentes a la acción bacteriana, mientras el vidrio y las latas no son biodegradables según el límite de tiempo que impone el concepto de biodegradabilidad, generalmente de menos de 20 meses. Cada material contaminante tiene sus propios tiempos de degradación, entre ellos encontramos los vasos plásticos de polipropileno, el vidrio y el icopor (100 años), los envases tetra-pack depende de sus componentes, el alunimio dura (30 años), las bolsas de plástico (150 años), el papel (1 año), los pitillos y tapones plásticos (mas de 100 años), las tapas de botellas (30 años) y los jabones (161 días) (Biodegradabilidad y contaminación.pdf). Entre los derivados del petróleo las fracciones de alcanos (incluidos los alcanos normales y ramificados) tienen una biodegradabilidad alta; los compuestos aromáticos e hidrocarburos policiclicos aromáticos (de mayor importancia debido a su toxicidad y tendencia a bioacumulación) tienen una biodegradabilidad media; mientras la fracción polar, que son las resinas (piridinas, quinolinas, carbazoles, sulfóxidos y amidas) y asfaltenos (fenoles, ácidos grasos, cetonas, esteres y porfirinas) son de muy baja biodegradabilidad (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008). De las distintas familias de hidrocarburos del petróleo, los n-alcanos y los alcanos ramificados (isoprenoides) de cadena intermedia (10 a 20 carbonos) son los sustratos más fácilmente degradables por los microorganismos del suelo, y que por lo tanto tienden a ser eficazmente biodegradados. Sin embargo, los alcanos de cadena larga (> 20 carbonos) son más difíciles de degradar debido a su (elevado peso molecular) y su baja solubilidad en agua. Los cicloalcanos, por norma general, se degradan más lentamente que los nalcanos y alcanos ramificados. De igual forma, los HAPs que contienen de 2 a 3 anillos aromáticos pueden ser biodegradados eficazmente en el suelo en condiciones ambientales óptimas, mientras que los HAP de 4 anillos, y especialmente, los de 5 o más anillos bencénicos presentan una mayor recalcitrancia inherente y una baja solubilidad. 55


Las fracciones de resinas y asfaltenos son las que presentan una menor degradabilidad debido a las complejas estructuras químicas y al elevado peso molecular de sus moléculas (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). El crecimiento de los microorganismos degradadores depende de varios factores como la presencia de nutrientes suficientes, la disponibilidad de humedad, oxígeno, temperatura y pH idóneos. Por su parte, la biodegradabilidad también depende de la complejidad compuesto a degradar y del microorganismo utilizado. No existen organismos especializados para cada tipo de sustancias (Morán y Morán & Espinosa Marván, 2008) La biodegradación se puede presentar tanto en condiciones aerobias (bacterias, hongos, algas y plantas superiores) como anaerobias (bacterias): Biodegradación aerobia: en presencia de oxígeno suficiente y otros nutrientes elementales, los organismos degradan los contaminantes orgánicos hasta convertirlos finalmente en dióxido de carbono (CO2), agua (H2O) y nueva biomasa celular. En la Bioestimulación es común la inyección del agua junto con los nutrientes y oxígeno disuelto, que favorezca el proceso. En algunas ocasiones y para microorganismos concretos se puede añadir peróxido de hidrógeno disuelto, que dará lugar al oxígeno para que éste actúe como aceptor final de electrones. Biodegradación anaerobia: en ausencia de oxígeno (condiciones anaerobias), los contaminantes orgánicos son metabolizados hasta metano (CH4) y cantidades limitadas de dióxido de carbono (CO2) e hidrógeno molecular (H2). Bajo condiciones sulfato-reductoras, el sulfato es transformado a iún sulfuro o azufre elemental; y bajo condiciones nitratoreductoras se genera como producto final nitrógeno molecular (N2). A menudo, los contaminantes son degradados a compuestos intermedios o finales que son más tóxicos que el contaminante inicial. Por ejemplo, la biodegradación anaerobia del 1,1,1tricloroetano, más conocido como TCE, generará cloruro de vinilo, el cual es más tóxico y persistente. Este Compuesto Orgánico Volatil (COV) puede ser degradado si se crean condiciones aerobias. El CO2 y CH4 son considerados como los indicadores de cantidad de sustrato utilizado por los microorganismos, en procesos de biodegradación y es la base para los estándares ASTM, ISO, EN y OECD para medir la biodegradabilidad de las sustancias químicas. Técnicas como la Respirometría se basa en la medición del consumo de oxígeno por parte de microorganismos que trabajan sobre un sustrato orgánico, el cual es degradado y oxidado a CO2. Los análisis respirométricos permiten adquirir datos sobre el consumo de oxígeno en respuesta al metabolismo de un sustrato por la respiración de microorganismos tanto en condiciones aeróbias como anaerobias. La Respirometría ahorra tiempo y trabajo requeridos con los experimentos de agotamiento de substratos y 56


provee puntos de referencia de alta calidad para la valoración de parámetros biocinéticos (Morán y Morán & Espinosa Marván, 2008). La técnica de agotamiento de sustratos mas conocidas es el DBO5 o demanda bioquímica de oxígeno, es una prueba empírica que se utiliza para determinar los requerimientos relativos de O2 de las aguas. Mide el O2 utilizado durante un periodo de incubación especificado (5 días) para la degradación bioquímica de materia orgánica y de forma menos importante el gastado en la oxidación de los compuestos inorgánicos como sulfuros, ión ferroso, etc, y también el utilizado para oxidar compuestos reductores de N 2, a no ser que se adicione un inhibidor. La técnica se refiere a la determinación de la degradación de sustancias principalmente orgánicas por microorganismos. Para llevar a cabo esta degradación, las bacterias toman oxígeno del medio y liberan CO2 (Morán y Morán & Espinosa Marván, 2008). Finalmente, para la evaluación de la biodegradabilidad se han diseñado una serie de pruebas, las cuales buscan cuantificar el grado de persistencia de estructuras químicas en ambientes naturales o industriales, los cuales aparecen en el Cuadro 9. Cuadro 9: Estándares de referencia para medir la biodegradabilidad en USA y Europa.

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Lección 15. Sorción y biosorción. Sorción es un término general utilizado para describir la asociación de compuestos químicos en forma disuelta o gaseosa con el suelo, “sin referirse a un mecanismo específico”. Aunque se produce por una serie de fenómenos como son: la adsorción con la materia particulada del suelo, absorción a la materia orgánica del suelo, a la baja difusividad de los compuestos, principalmente desde los microporos; a la disolución en fases líquidas no acuosas (FLNAs), y a la formación de uniones covalentes con la materia orgánica e inorgánica del suelo (Alexander, 1994). Esta asociación puede ser adsorción en una matriz de dos dimensiones o absorción en una matriz de tres dimensiones. Este proceso de transferencia de fases puede darse entre una fase sólida y moléculas de vapor o bién entre una fase sólida y moléculas en forma disuelta y es un fenómeno propio de la transferencia de masas, que condiciona la biodisponibilidad de los contaminantes (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). La sorción es uno de los mecanismos mediante los cuales en el proceso de atenuación natural, se puede reducir el riesgo potencial los contaminantes, reduciendo su movilidad y biodisponibilidad de los componentes uniéndolos al suelo o a la roca madre. Metales o no metales pueden ser atenuados mediante adsorción, precipitación, absorción a la matriz del suelo o partición con la materia orgánica. Sin embargo la atenuación no es completa, para remediar los daños por contaminantes, solo contribuye en el proceso de atenuación natural, es necesario estudiar su complementariedad con procesos como dilución, dispersión a las aguas y las propiedades químicas de los suelos (Mateu, 2008; Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). Pero la sorción no elimina los contaminantes, solo son retenidos en el suelo y pueden constituir un problema en los tratamientos biológicos. Con la finalidad de aumentar la biodisponibilidad de los contaminantes para realizar una bioremediación existen ejemplos en la bibliografía de la utilización de tensoactivos sintéticos y biotensoactivos en la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). La sorción no solo se presenta con contaminantes como hidrocarburos, es un fenómeno natural de los suelos que en la ingeniería ambiental se conoce solo por la bioremediación, en la sorción se incluye el proceso de inmovilización de nutrientes por parte del suelo, en particular en fósforo, el cual suele ser agregado en los procesos de bioestimulación para incrementar los niveles de nutrientes y que los microorganismos realicen sus procesos. La mayor parte del fósforo agregado en forma mineral es inmovilizado en el suelo al acomplejarse con los iones aluminio y hierro, abundantes en los suelos ácidos de la región tropical, donde Colombia se encuentra ubicada. Al quedar inmovilizado no está disponible ni para plantas ni microorganismos, reduciendo rápidamente los niveles de este nutriente 58


y con éste, la eficiencia de los sistemas; debido a lo anterior los niveles de fósforo al realizar la bioestimulación deben ser elevados. Por otra parte, la biosorción o bioadsorción es la acumulación o atrapamiento pasivo y no específica de algunas sustancias especialmente metales tóxicos en las estructuras externas de las células por material biológico (vivo o muerto). Este proceso es independiente del metabolismo celular (Garza González, 2005; Wase & Forster, 1997). Es uno de los enfoques de bioremediación de metales actualmente empleados y consiste básicamente en procesos de pseudo-intercambio iónico y/o adsorción: los iones metálicos son retenidos en la biomasa por componentes de carga opuesta. Este mecanismo pasivo reduce los costos de remediación, ya que no implica adición de nutrientes, al no requerir un metabolismo activo. Una de las características de la biosorción es que es un proceso de remoción de los contaminantes muy rápida, pero dependiente de los factores del entorno, por ejemplo, Gutiérrez, González, Sánchez, & Mellado (2005) mencionan que a pH 5,0 se presentó la mayor tasa de bioadsorción de plomo (85%) en los primeros cinco minutos por parte de la biomasa seca de Saccharomyces cereviceae, y que en valores de pH inferiores o superiores a éste, la retención de plomo disminuye (Pauro Roque, Choque Yucra, Poccohuanca Aguilar, & Mamani Canqui, 2009). La biosorción incluye mecanismos físico-químicos por los que los metales son sorbidos y/o complejados en la biomasa o productos microbianos, en la cual pueden generarse núcleos de precipitación de minerales estables. Su eficacia depende de las características químicas del metal, la concentración de éste, la temperatura, el pH del medio, la presencia de otros cationes y aniones (Pauro Roque et al., 2009); es una técnica que se suele efectuar en biorreactores pero en la actualidad al emplearse con plantas superiores no necesariamente se realiza en éstos. Como biosorbentes pueden emplearse organismos activos (bacterias, hongos, algas y plantas superiores), biomasa muerta, biopolímeros como ácidos húmicos y fúlvicos, polisacáridos entre otros. Los grupos funcionales implicados en la biosorción son los hidroxilos, carbonilos, carboxilos, aminas, amidas, sulfhidrilos, tioéteres, fosfatos. Cuando se utiliza la biomasa activa tiene la ventaja que se renueva por si sola, los productos metabólicos excretados pueden contribuir a una mayor eliminación de metales y el transporte intracelular da mayor capacidad acumuladora. Cuando se emplea la biomasa inactiva se evita problemas de toxicidad, la biosorción se realiza en las membranas celulares (no conlleva transporte), con lo que es más rápida, es más barata y la recuperación de metales es más sencilla (sin destrucción celular).

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Por otra parte, algunos hongos poseerían habilidades de captación o bioadsorción de metales pesados, gracias a la composición química de la pared celular, ya que contienen diversos componentes quelantes tales como grupos carboxilos, fosfatos, amidas, tioles, hidroxilos, quitina, glucoproteínas, las cuales jugarían un rol importante en la bioadsorción de metales pesados. También se considera que se desprenden H+ equivalentes a la cantidad de metal enlazado a la biomasa microbiana (Arica, Bayramoglu, Yilmaz, Bektas, & Genc, 2004; Garza González, 2005; Naja, Deneux-Mustin, Rouiller, Hunier-Lamy, & Berthelin, 1999). Se ha utilizando biomasa seca de algunas especies de algas cafés (Ascophyllum y Sargassum), para acumular metales (Pb, Cd) hasta más de 30% del peso seco de la biomasa, el micelio de hongos de uso industrial (Rhizopus y Absidia) como biosorbente para Pb, Cd, Cu y Zn y otros con retenciones de un 25% del peso seco de la biomasa. Cepas de las bacterias Bacillus cereus, Bacillus brevis, Staphylococcus simulans, Corynebacterium jeikeim, Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, Alcaligenes faecalis y Acinetobacter sp. de los hongos Fusarium sp., Paecilomyces lilacinus, Acremonium falcifolme, Rhizopus sp., Penicillium sp., Aspergillus sp., Trichoderma sp., Alternaria sp. y Rhodotorula mucilaginosa y el alga Chlorella pyrenoidosa presentan Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de Pb(II), Cd(II), Zn(II), Cr(VI), y Cu(II) superiores a 500 mg/L; la elevada multitolerancia de estas cepas no ha sido informada en la literatura (Garza González, 2005). Se ha demostrado la capacidad de bioadsorción de Pb(II), Cr(VI), Cd(II), Cu(II), Zn(II) y Ni(II) por Bacillus brevis, Rhodotorula mucilaginosa y Acremonium falciforme. De los cationes evaluados, el plomo(II) fue el de mayor afinidad para ser removido de medio acuoso (Garza González, 2005). Así también se ha demostrado la capacidad de Chlorella pyrenoidosa de remover plomo(II), zinc (II), cobre(II), cadmio(II), níquel(II) y cromo(VI) en soluciones mono-, bi- y multimetálicas. La mayor selectividad de la biomasa corresponde a la remoción de plomo(II). La biomasa del alga tanto libre como inmovilizada reduce cuatro veces la concentración de Pb(II) respecto al nivel mínimo permisible en las Normas Mexicanas (Garza González, 2005).

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UNIDAD 2 Nombre de la ESPECIES EMPLEADAS PARA LA BIOREMEDIACIÓN. Unidad CAPÍTULO 4

BACTERIAS Y ALGAS.

Lección 16

Introducción.

Lección 17

Metabolismo aerobio.

Lección 18

Metabolismo anaerobio.

Lección 19

Metabolismo de metales.

Lección 20

Aplicaciones.

CAPÍTULO 5

HONGOS Y LEVADURAS (MICORREMEDIACIÓN).

Lección 21

Introducción.

Lección 22

Metabolismo.

Lección 23

Micorremediación con micorrizas.

Lección 24

Degradación de plaguicidas, insecticidas y organoclorados.

Lección 25

Aplicaciones.

CAPÍTULO 6

PLANTAS (FITOREMEDIACIÓN).

Lección 26

Introducción.

Lección 27

Metabolismo.

Lección 28

Clases.

Lección 29

Procesos involucrados en la fitoremediacion.

Lección 30

Aplicaciones.

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UNIDAD 2. ESPECIES EMPLEADAS PARA LA BIOREMEDIACIÓN. La bioremediación como proceso solo pueden realizarla los organismos vivos o sus partes (tejidos secos o enzimas), y teniendo esto claro es necesario aclarar que no todos los organismos vivos pueden realizar procesos de bioremediación. Como anteriormente se mencionó solo lo pueden realizar aquellos organismos que tengan el potencial genético (enzimas, tejidos, mecanismos, estructuras celulares, estructuras epidérmicas u otros) que les permitan retener, metabolizar o transformar los contaminantes. Los contaminantes referidos son de origen natural (petróleo y derivados, metales pesados) o artificial (xenobióticos o productos de síntesis química). Son conocidas principalmente las bacterias en los procesos de bioremediación, sin embargo no todos los bioremediadores son microscópicos y tampoco son solo bacterias. Los más conocidos en la actualidad son las bacterias, los hongos, las algas y las plantas superiores, sin embargo hay otros organismos que pueden degradar contaminantes y materia orgánica para obtener energía, como algunos nematodos (vermiremediación), cianobacterias y protistos (Abed et al., 2002; Cortón & Viale, 2006; Torres Rodríguez, 2003). La mayoría de los mecanismos descritos para la bioremediación se limitan a la degradación aerobia y anaerobia, dando como producto de está el CO2, H2O, CH4 y biomasa. Este es el reflejo del nivel de conocimiento adquirido hasta el momento, ya que estos organismos degradadores son heterótrofos (se alimentan de materia orgánica elaborada), mientras que actualmente se conoce del papel bioremediador de los autótrofos (producen su propio alimento a partir de CO2 liberando O2), como las plantas superiores y las algas.

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CAPÍTULO 4. BACTERIAS Y ALGAS. Lección 16. Introducción. Tanto las bacterias como las algas involucran organismos microscópicos, las bacterias carecen de nucleo y por eso se les conoce como procariotas, mientras las algas tienen un nucleo verdadero y por eso se les conoce como eucariotas. De los dos grupos solo las algas pueden tener tamaños visibles y formar tejidos de varios metros de longitud. Aunque los dos grupos son casi cosmopolitas (habitan en todas las regiones del planeta), sus metabolismos son diferentes, las bacterias son heterótrofas, mientras las algas son autótrofas y esto repercute grandemente en los mecanismos de degradación, que se verán con mayor detalle en la lección 17 o de metabolismo. Existen bacterias útiles para degradar una gran cantidad de contaminantes, se incluyen Achromobacter sp., Alcaligenes denitrificans, Arthrobacter, A. sulphureux, Acidovorax delafieldi, Bacillus cereus, Brevibacterium sp., Burkholderia sp., Chryseobacterium sp., Jambacter sp., Mycobacterium sp., M. flavescens, Pseudomonas sp., Pseudomonas putida, Pseudomonas aeruginosa, Ralstonia sp., Rhodonobacter sp., Rhodococcus sp., Staphylococcus sp., Stenotrophomonas sp., Sphingomonas sp., Terrabacter sp. y Xanthomonas sp. para degradar derivados del petróleo, aromáticos y similares. Existen por ejemplo bacterias que pueden degradar con relativa facilidad el petróleo, benceno, tolueno y otros derivados. Los metales pesados como uranio, cadmio, y mercurio no son biodegradables, pero las bacterias pueden concentrarlo y aislarlos para poder eliminarlos más fácilmente (Montoya, 1990). También son inhibidas por altas concentraciones de los contaminantes, por ejemplo se ha encontrado que los mayores valores de Concentración Mímima Inhibitoria (CMI) oscilan entre: 200- 3700 mg.L-1 de plomo (II), 200 - 3400 mg.L-1 de cromo (VI) , 200 -2400 mg.L-1 de cadmio (II), 200 – 3700 mg.L-1 de cobre (II), 200 - 3200 mg.L-1 de zinc (II), y níquel (II) 200-3200 mg.L-1 para aislamientos bacterianos de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter, Alcaligenes, Staphylococcus y Corynebacterium (Garza González, 2005). Tres de las grandes ventajas de las bacterias residen en su alta velocidad de replicación y crecimiento, en su amplia variabilidad genética y en el hecho de que son los únicos organismos que pueden trabajar en condiciones anaerobias para degradar gran cantidad de xenobióticos y contaminantes, estas características hacen que las bacterias sean altamente adaptables a muchas condiciones del entorno. El hecho de poder trabajar en condiciones anaerobias las capacita para trabajar en condiciones de anoxia, predominantes en regiones húmedas, en lechos acuáticos, pantanos, lagos y similares, incluso condiciones anaerobias producidas por los mismos derrames.

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En condiciones “in-situ”, altas concentraciones de crudo pueden cubrir grandes áreas impidiendo el ingreso de oxígeno, bajo estas condiciones se puede favorecer el crecimiento de bacterias anaerobias o anaerobias facultativas como Pseudomonas aeruginosa o Phormidium sp. para la degradación de hidrocarburos, la cual es lenta pero efectiva. De la misma manera se ha empleado bacterias anaerobias en condiciones de rellenos sanitarios, donde la profundidad de los contaminantes dificulta el tratamiento aerobio. En el trabajo “ex-situ” en muchos casos son requeridos bioreactores para procesos de degradación aerobia y/o anaerobia para abarcar todos los contaminantes que en encuentran en los suelos; es frecuente encontrar que sea necesario un tratamiento anaerobio inicial, para producir sustratos degradables por la vía aerobia, motivo por el cual es imprescindible el trabajo de las bacterias; como sucede con el benceno, hidrocarburos aromáticos y poliaromáticos. Sin embargo el ser anaerobias no exime que sus respuestas no dependan del pH, acidez, temperatura y capacidad de intercambio catiónico del suelo. Las algas por su parte, son importantes productores primarios en la cadena alimenticia. Las algas tienen la capacidad de modificar el pH, la alcalinidad, el color y la turbiedad. En el proceso de purificación natural, las algas oxigenan el agua y utilizan los subproductos del proceso de depuración. Las pequeñas algas verdes unicelulares son las más importantes para mantener el nivel adecuado de oxígeno disuelto en los estanques de estabilización (Rivas Cevallos & Vera Vera, 2011). La importancia de las algas para el funcionamiento del planeta es enorme, aunque desde el punto de vista (terrestre) pasan inadvertidas. Las algas son enormemente diversas (desde unicelulares de 1μm de diámetro hasta gigantescas algas marina de 50m de largo) y están presentes en prácticamente todos los ecosistemas de la biosfera (Rivas Cevallos & Vera Vera, 2011). Una de las características más importantes de las algas es su capacidad depuradora del medio ambiente, ya que a través del proceso de fotosíntesis incorporan oxígeno, contribuyendo de esta manera a la oxidación de la materia orgánica, por una lado y por el otro a aumentar el oxígeno disuelto en el agua, el cual será utilizado por las otras comunidades u organismos que componen la flora y fauna del medio acuático donde viven (Lujan de Fabricius, 2000), citado por Rivas Cevallos & Vera Vera (2011). Algunas microalgas se cultivan en fitorreactores para procesos de depuración de aguas residuales y de desechos industriales (Rivas Cevallos & Vera Vera, 2011). En el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV) en México, se ha tenido algunas contribuciones relacionadas con el tratamiento terciario de aguas residuales porcinas, en los que ha explotado el potencial de las cianobacterias Phormidium sp. y Spirulina maxima. Los resultados obtenidos indican que el crecimiento de las cianobacterias disminuyó la demanda química de oxígeno (DQO) de los residuales dando como resultado un efluente terciario cuya calidad hace posible su vertimiento a cuerpos de agua o su utilización en actividades de regadío y de limpieza. Para Phormidium 64


sp., los mejores resultados de remoción de nutrientes se obtuvieron utilizando residual anaerobio diluido al 25% y residual aerobio diluido al 50%. En tanto que el mayor crecimiento de Spirulina maxima se obtuvo en residual aerobio diluido al 50% (FerreraCerrato, Rojas-Avelizapa, Poggi-Varaldo, Alarcón, & Cañizares-Villanueva, 2006) En los últimos 10 años, se ha venido investigando la capacidad de las microalgas para biotransformar y biodegradar contaminantes orgánicos como hidrocarburos, plaguicidas, etc., que resultan de alta peligrosidad para los seres vivos. Los contaminantes orgánicos en el medio acuático son biodegradados por diversos microorganismos, incluyendo algas, las cuales han demostrado que son capaces de biotransformar y biodegradar contaminantes aromáticos comúnmente encontrados en aguas naturales y residuales (Semple, Cain, & Schmidt, 1999). Las microalgas y cianobacterias proveen carbono reducido y nitrógeno a la microbiota presente en los ecosistemas acuáticos, lo que incrementa el potencial de degradación y eliminación de contaminantes (Ferrera-Cerrato et al., 2006). La utilización de organismos fotosintéticos para la oxidación de compuestos orgánicos incluyendo los hidrocarburos policíclicos aromáticos (HPA), ha sido demostrada. Microalgas como Prototheca zopfii, Selenastrum capricornutum, Scenedesmus acutus, Ankistrodesmus braunii, Chlamydomonas ulvaensis, Chlorella pyrenoidosa y Scenedesmus brasiliensis, el fitoflagelado Euglena gracilis y las cianobacterias Anabaena cylindrica, Phormidium foveolarum, Oscillatoria sp. y Agmenellum quadruplicatum, han mostrado ser eficientes para degradar diversos compuestos orgánicos incluyendo derivados del petróleo y HPA (Ferrera-Cerrato et al., 2006) Respecto a la cianobacteria Spirulina maxima y su capacidad para remover HPA utilizando fenantreno (compuesto altamente tóxico para los organismos acuáticos), se encontró que cuando la concentración de fenantreno fue de 100 ppm (partes por millón o mg/kg), se logró una remoción de 4.72% a las 72 horas de exposición, mientras que a 200 ppm la remoción fue de 4.34% en el mismo tiempo de incubación. La presencia del contaminante no afectó de manera directa el contenido de proteína ni el crecimiento de la cianobacteria, no obstante, la clorofila a resultó ser un factor de respuesta importante en el comportamiento del cultivo expuesto a fenantreno (Ferrera-Cerrato et al., 2006). Con respecto a los metales pesados, algunas Geobacter sp. son capaces de respirar usando metales, es decir de reducirlos, su aplicación en el terreno de la bioremediación es muy amplia. Por ejemplo en el caso de la contaminación por Uranio (VI) el cual es insoluble, pero que al ser metabolizada por Geobacter sp. es reducido a Uranio (IV), el cual es soluble y puede ser removido.

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Lección 17. Metabolismo aerobio. En esta lección se hará énfasis solo en el metabolismo bacteriano aerobio, debido a lo extenso y complejo de todo el metabolismo, posteriormente en la sección de fitoremediación se hara alusión al metabolismo de algas, debido a las similaridades que presentan en gran parte del metabolismo. Para los sustratos que pueden ser biodegradados existen dos mecanismos de degradación, aeróbio y anaerobio, cuyas reacciones siempre producen CO2 y materia orgánica (Figura 14).

Figura 14: Esquema de las reacciones de acuerdo a Torres Delgado & Zuluaga Montoya (2009). La biodegradación se basa en la cadena respiratoria o en la cadena transportadora de electrones, la cual produce una serie de reacciones de oxido-reducción con el fin de obtener energía. La cadena se inicia con un sustrato orgánico externo a la célula y actúa como dador de electrones, de modo que la actividad metabólica de la célula termina degradando o consumiendo dicha sustancia. Los aceptores más comúnmente usados por las bacterias son el oxígeno, nitratos, sulfatos y dióxido de carbono. Cuando se usa oxigeno es un proceso aerobio, con cualquiera de los otros es anaerobio (Losser, 2001). Cualquiera que sea el xenobiótico, lo primero que se hace es quitar este carácter mediante la acción de enzimas específicas catabólicas (oxigenasas, hidrolasas, deshidrogenasas, amidadas, transferasas, entre otras), para servir de intermediario metabólico y posteriormente continuar en el metabolismo normal de las bacterias. Enzimas ligninolíticas como las ligninoperoxidasas y manganeso peroxidasas utilizan H 2O2 como aceptor de electrones y catalizan la oxigenación de diversos compuestos incluyendo los polímeros de lignina. Numerosas bacterias y hongos degradan hidrocarburos lineales, solventes halogenados y cicloalcanos en condiciones aeróbicas, en ocasiones en cooxidación de otros metabolitos. Los microorganismos han involucrado sistemas enzimáticos catabólicos para el metabolismo de compuestos aromáticos. En la oxidación de compuestos aromáticos el 66


oxígeno es la clave para la hidroxilación y fusión del anillo aromático. La biodegradación de una molécula aromática sigue dos pasos: la activación del anillo y el rompimiento del anillo (Figura 15). La activación involucra la incorporación del oxígeno molecular al anillo, esto es, dihidroxilación del núcleo aromático. Este paso es llevado a cabo por enzimas conocidas como oxigenasas. Las dioxigenasas, catacterísticas de las bacterias, catalizan la incorporación de dos átomos de oxígeno molecular en un solo paso para formar un dihidrodiol. Los hidrodioles después se oxidan a derivados dihidroxilados como los catecoles, que son precursores del rompimiento del anillo. El catecol puede ser oxidado ya sea por la via orto para dar el ácido mucónico, o la via meta que va a dar el semialdehido 2-hidroximucónico (Eweis, Ergas, Chang, & Schroeder, 1998).

Figura 15: Ruta de degradación (via catecol) de compuestos aromáticos (Eweis et al., 1998) utilizada por bacterias como Pseudomonas putida. Si bien el grupo nitro aumenta la resistencia del anillo aromático a la biodegradación, diversos autores han descrito aislamientos bacterianos capaces de utilizar estos compuestos como fuente de carbono, liberando nitrito al medio. Entre estas cepas se incluyen especies pertenecientes a los géneros Arthrobacter (Chauhan, Chakraborti, & Jain, 2000), Bacillus (Kadiyala, Smets, Chandran, & Spain, 1998), Pseudomonas (Zeyer, Kocher, & Timmis, 1986), Burkholderia (Bhushan, Chauhan, Samanta, & Jain, 2000), Rhodobacter (M. D. Roldán, Blasco, Caballero, & Castillo, 1998), Sphingomonas (Zablotowicz et al., 1999), Nocardioides (Ebert, Rieger, & Knackmuss, 1999) y Rhodococcus (Gomez Cruz, 2009; Lenke, Pieper, Bruhn, & Knackmuss, 1992). En general, los compuestos nitroaromáticos pueden ser degradados a través de dos tipos diferentes de mecanismos dependiendo del número de sustituyentes nitro del anillo: uno 67


de ellos es el mecanismo oxidativo típico de compuestos mononitroaromáticos y el otro es el mecanismo reductivo que ocurre frecuentemente en los compuestos polinitroaromáticos (M. D. D. Roldán et al., 2008). La oxidación de los compuestos nitroaromáticos ocurre en aerobiosis (Spain, 1995; Spain et al., 1979; Zeyer et al., 1986); sin embargo, la reducción de los compuestos nitroaromáticos ocurre tanto en aerobiosis como en anaerobiosis (Gomez Cruz, 2009; Hallas & Alexander, 1983)(Figura 16).

Figura 16: Transformación bioquímica de los compuestos nitroaromáticos (Gomez Cruz, 2009). El metabolismo oxidativo puede seguir la ruta de las mono o dioxigenasas, las monooxigenasas se ha encontrado que actúan sobre el 4-nitrofenol, 4–nitrocatecol (Chauhan et al., 2000; Jain, Dreisbach, & Spain, 1994), o–nitrofenol (Xiao, Zhang, Liu, & Zhou, 2007; Zeyer et al., 1986) y dependiendo del aislamiento pueden eliminar el grupo nitro en forma de nitrito, aunque también se puede hidroxilar el anillo sin salida del grupo nitro (Gomez Cruz, 2009)(Figura 17a).

Figura 17: Rutas aeróbicas oxidativas de degradación del anillo aromático de los compuestos nitroaromáticos. 68


(a) conversión de p-nitrofenol a nitrocatecol y su posterior degradación y (b) conversión de o-nitrotolueno a metilcatecol (Castillo et al., 2005; Gomez Cruz, 2009). Cuando se emplean dioxigenasas se adicionan simultáneamente dos grupos hidroxilos (Figura 17b), se ha encontrado en las rutas de biodegradación del 2,4–dinitrotolueno, 1,3– dinitrobenceno, 3–nitrobenzoato, 2–nitrotolueno y nitrobenceno (Caravatti, 2007). Sin embargo, la oxidación de compuestos dinitroaromáticos tales como el 2,4–dinitrotolueno (DNT) se ha demostrado solamente en pocas ocasiones (Gomez Cruz, 2009; Heidi, Boardman, & Freedman, 2000).

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Lección 18. Metabolismo anaerobio. Debido a la amplitud de los procesos, se van a tomar solo el metabolismo de solventes halogenados, hidrocarburos lineales, compuestos aromáticos y nitroaromáticos. Los solventes halogenados son degradados en condiciones aeróbicas y anaeróbicas. La dehalogenación reductiva de un halógeno a la vez, puede ser utilizada como fuente única de carbono. Las dehalogenasas reductoras usan la decloracion reductiva, mientras las alquil succinato sintetasas usan la adición de fumarato (Figura 18).

Figura 18: Dehalogenación reductiva de tetracloruro de carbono y tetracloroetileno. Para profundizar un poco mas acerca del metabolismo anaerobio de halogenados, se recomienda la siguiente lectura (Janssen, Oppentocht, & Poelarends, 2001). Los hidrocarburos saturados y todos los hidrocarburos aromáticos, incluido el benceno, tienen un proceso de biodegradación anaeróbica que tiene que pasar por una activación inicial que puede ser carboxilación, metilación, hidroxilación o adición de fumarato, donde la ruta mas utilizada es la adición de fumarato (Figura 19).

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Figura 19: Reacciones iniciales durante la degradación anaeróbica de hidrocarburos saturados y aromáticos. a-d) adición de fumarato, e) hidroxilación, f) carboxilación (Widdel & Rabus, 2001). A estos mecanismos ha de agregarse la metilación o adición de CH3. Los procesos posteriores dependen del organismo que realice la biodegradación del hidrocarburo específico, requiere de mecanismos enzimáticos específicos, muchos de los cuales no se han dilucidado completamente. Para una visión mas completa de los mecanismos durante la degradación de hidrocarburos aromáticos se puede revisar a Widdel & Rabus (2001). Por su parte, la presencia de los grupos nitro en el anillo de los compuestos nitroaromáticos dificulta el ataque oxidativo y favorece el mecanismo reductivo. La presencia de dos o más grupos nitro determina una mayor resistencia a la oxidación. Por lo tanto, los compuestos polinitroaromáticos son degradados a través de rutas reductivas (Gomez Cruz, 2009; Hallas & Alexander, 1983; M. D. D. Roldán et al., 2008). Dos procesos se pueden llevar a cabo, bien sea la reducción del anillo mediante la adición de iones hidruros, o bien a la reducción de grupo nitro para obtener los derivados: nitroso, hidroxilamino o amino. El nitrito o el amonio liberado del anillo aromático por vías degradativas pueden ser utilizados como fuente de nitrógeno para el crecimiento bacteriano (Gomez Cruz, 2009; M. D. D. Roldán et al., 2008)(Figura 20).

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Figura 20: Reducción de los compuestos nitroaromáticos. Reducción del anillo aromático (arriba) y reducción del grupo nitro (abajo). Adaptada de M. D. D. Roldán et al. (2008). Las nitroreductasas mas estudiadas son las tipo I (insensibles a oxígeno), que catalizan la reducción de una gran variedad de compuestos nitroaromáticos mediante la adición de pares de electrones formando intermediarios nitroso (–NO) e hidroxilamino (–NHOH) y, finalmente, el producto amino–derivado (–NH2) (Gomez Cruz, 2009; Nishino et al., 2000; M. D. D. Roldán et al., 2008)(Figura 21).

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Figura 21: Reducción del nitrobenceno catalizada por la nitrobenceno reductasa (Tipo I) de Pseudomoas pseudoalcaligenes. El proceso se realiza mediante la adición secuencial de pares de electrones del NADPH (Gomez Cruz, 2009; Johnson & Spain, 2003; Nishino et al., 2000). Eschericha coli, Salmonella entérica, Enterobacter cloacae, Klebsiella sp., Pseudomonas pseudoalcaligenes, Pseudomonas putida, Vibrio fischeri, Vibrio harveyi, Synechocystis sp., Rhodobacter capsulatus, Bacillus subtilis, Staphyllococcus aureus y Clostridium acetobutylicum se encuentran entre las bacterias que producen nitroreductasas bacterianas tipo I (M. D. D. Roldán et al., 2008). Por su parte, Rhododoccus sp. posee una gran variedad de vías metabólicas para la degradación y modificación anaeróbica de compuestos aromáticos, hidrocarburos alifáticos halogenados y numerosos compuestos aromáticos, como los PAH´s (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). Pseudomonas aeruginosa también degrada gran cantidad de sustratos como el n-hexadecano, compuestos alifáticos, hidrocarburos aromáticos y poliaromáticos en condiciones anaerobias (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). Finalmente también se ha encontrado Desulfomonile tiedjei como degradador del Monoclorobenzoato (Compuesto orgánico volátil) en condiciones anaerobias.

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Lección 19. Metabolismo de metales.

Para los metales pesados las rutas metabólicas son diferentes a las de otros contaminantes, debido a que los metales no se degradan, solo sufren reacciones de transformación para ser detoxificados o acumulados, pero no son utilizados como sustrato para generar biomasa. La mayoría de las transformaciones de metales efectuadas por microorganismos tienen funciones primarias no relacionadas con la transformación de metales, pero que alteran su solubilidad, movilidad y/o toxicidad, por lo tanto, pueden emplearse como estrategias de remediación. Las vías por las cuales los microorganismos pueden influenciar los metales pueden ser (Figura 22): 1- Acumulación de metales de forma independiente del metabolismo (adsorción pasiva) o intracelular o dependiente del metabolismo (absorción activa). Ambos mecanismos pueden ocurrir en el mismo organismo. Si un metal es acumulado por el microorganismo, el destino del metal, estará relacionado con el destino de la célula. De otra parte si los microorganismos son transportados, el metal se moverá con ellos. 2- Algunos metales pueden ser transformados por procesos redox (p. ej. Fe y Mn) o por alquilación (p. ej. Hg). La movilidad y toxicidad del metal transformado usualmente difiere en gran medida a su forma original. 3- Los microorganismos pueden producir o liberar sustancias, como compuestos orgánicos o sulfuros que cambian la movilidad de los metales, reduciendo la movilidad de éstos. 4- Los microorganismos participan en el ciclaje de carbono y por lo tanto influencian la cantidad y características de la materia orgánica. Esto es de gran importancia para la movilidad de los metales porque la materia orgánica se suele unir a los metales. La degradación microbiana de los complejos órgano-metálicos puede cambiar la especiación del metal. Sin embargo los metales unidos a varias sustancias orgánicas pueden disminuir la degradación microbiana del compuesto orgánico. El resultado puede ser materia orgánica con los metales acumulados, la cual no es biodegradada. 5- En adición a estos procesos directos, los microorganismos pueden influenciar indirectamente la movilidad de los metales debido a que afectan el pH y las propiedades del suelo.

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Figura 22: Interacción entre metales y microorganismos explicando la precipitación, acumulación, producción o liberación de sustancias y participación en el ciclo de carbono. Adaptado de Ledin (2000). Por su parte, la acumulación pasiva puede principalmente ser influenciada por: a) las propiedades de la superficie tales como la carga y orientación de los grupos funcionales del metal sobre la superficie de la célula y b) la especiación del metal y la química en la fase acuosa (Ledin, 2000). En organismos que solo realizan acumulación pasiva, se ha encontrado que se puede seguir un proceso, comenzando con una reacción electrostática de los metales con los grupos de la superficie y luego se convierten en centros de agregación de éstos, logrando alcanzar hasta el mismo peso de la célula, lo que lleva a que la célula se precipite. Algunas bacterias tienen capacidad para unirse a iones metálicos del exterior de la superficie celular en un mecanismo de adsorción pasiva, y además utilizan los metales para funciones estructurales y/o catalíticas, en este caso los transportan hacia el interior mediante absorción activa, esto lo hacen mediante:  Captación de metales traza en forma iónica para incorporación a metalo-enzimas o para la activación de enzimas.  Utilización de metales como donadores/aceptores de electrones en el metabolismo energético).  Detoxificación enzimática de metales tóxicos: son convertidos a formas con menor o nula toxicidad por oxidoreducción enzimática. 75


 Formación de una biopelícula, generalmente de polisacáricos en la superficie del metal con diferentes tipos de bacterias; algunos productos metabólicos resultan corrosivos.  Las bacterias (vivas o muertas) tienen la capacidad de unir cationes a la superficie celular y acumularlos, lo cual depende de la presencia de sitios de unión de metales, de la presencia de grupos carboxílicos como aminas y grupos fosfóricos.  Algunas bacterias pueden promover con productos metabólicos la lixiviación (selectiva o no) de constituyentes metálicos de minerales (Biolixiviación).  Ciertos microorganismos excretan productos metabólicos inorgánicos (sulfuros, carbonatos, fosfatos) en su metabolismo respiratorio que precipitan iones metálicos (Bioprecipitación). Entre los metales que pueden ser adsorbidos se encuentran Hg (II), U, Cd(II), Zn(II), (II), Cu(II), Ag(I), La(III), Pb(II), Ni(II), Fe(III), Ca(II), Cr(VI), TcO4-, Sr(II), Mn(II) y Tl(I), por microorganismos como Pseudomonas putida, Scherichia coli, Pseudomonas sp., Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas capecia, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus mucilagenosus, Thiotrix sp., Rhodococcus erythropolis, Synechocistis sp., Synechococcus sp. y Plectonema borianum (Ledin, 2000; Mo & Lian, 2010; Murthy, Bali, & Sarangi, 2012). Entre los factores que afectan la eficiencia de adsorción de metales se encuentra la temperatura, ya que las tasas de reacción se incrementan a altas temperaturas, pero muy altas temperaturas también pueden matar las células; también es importante la edad de las células ya que células de un solo día acumulan menos metales que aquellas de dos o tres días, así también si la célula está muerta acumula la mitad de una célula viva (Ledin, 2000). Entre los factores más influyentes se encuentra el pH del medio, la dependencia del pH depende mucho de la concentración del metal, a altas concentraciones de Pb no hay casi dependencia de la adsorción por Pseudomonas atlentica (Lion & Rochlin, 1989), mientras la adsorción incrementa significativamente con el pH a bajas concentraciones de Pb. Lo opuesto, un incremento de la dependencia del pH con el incremento de la concentración del metal se ha visto con la acumulación de Cd en Pseudomonas cepecia (Savvaidis, Hughes, & Poole, 1992). La dependencia del pH en la acumulación microbiana de metales puede ser completamente dependiente de los metales y organismos. Los perfiles de dependencia de cada metal incrementan o disminuyen su acumulación con el pH, los valores mínimo y/o máximo generalmente son encontrados alrededor de la neutralidad. Por lo general la dependencia del pH por los aniones es significativamente diferente de la de los cationes. Para una información mas completa se puede consultar el artículo escrito por (Ledin, 2000).

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Lección 20. Aplicaciones.

En esta lección se abarcarán algunos casos de aplicación de bacterias en procesos de bioremediación, algunos casos corresponden a Colombia, mientras otros corresponden a otras partes del mundo; también se debe considerar que la biotecnología basada en bacterias es una de las mas difundidas y empleadas, por lo tanto los casos en que se puede aplicar abarcan un amplio rango de contaminantes, los cuales intentare explicar la forma mas sencilla posible. En Colombia alrededor de una planta productora de TNT (Tri-nitro-tolueno, un nitroaromático xenobiótico recalcitrante), se aislaron bacilos gran-negativos degradadores de este elemento, se requirió adicionar una fuente de carbono al medio para favorecer la degradación (Villegas Plazas, 2009), es una biotecnología importante debido al carácter contaminante del TNT y su condición recalcitrante. Según Golovleva, Aharonson, Greenhalg, Sethunathan, & Vonk (1990), las Pseudomonas son las bacterias más eficientes en la degradación de compuestos tóxicos, la capacidad de estas bacterias para degradar estos compuestos depende del tiempo de contacto con el compuesto, las condiciones ambientales en las que se desarrollen y su versatilidad fisiológica. En Peru, Vásquez y Reyes (2002) evaluaron tres especies de Pseudomonas para la biodegradación del herbicida Aroclor 1242, los resultados obtenidos demuestran la gran capacidad de las bacterias para degradarlo, encontrando un porcentaje de degradación entre 99,8 y 98,4% (Torres Rodríguez, 2003) En México se aisló un consorcio bacteriano de suelos agrícolas, capaz de degradar el plaguicida tetraclorvinfos (ácido fosfórico, 2-cloro-1-(2,4,5-triclorofenil) etenil dimetil ester, TVC). Este consorcio estuvo formado por seis cepas puras que fueron caracterizadas con base en sus características bioquímicas y morfológicas. Las cepas fueron presumiblemente identificadas como Stenotrophomonas malthophilia, Proteus vulgaris, Vibrio metschinkouii, Serratia ficaria, Serratia spp. y Yersinia enterocolitica. El consorcio y las seis cepas puras fueron cultivados en medios mineral y enriquecido, para evaluar su capacidad para degradar TCV. Los resultados mostraron que el consorcio es capaz de crecer en presencia de TCV como única fuente de carbono; todas las cepas removieron este plaguicida en el medio enriquecido, sin embargo sólo una cepa removió el TCV del medio mineral. Estos datos indican que las cepas aisladas pueden ser utilizadas para la biodegradación de residuos o para la biorremediación de suelos o aguas contaminadas con este plaguicida (Ortiz-Hernández & Sánchez-Salinas, 2010). En el altiplano boliviano los drenajes ácidos de las minas están caracterizados por la acidez extrema, altas concentraciones de metales pesados y sulfatos. Las bacterias sulforeductoras reducen sulfatos oxidando la materia orgánica para la producción de sulfuro de 77


hidrógeno y bicarbonato. La bioremediación consiste en la precipitación insoluble del sulfuro con los metales pesados y la alcalinización del medio por el bicarbonato. Se establecieron dos consorcios sulfato reductores acidófilos, capaces de ser aplicados a bioreactores para la producción de sulfuro de hidrógeno en condiciones ácidas. El establecimiento de un sistema de bioremediación en dichas condiciones permitirá el tratamiento directo de drenajes ácidos de mina utilizando residuos agrícolas como materia orgánica oxidable (Gutierrez R., Terrazas S., & Alvarez A., 2007) En Holanda, la refinería de Zn de Budel-Dorplein, está diseñada para remover contaminantes metálicos de aguas subterráneas por reducción de sulfatos mediante bacterias (bacterias sulfato reductoras). Esta planta tiene un afluente de 300 m 3/h con una carga contaminante de 100 mg/l Zn, 1 mg/l Cd y 1000 mg/l sulfato, el efluente de la planta tiene una carga contaminante de <0.3 mg/l Zn, <0.01 mg/l Cd y <200 mg/l sulfato. En esta planta los sulfuros metálicos precipitados por el H2S y el S elemental producido por la oxidación microbiana del exceso de H2S, son transportados a un horno de fundición donde se recuperan los metales y el sulfuro es convertido en ácido sulfúrico. El pH se eleva debido a la producción de bicarbonato como consecuencia de la oxidación de los nutrientes orgánicos. En la costa de Galicia suelos saturados con Diesel fueron tratados con sistemas anaerobios debido a las limitantes de oxígeno ya que los hidrocarburos totales (HCT) se encontraban a 4.6 mts de profundidad. Se recurrió al uso de aceptores alternativos de electrones, mediante la adición de nutrientes y bioaumentación. Como resultado se eliminó más del 90% de los contaminantes en las zonas más críticas y una considerable reducción de hidrocarburos en casi todo el lugar. A 4.6 metros de profundidad las concentraciones de HCT se redujeron de 1000 mg/kg a menos de 100 mg/kg; se completó la remediación aproximadamente de 27400 m3 de suelo y acuífero contaminado con diesel, cubriendo un área de aproximadamente 12200 m2 a una profundidad de 6 metros, cumpliendo con todas las regulaciones y leyes ambientales estatales y federales. En un sistema de bioremediación por Landfarming en Argentina, una muestra de suelo en actividad se usó para determinar la capacidad de la comunidad bacteriana de biodegradar petróleo y sus destilados, de ésta se caracterizaron sus propiedades físicas, químicas y microbiológicas. La comunidad bacteriana del suelo poseia la capacidad de biodegradar los hidrocarburos existentes en el mismo, principalmente la fracción alifática, así como los destilados gasoil, kerosén y aceite lubricante, mientras la fracción aromática, la polar y el destilado nafta no fueron degradados. Está comunidad constituida principalmente por Rhodococcus erythropolis, Achromobacter xylosoxidans y Brevundimonas diminuta, mostró la utilidad del componente bacteriano en el sistema de landfarming para la degradación de derivados de petróleo (A. Acuña, Pucci, Morales, & Pucci, 2010).

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En toda Colombia existen yacimientos de petróleo y los derrames más que un accidente son una regla general, para lo cual el Instituto Colombiano del Petróleo (ICP) ha obtenido aislamientos bacterianos y ha desarrollado tecnologías de vanguardia con las que pueden sobrellevar estos vertimientos en un tiempo corto con una alta eficiencia, dependiendo de la región y las condiciones de la zona que se necesita recuperar. En el Caribe colombiano se han encontrado nueve aislamientos bacterianos con capacidad de degradación de hidrocarburos alifáticos pero no de los aromáticos, que corresponden a los a los géneros Klebsiella, Chromobacterium, Flavimonas, Enterobacter, Pseudomonas y Bacillus. Las cepas evaluadas tienen el potencial enzimático para degradar hidrocarburos, básico para disponer de un consorcio efectivo para la aplicación en campo adaptado a las condiciones del Caribe colombiano (Narváez-Flórez, Gómez, & Martínez, 2008). A nivel acuático se ha observado la remoción de fenantreno por Azolla caroliniana y su microsimbionte Bacillus stearothermophilus, utilizando bioaumentación con microorganismos hidrocarbonoclastas, en México se han encontrado resultados positivos ante concentraciones menores a 60 mg/L, importante para la limpieza de acuíferos contaminados con hidrocarburos (Castro Carrillo, Delgadillo Martínez, Ferrera Cerrato, & Alarcón, 2008). El último caso corresponde a una ex-refinería de hidrocarburos localizada en México a la que denominaremos “18 de marzo”, cuyos suelos se encontraban contaminados. El área total considerada para tratamiento es de 55 hectáreas. A partir del 18 de febrero de 2011 se contrataron los servicios de la Universidad Autónoma de Puebla para realizar los trabajos de remediación, la cual procedió con cuatro tecnologías (bioventeo, cultivo sólido o biopilas, biobarreras reactivas y fitoremediación), las cuales utilizan bacterias total o parcialmente para sus procesos. A la fecha se tiene un avance general del 98% y se ha retornado el material tratado al sitio de excavación. Asimismo, el 30 de marzo del presente año el Instituto Tecnológico Agropecuario de Oaxaca inició la remediación de 44672 m2 (89325 m3) aplicando las técnicas antes mencionadas. Al momento se tiene un avance del 97% y se retorna el material tratado a la zona de excavación.

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CAPÍTULO 5. HONGOS Y LEVADURAS (MICORREMEDIACIÓN). Los hongos son un grupo muy grande de organismos, tanto hoy en día se consideran un reino aparte, comprende desde organismos microscópicos hasta de hasta un metro de longitud en sus estructuras reproductivas. Siendo un grupo tan diverso, heterogéneo y ampliamente distribuido por el planeta, con un papel principalmente descomponedor o saprobio de prácticamente toda materia orgánica, es de suponer que algunos de ellos tengan propiedades de bioremediación. Lección 21. Introducción. La bioremediación en una de sus ramas, usa los hongos para limpiar ambientes contaminados, aprovechando la capacidad que tienen algunas especies para degradar, transformar, acumular, tolerar y/o extraer diversos contaminantes (orgánicos xenobióticos, metales pesados, elementos radioactivos, etc)(Alonso, 2007). Para la degradación de compuestos orgánicos y xenobióticos, como hidrocarburos aromáticos se usan Trametes versicolor, Stereum hirsutum, Bjerkandera adusta, Phellinus pini, Lentinus edodes, Hypholoma fasciculare, Pleurotus ostreatus y diversas especies de Ganoderma, Phlebia, Phellinus, etc. Para eliminar iones metálicos como Torio y Uranio de disoluciones y aguas contaminadas (Biosorción), se utilizan Saccharomyces, Aspergillus, Penicillium y Rhizopus (Alonso, 2007). Como técnica utilizando hongos se encuentra la micoextracción, la cual consiste en la extracción con apoyo de hongos (generalmente se usan géneros o especies de gran tamaño, de forma que sean visibles y fácil trabajar con ellos), de cadenas y sustratos sólidos contaminados por metales pesados. Los mas empleados son Agaricus bisporus y Pleurotus ostreatus con los cuales se ha logrado extraer platino de pilas de compost. Con Agaricus macrosporus también se ha logrado extraer Cadmio, Mercurio, Plomo, Cobre y Zinc (Alonso, 2007). Hay una serie de ventajas en el uso de hongos en relación al uso de las plantas. 1. La infiltración del hongo al sustrato es muy superior al de las plantas (debido a que su cuerpo constituido por hifas puede penetrar mas profundo por su diámetro mas pequeño). 2. Las especies mas acumuladoras, especialmente el género Agaricus, sección arvensis, poseen una capacidad de acumulación de metales como cadmio o mercurio superior a la de las plantas. Su crecimiento y productividad no se ve inhibido por la presencia de concentraciones elevadas de metales tóxicos como el mercurio. 3. Los cultivos de Agaricus sobre sustratos ricos en materia orgánica esta ampliamente estudiado y comprendido. Especies como Agaricus macrosporus o 80


Agaricus arvensis son perfectamente cultivables con altas producciones de carpóforos (cuerpos reproductivos). 4. La actividad descomponedora del micelio sobre el sustrato, permite no solo seguir la depuración de metales, sino también la degradación de xenobióticos orgánicos en las pilas de compost o el reciclado para un posterior uso agrícola. 5. El crecimiento y productividad de Agaricus macrosporus no se ve significativamente afectada por la presencia de mercurio y otros metales (Alonso, 2007). Sin embargo, también se presentan inconvenientes, como: 1. Conseguir la inoculación del micelio sobre sustratos pobres en materia orgánica puede dificultase, debido a que requieren materia orgánica a descomponer para poder crecer. 2. Obtener altas producciones de carpóforos en condiciones ambientales no controladas, como son las condiciones de campo. 3. Posibles dificultades en el cultivo y producción por competencia con otros hongos y microorganismos, ya que la mayoría de los micoextractores no son altamente competitivos (Alonso, 2007). Ciertos hongos son muy efectivos en la remoción de un amplio rango de contaminantes, por ejemplo: • Sustancias empleadas en la preservación de la madera. • Hidrocarburos aromáticos policíclicos. • Organoclorados. • Bifenilos policlorados. • Tinturas. • Pesticidas. • Fungicidas. • Herbicidas. • Lignina. Aunque los macromycetos sean los preferidos para los procesos de fitoextracción, son los hongos microscópicos los que predominan entre los degradadores de hidrocarburos poliaromáticos, como se observa en el Cuadro 10. Cuadro 10: Géneros fúngicos que contienen especies que degradan hidrocarburos poliaromaticos (PAHs)(Al-Turki, 2009).

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Los hongos pueden biodegradar solos, en cooperación con plantas resaltando sus funciones, o con bacterias en cometabolismo; cualquiera que sea el caso, algunos de sus procesos metabólicos son similares o complementarios, p. ej, el uso de enzimas mono y dioxigenasas para la degradación inicial, con la diferencia de que son diferentes enzimas, como lignoperoxidasas y manganeso peroxidasas, las cuales usan H2O2 como aceptor de electrones y catalizan la oxigenación de diversos compuestos incluyendo los polímeros de lignina. Al igual que las bacterias es mucha la información que se desconoce para poder ser utilizada, se puede argumentar que los estudios en este campo están en desarrollo y muchas de las rutas metabólicas y los mecanismos de biodegradación y biorecuperación son específicos para géneros o especies, por lo tanto es difícil generalizar en cuanto a los resultados que se pueden obtener en cifras y hechos. Los hongos tienen sus ventajas y desventajas, los cuales pondremos en tela de juicio a lo largo del presente capítulo.

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Lección 22. Metabolismo. Debido a la existencia de especificidad en los procesos metabólicos para degradar gran parte de los contaminantes, se hará referencia solo a algunos procesos metabólicos haciendo alusión a los organismos de los cuales se conoce su bioquímica. Se incluye la degradación del TNT por Phanerochaete chrysosporium (Figura 23), la degradación del benzo(a)pyreno por Cunninghamella elegans y Aspergillus ochraceus (Figura 24), Cianuro por Trichoderma sp (Figura 25) y finalmente del Fenantreno y Pireno por Cyclothirium sp (Figura 26).

Figura 23: Metabolitos intermediarios formados durante la degradación aerobia de TNT por Phanerochaete chrysosporium (Spain, 1995). Los intermediarios 2,2´, 6,6´-tetranitro-4,4´-aoxitolueno y 4-amino-2,6-dinitrotolueno han sido reportados durante la degradación de TNT por Trichoderma viride (Argumedo-Delira, Alarcón, Ferreta-Cerrato, & Peña-Cabriales, 2009; Bayman & Radka, 1997).

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Figura 24: Transformaciones fungicas del benzo(a)pyreno. La formación de benzo(a)pyrenos hidrolizados y de dihidrodioles de benzo(a)pyreno ocurre por la via de epóxidos de benzo(a)pyreno. Los dihidrodioles pueden ser transformados a diol epóxidos los cuales posteriormente serán transformados para formar tetraoles cis y trans (Juhasz & Naidu, 2000) adaptado de Datta & Samanta (1988). Varias especies de Trichoderma tienen la capacidad de metabolizar cianuro vía rodanasa y cianuro hidratasa (Figura 25), pero no se ha encontrado evidencia de que utilicen la ruta de la β-cianoalanina sintetasa (Ezzi & Lynch, 2005), lo que indica que no es común encontrar esta enzima en los hongos, en comparación con plantas y algunas bacterias (Raybuck, 1992).

Figura 25: Mecanismo enzimático propuesto para Trichoderma spp. durante la degradación de cianuro (Argumedo-Delira et al., 2009; Ezzi & Lynch, 2005).

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Figura 26: Degradación de Fenantreno y Pireno por Cyclothirium sp. (da Silva, Esposito, Moody, Canhos, & Cerniglia, 2004).

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Lección 23. Micorremediación con micorrizas. La micorriza es una asociación simbiótica entre grupos particulares de hongos y las plantas, los dos tipos principales son las micorrizas arbusculares (MA) y las ectomicorrizas (EM), se hará énfasis en las MA por ser las más estudiadas. Cabe señalar que debido a la biotrofía obligada de los hongos de micorriza arbuscular (HMA), los mecanismos por los cuales hacen frente a altos niveles de metales pesados (MP) se expresan prácticamente en su totalidad en el estado simbiótico, formando la micorriza arbuscular (MA). Estos mecanismos son en su mayoría muy similares a los que presentan las plantas, destacando (Figura 27)(Cornejo, Meier, & Borie, 2008; Siddiqui, Sayeed Akhtar, & Futai, 2008): (1) inmovilización en el suelo por la secreción de sustancias quelantes (reduce la toma o incrementa el flujo, formación de complejos fuera de las células, liberación de ácidos orgánicos, etc). (2) enlace de MP a los biopolímeros de la pared celular (quitina, celulosa), melaninas en las EM (Galli, Schüepp, & Brunold, 1994). (3) inmovilización sobre la superficie de la membrana plasmática una vez atravesada la pared celular. (4) transportadores de membrana que ingresan MP desde el suelo al citosol. (5) quelación intracelular por síntesis de ligandos como metalotioneínas, ácidos orgánicos, polifosfatos, aminoácidos, etc. (6) exportación de MP desde el citosol mediante transportadores de membrana. (7) confinamiento de MP en vacuolas. (8) absorción biológica via glomalina.

Figura 27: Mecanismos de tolerancia al estrés pormetales pesados desarrollado por la simbiosis MA. 86


Tanto la planta como el hongo poseen mecanismos similares: 1) quelación extracelular; 2) enlace del MP a la pared celular; 3) membrana plasmática como barrera selectiva; 4) incorporación mediante transportadores de membrana; 5) quelación en el citosol; 6) exportación por transportadores; 7) secuestro en la vacuola. Sólo el hongo presenta los siguientes mecanismos: 8) transporte de MP en las hifas; y 9) transporte a la planta a través de arbúsculos (Cornejo et al., 2008), adaptado de Göhre & Paszkowsky (2006), en los cuales se ha encontrado altas concentraciones de metales pesados (Siddiqui et al., 2008). El Cu se acumula principalmente en forma extracelular asociado al Fe, también se asocia con trazas de arsenato dentro del citoplasma en el micelio externo de Glomus mosseae; por su parte el arsenato también se puede acumular dentro del citoplasma en forma similar a los polifosfatos, lo cual indica que existen diferentes mecanismos de acumulación de Cu y Arsenato (Siddiqui et al., 2008), al igual puede suceder con otros metales. El transporte de MP a través de las hifas es favorecido por tratarse de organismos con hifas cenocíticas (sin septos o divisiones celulares claras). Por otra parte, la posible existencia de transportadores en la membrana de los arbúsculos que exportan MP hacia la matriz interfacial (zona de contacto íntimo entre la membrana plasmática del hongo y la célula radical), permitiría una mayor incorporación de MP por la planta. Esto explicaría que algunas especies de plantas micorrizadas incrementen sus contenidos de MP en la parte aérea (Ebbs & Kochian, 1998). Esta asociación es un componente clave en ecosistemas contaminados con estos elementos, como ocurre con los suelos afectados por el depósito de residuos provenientes de la minería; además, se convierte en una herramienta biotecnológica muy importante a tener en cuenta al momento de diseñar programas de fitorremediación (Cornejo et al., 2008). En suelos contaminados con altos niveles de MP, se ha observado la presencia de poblaciones naturales de HMA que generan colonizaciones micorrícicas efectivas o incluso incrementadas por altas concentraciones de Cd, Zn y Pb (Cornejo et al., 2008; Turnau, Miszalki, Trouvelot, Bonfante, & Gianinazzi, 1996). Así mismo la tolerancia de las micorrizas arbusculares y ectomicorrizas a altas concentraciones de MP se refleja en el número de esporas de HMA, colonización de raíz por HMA y EM, y la abundancia de cuerpos fructíferos de EM. En el mismo sentido el tipo de metaloide o metal pesado influye en el sentido de estas variaciones, así por ejemplo la esporulación es la mas reducida por estrés a metaloides (Al, As, Ba, Cd, Cr, Cu, Pb, Se, Sr y Zn) a largo plazo, mientras el Ni aumenta la esporulación de HMA (Siddiqui et al., 2008). Estos hechos revisten un elevado interés biotecnológico si se consideran las ventajas que la simbiosis micorrícica puede aportar en la biorremediación de suelos afectados por actividades mineras (Cornejo et al., 2008).

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Existen numerosos estudios que muestran la significativa contribución de los HMA en biorremediación. Por ejemplo, se ha observado que la micorrización confiere a las plantas una mayor capacidad de establecimiento en suelos afectados por actividades mineras (Shetty, Hetrick, Figge, & Sshwab, 1994). Esto se puede deber a la mayor velocidad de adaptación de los hongos respecto de las plantas frente a condiciones ambientales adversas (Wilkinson & Dickinson, 1995). Esto los convierte en un grupo de organismos más tolerantes a elevados niveles de MP y otras limitantes. Esta mayor tolerancia otorgada por el HMA a las plantas, incluso sin otro beneficio evidente, justificaría el uso de este tipo de hongos en biorremediación de suelos contaminados con MP, como los presentes en áreas influidas por la actividad minera (Cornejo et al., 2008). De forma más particular, se ha demostrado que plantas micorrizadas (como Avena sativa y Hordeum vulgare) extraen cantidades considerables de algunos MP (como Pb y Zn), llegando a igualar lo extraído por plantas hiperacumuladoras no micorrizables (como Brassica juncea (Ebbs & Kochian, 1998), lo que demuestra su utilidad en procesos de fitoextracción. Por otra parte, los procesos de fitoestabilización también se favorecen en plantas micorrizadas, como lo demuestran diversos estudios donde se ha observado el transporte de algunos MP (como Zn, Cd y Cu) por hifas y raíces de plantas micorrizadas de Trifolium repens y Zea mays, sin que se produzca su posterior translocación a la parte aérea. En este caso, el MP queda en el suelo, pero de formas menos disponibles para otros organismos, por lo que se reduce su toxicidad. Por lo anteriormente señalado, los HMA resultan una importante herramienta a considerar al momento de optar por el desarrollo de procesos de fitoestabilización (Leyval, Joner, Del Val, & Haselbandter, 2002). Aún sin que existiese un efecto promotor de la fitoacumulación o fitoestabilización, la formación de MA efectivas sería muy beneficioso, ya que facilitaría el establecimiento de una mayor densidad y diversidad de plantas (Pawlowska, Chaney, Chin, & Charvat, 2000), generándose así una espiral de efectos beneficiosos para el sistema suelo-planta. Además, en el caso particular de plantas bioacumuladoras, la micorrización puede incrementar su crecimiento, viéndose incrementada también la cantidad total de MP extraída desde el suelo (Cornejo et al., 2008; Khan, Kuek, Chaudhry, Khoo, & Hayes, 2000). La asociación MA se encuentra en el 80% de las plantas en el planeta y su eficiencia en cuanto a la tolerancia a los metales puede variar dependiendo factores como (Siddiqui et al., 2008; Smith & Read, 2008):  Los ecotipos de HMA (provenientes o no de suelos ricos en metales, sitios metalíferos o minas poluidas con metales pesados).  Expresión fúngica.  Producción de metalotioneinas (proteína que se une al metal).  La especie de HMA.

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Lección 24: Degradación de plaguicidas, insecticidas y organoclorados. En suelos contaminados con TNT (1,1,1-Tricloro-2,2-bis(4-clorofenil)-etano) se ha logrado aislar bacterias y hongos capaces de degradarlo, de los cuales se han identificado algunos géneros fúngicos como Alternaria, Aspergillus, Penicillium, y Trichoderma, los cuales muestran variaciones en su tolerancia hacia el TNT (Bennett, Hollrah, Waterhouseb, & Horvathc, 1995). En el caso particular de Trichoderma viride, este hongo es capaz de transformar al TNT en un 16 % en metabolitos solubles como 2,2’,6,6’-tetranitro-4,4’azoxitolueno, 4-amino-2,6-dinitrotolueno y 2-hidroxilamino-4,6- dinitrotolueno. Este hongo presenta mayor tolerancia al TNT, en comparación con Schizophyllum commune y Cladosporium resinae (Bayman & Radka, 1997). En condiciones anaerobias los grupos nitrogenados del TNT se reducen uno a uno en grupos amino; sin embargo, cada proceso de reducción es más lento y menos completo que el anterior. Si las condiciones pasan a una condición aerobia, los intermediarios parcialmente reducidos forman productos de condensación de tipo azo, que son moléculas más estables y por lo tanto más recalcitrantes, además de ser agentes mutagénicos. La ruta de degradación del TNT ha sido caracterizada a través de la actividad del hongo causante de la pudrición blanca de la madera P. chrysosporium (Fernando, Bumpus, & Aust, 1990; Spain, 1995). Algunos de los intermediarios formados durante la degradación de TNT por P. chrysosporium, también han sido reportados para T. viride (ArgumedoDelira et al., 2009; Bayman & Radka, 1997). La mayoría de los plaguicidas organoclorados como el DDT, el dieldrin y el endosulfán, son persistentes en la naturaleza, (el DDT con una vida media mayor a 100 días, aunque en algunos bosques su vida media llega a ser de 20 a 30 años; Mitra y Raghu 1998), además presentan alta toxicidad. Hongos como Phanerochaete chrysosporium, son capaces de transformar el DDT enzimáticamente al inducir la deshalogenación vía procesos aerobios (Argumedo-Delira et al., 2009; Paszczynski & Crawford, 1995), y Trichoderma es capaz de degradar los tres plaguicidas (Hay & FoCht, 1998; Snedeker, 2001). Los principales metabolitos de biodegradación de endosulfan por T. harzianum son el sulfato de endosulfán y el diol de endosulfán, que se generan por la acción de un sistema enzimático oxidativo. Lo anterior sugiere que la enzima hidrolítica sulfatasa es la responsable indirecta de la formación del diol de endosulfan (Argumedo-Delira et al., 2009; Mukherjee & Mittal, 2005). Insecticidas como forato o carbofurano (con vida media en el ambiente de 9.1 a 10.4 meses) pueden estimular o inhibir el crecimiento de especies de Trichoderma (Das, Chakravarty, Sukul, & Mukherjee, 2003). Más aún, T. viride contribuye en la degradación del herbicida triflurina (concentración inicial: 1 mg/L) en más del 90 % en aproximadamente 10 días (Zayed et al., 1983). Anderson & Domsch (1976) mencionan que 89


la degradación del herbicida arvadex (concentración inicial: 2.5 mg/L) por T. harzianum es muy lenta en cultivo líquido, ya que fue menor al 20% después de 10 días de incubación. En contraste, las especies T. harzianum y T. longipilus son sensibles al herbicida fosfinotricina a una concentración de 1 mM (Ahmad & Malloch, 1995; Argumedo-Delira et al., 2009). Los organofosforados son empleados como insecticidas, plastificantes y como armas químicas, que se caracterizan por tener alta toxicidad hacia mamíferos y que se encuentran contaminando tanto ecosistemas acuáticos como terrestres (B. K. Singh & Walker, 2006). Así, T. harzianum es capaz de utilizar el insecticida organofosforado clorpirifos como fuente de azufre y de fósforo (Omar, 1998) y también es capaz de degradar glifosato y ácido aminometil fosfórico (Argumedo-Delira et al., 2009). Una de las actividades industriales cuyas descargas causan efectos adversos sobre el medio ambiente es la industria de la celulosa (Sponza, 2003), la cual utiliza cloro y dióxido de cloro durante el proceso de blanqueo de la pulpa (Stinchfield & Woods, 1995). En este proceso se generan diversos compuestos organoclorados altamente tóxicos, entre ellos se encuentran 4,5-dicloroguaiacol, 3,4,5-tricloroguaiacol, 4-etil-2-metoxifenol, pentaclorofenol, 2,3,5,6-tetra- cloro-4-metoxifenol, eugenol, tetracloroguaiacol, 4,5,6tricloroguaiacol, hexaclorociclohexano, ácido hexadecanoico, 2-metoxifenol, 2,6dimetoxifenol, 4,5-dicloro-2-metoxifenol, por mencionar algunos (Kovacs, Gibbons, Tremblay, O´Connor, & Voss, 1995)(Gaete, Larrain, BaySchmith, Baeza, & Rodríguez, 2000). Algunas especies del género Trichoderma pueden degradar pentacloronitrobenceno y pentaclorofenol, pero no degradan al hexaclorociclohexano (Montiel et al., 2004). En este sentido, se ha demostrado que T. harzianum tiene la capacidad de degradar 2,4,6-triclorofenol, 4,5-dicloroguaiacol, 3,4,5-tricloroguaiacol, tetracloroguaiacol y otros compuestos halogenados (Argumedo-Delira et al., 2009; van Leeuwen, Nicholson, Levay, Hayes, & Mulcahy, 1997). Gran cantidad de hongos puede degradar los benzo(a)pyrenos, creciendo sobre diferentes sustratos con eficacias desde 18 a 99% en su remoción y con tiempos de incubación de 2 horas a 15 semanas; en el proceso producen metabolitos característicos de cada aislamiento fúngico (Cuadro 11). Cuadro 11: Degradación de benzo(a)pyrenos por aislamientos fúngicos (Juhasz & Naidu, 2000).

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a

Experimentos de degradación preparados con ligninasa cruda y preparada de P. chrysosporium. Experimentos de degradación preparados con lacasa cruda y preparada de T. versicolor. c Experimentos de degradación preparados con lacasa purificada de T. versicolor. d MYPD: Extracto de malta, extracto de levadura, peptona y dextrosa. e Experimentos de degradación preparados con preparaciones de manganeso peroxidasa cruda de N. frowardii. f Experimentos de degradación preparados con preparaciones de manganeso peroxidasa cruda de N. frowardii y una sustancia mediadora (5 mM de glutation). b

A los anteriormente mencionados debemos agregar hongos filamentosos como Trichoderma viride, Fusarium solani y Fusarium oxysporum, con eficacias de (50%, 58% y 30% respectivamente) los cuales son capaces de degradar los benzo(a)pirenos cuando la concentración inicial de éstos es inferior a 0.4 mM y se encuentran en condiciones controladas a 25ºC durante 30 días (Argumedo-Delira et al., 2009).

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Lección 25. Aplicaciones. Se pueden considerar tres clases de aplicación con hongos, biodegradación por hongos independientes, degradación en simbiosis micorrícica y degradación por cometabolismo; cualquiera que sea el mecanismo, la biosorción vía microbiana es más económica tanto en términos de costo de instalación como de operación y mantenimiento, pues los métodos químicos resultan costosos debido a que el agente activo no puede ser recuperado para su posterior reutilización (Argumedo-Delira et al., 2009; Cañizares-Villanueva, 2000). Aunque las bacterias poseen las rutas catabólicas para los PAHs, las cuales se presumen degradan los Benzo(a)pirenos (Bap), su degradación puede no ocurrir debido a que estos compuestos no pueden pasar la pared celular bacteriana (Hammel, 1996). Sin embargo esta limitación no aplica a hongos debido a su habilidad de producir enzimas extracelulares (enzimas degradadoras de lignina). La degradación fungica de los BaP no resulta en una significativa reducción del compuesto, sin embargo las ligninasas convierten el BaP en productos solubles al agua los cuales son mas biodisponibles (Meulenberg, Rijnaarts, Doddema, & Field, 1997) y potencialmente mas tóxicas que los productos de origen. Como la degradación de los PAHs por las bacterias está limitado por su incapacidad de hidroxilar los compuestos, la transformación inicial de los BaP por los hongos, seguido por la degradación bacteriana de los metabolitos polares puede llevar a una estrategia efectiva de bioremediación, como se ha demostrado en algunos pocos estudios. Este fenómeno también se ha observado con otros PAHs tales como pireno y Antraceno (Juhasz & Naidu, 2000; Meulenberg et al., 1997). La presencia de Elementos Potencialmente Tóxicos (EPT) puede afectar la nutrición del hongo que se refleja en el limitado crecimiento del micelio, lo cual puede ser un serio limitante para el tratamiento con hongos. Lo anterior se ejemplifica con la disminución del micelio, longitud y ramificaciones de Trichoderma viride observada en presencia de Cu y de Cd (Gadd, Ramsay, Crawford, & Ritz, 2001). Algunos estudios reportan la habilidad de T. viride para tolerar y bioacumular Cu en su biomasa; por ejemplo, (Anand, Isar, Saran, & Saxena, 2006) señalan una remoción de 3.4 mg/L en 72 h, a partir de una concentración inicial de 100 mg de CuCl2/L, señalando también que la temperatura y el pH afectan la biosorción de Cu por este hongo. Algunos EPT como el Cd (1-2 mM) además de reducir el crecimiento, también pueden inducir cambios en la diferenciación morfológica y causar mutaciones en T. viride (Frank, Támová, & Takácsová, 1993). En contraste, el crecimiento de T. viride es significativamente inhibido a concentraciones de mercurio de 1 a 5 mM, pero sin inducir mutaciones en este organismo (Argumedo-Delira et al., 2009; Frank et al., 1993). Por su parte el cianuro es liberado al ambiente en desechos sólidos y aguas residuales de las diferentes actividades industriales como el galvanizado de metales, electrolisis de aluminio, gasificación de carbón, lixiviación de minerales y en la síntesis de fármacos, 92


fibras y plásticos. El hongo Trichoderma sp. se ha empleado para la destoxificación de cianuro ya que posee dos enzimas (rodanasa y cianuro hidratasa) capaces de degradarlo (Ezzi & Lynch, 2002). Además, la adición de glucosa como una fuente de carbono alternativa al medio contaminado incrementa la velocidad de degradación del cianuro por las cepas de Trichoderma spp. (Ezzi & Lynch, 2005). Varias especies de Trichoderma tienen la capacidad de metabolizar cianuro vía rodanasa y cianuro hidratasa, pero no se ha encontrado evidencia de que utilicen la ruta de la β-cianoalanina sintetasa (Ezzi & Lynch, 2003), lo que indica que no es común encontrar esta enzima en los hongos, en comparación con plantas y algunas bacterias (Raybuck, 1992). A su vez, (Ezzi & Lynch, 2005) han demostrado que para la degradación de cianuro de potasio en el suelo (50 y 100 mg kg-1) es posible al utilizar Trichoderma spp. en combinación con plantas como alverja (Pisum sativum L.) y trigo (Triticum aestivum L.). Lo anterior denota el potencial uso de cepas del grupo Trichoderma en sistemas de fitorremediación, lo cual requiere de mayor estudio (Argumedo-Delira et al., 2009). El género Pestalotiopsis posee robusta actividad de degradación, sus microsporas son capaces de crecer sobre un poliuretano en condiciones con y sin oxigeno, esto es posible gracias a la enzima 'serina hidrolasa' la cual degrada poliuretano, una de las formas de plástico existentes en la actualidad. Las colillas de cigarrillos son basuras comunes en todo el mundo, que contaminan el ambiente y se fuman cerca de 5,6 millones de cigarrillos al año. Las sustancias contenidas en las colillas, como nicotina y alquitrán, son tóxicas para los peces tanto de agua dulce como salada, según el British Medical Journal, citado por la UNAM. Además de la contaminación del agua, los organismos marinos y terrestres, las colillas de cigarrillos permanecen hasta 10 años sin descomponerse. Con este reto en manos, los estudiantes de licenciatura en Biología en la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, perteneciente a la UNAM, colectaron las colillas de cigarrillos en la propia universidad hasta reunir 8 kilogramos. Después estudiaron la degradación por los hongos Pleurotus ostreatus y Trametes versicolor. Los hongos degradaron cerca del 18% de las colillas e incluso crecieron en el líquido resultante de la degradación. Torres Rodríguez (2003) reportó que Ouahiba et al. en el 2001 aislaron varias especies de hongos en suelos contaminados con pesticidas de Argelia. Las especies más frecuentes fueron Aspergillus fumigatus, A. Níger, A. terreus, Absidia corymberifera y Rhizopus microsporus var microsporis. 53 de las especies aisladas se destacaron por su habilidad para la degradación del herbicida metribuzin en medio líquido; simultáneamente se demostró que el herbicida promovía el crecimiento de los géneros Absidia y Fusarium, los cuales lograron eliminar el 50% del compuesto después de 5 días. Por otra parte, 31 especies pudieron eliminar el metroburon, mientras Botrytis cinerea eliminó el metroburón y el linuron casi completamente, destacandose de las otras especies (Torres Rodríguez, 2003). 93


Los hongos de pudrición blanca poseen un sistema enzimático oxidativo extracelular capaz de degradar compuestos orgánicos persistentes. Esta capacidad les permite ser utilizados en procesos de biorremediación de aguas y suelos contaminados. Sin embargo, el uso de estos hongos requiere la determinación de condiciones adecuadas para aumentar su crecimiento y expresión enzimática, en condiciones diferentes a su ambiente natural (Rubilar Araneda, 2007). Tres cepas fúngicas de pudrición blanca: Anthracophyllum discolor, Inonotus sp. y Stereum hirsutum, fueron seleccionadas, cultivadas en medio líquido con concentraciones de nitrógeno (0,2 y 1,2 g/L) y con dos fuentes de carbono (glucosa y carboximetilcelulosa), para evaluar el efecto del medio de cultivo sobre la producción de las enzimas ligninolítica: manganeso peroxidasa, lignina peroxidasa, versátil peroxidasa y lacasa (MnP, LiP, VP y lacasa) y posteriormente ser usadas en la remoción de PENTACLOROFENOL (PCF) adicionado en concentraciones de 50 y 100 mg/L (Rubilar Araneda, 2007). En el medio con glucosa y con 0,2 g/L de nitrógeno se encontraron las mejores producciones enzimáticas por A. discolor, así mismo una elevada remoción de PCF (90% con 50 mg/L y 40% con 100 mg/L), después de 37 días de incubación. Llevando estos resultados a condiciones de campo, se evaluó el efecto de la aplicación de diferentes materiales lignocelulósicos (paja de trigo, granos de trigo y viruta de madera) en el crecimiento de A. discolor. Se evaluó la biorremediación de suelo contaminado con PCF (250 y 350 mg/kg) utilizando A. discolor y P. chrysosporium, colonizado en granos de trigo (Rubilar Araneda, 2007). Los granos de trigo utilizados como soporte lignocelulósico permitieron un mayor crecimiento y colonización por A. discolor. Así mismo, la aplicación de los hongos A. discolor y P. chrysosporium inmovilizados en granos trigo favoreció la propagación de los hongos en el suelo y por lo tanto la remoción del PCF (70-85%). La aplicación de granos de trigo en el suelo no inoculado, permitió la proliferación de microorganismos degradadores de PCF. Por otro lado, se observó un efecto sinérgico entre la microflora autóctona y A. discolor incrementando la remoción de PCF en los suelos. El pH del suelo influyó en la adsorción de PCF, siendo más elevada en suelos ácidos (Umbrisol). Además, los suelos ácidos redujeron la actividad de la enzima MnP de A. discolor, afectando la degradación de PCF. Los hongos de pudrición blanca A. discolor presenta gran potencial para ser utilizado en procesos de biorremediación de suelos y aguas contaminadas con compuestos orgánicos persistentes (Rubilar Araneda, 2007). Finalmente los hongos formadores de micorriza arbuscular y sus plantas asociadas han sido empleadas para la remoción de residuos de plomo (Alvarado, Dagubta-Schubert, Ambriz, Sánchez-Yañez, & Villegas, 2011), para la recuperación de suelos contaminados 94


por actividad minera (Cornejo et al., 2008) y de suelos y aguas contaminados con hidrocarburos de petróleo (Ferrera-Cerrato et al., 2006).

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CAPÍTULO 6. PLANTAS (FITOREMEDIACIÓN). Lección 26. Introducción. Ante la diversidad de organismos para bioremediación, se ha abierto las puertas a organismos cuyo tamaño pueden hacer mas eficiente el proceso de descontaminación y pueden aprovechar la energía del sol para apoyar el proceso, en este sentido se han encontrado plantas con capacidad de bioremediación, con sus limitantes y beneficios, pero que abre las perspectivas para poder incluirlas para los tratamientos mixtos que incluyen tanto plantas como microorganismos. La fitoremediación es el uso de plantas para contener, remover o neutralizar compuestos orgánicos, metales pesados o compuestos radioactivos. Hay muchas especies vegetales que tienen capacidades bajas o medias de acumular metales y contaminantes peligrosos, las cuales se encuentran como habitantes en las zonas intervenidas y con problemas de derrames, pero adicionalmente existen plantas con una gran capacidad para acumular metales pesados, denominadas hiperacumuladoras, con capacidades cercanas a 10 veces la capacidad de las tolerantes. Estas especies puede acumular Cd, As, Co, Cu, Cr, Ni y Pb, entre otros contaminantes. La fitoremediación usa las plantas para limpiar ambientes contaminados debido a la capacidad que tienen algunas especies vegetales para absorber, retener, o eliminar concentraciones altas de diversos tipos de contaminantes como metales pesados, compuestos orgánicos o radioactivos. Este tipo de uso vegetal en la limpieza de ambientes contaminados es un enfoque novedoso e interesante, debido a que constituye una técnica de biorremediación basado en el uso de plantas verdes y sus microrganismos asociados, así como el manejo de suelos y técnicas agronómicas que permitan la mejor absorción de los elementos contaminantes. La técnica de la fitoremediación (phyto = planta y remediación = mal, por corregir) es un proceso que se realizar in-situ o ex-situ. Existen varios mecanismos de fitoremediación: rizodegradación, fitoxtracción, fitodegradación y fitoestabilización (Agudelo Betancur et al., 2005; Steven, 2005). Las estrategias empleadas por las plantas para resistir los efectos tóxicos causados por los metales pesados, se relacionan con diferentes mecanismos como el establecimiento de enlaces entre los metales y la pared celular; el nivel de tolerancia por la membrana celular hacia los metales; reducción del transporte por la membrana celular; flujo activo de metales desde las células hacia el exterior; el nivel de tolerancia de las enzimas vegetales hacia los metales; la acumulación o compartimentación del exceso de metales en órganos 96


sub-celulares como las vacuolas; la quelación del metal por ligandos orgánicos y/o inorgánicos, y la precipitación del metal al formar compuestos de baja solubilidad (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). Los resultados de la técnica de la fitorremediación se han valorado como positivos y por lo tanto su aplicación en la recuperación de suelos contaminados es cada vez mayor. Es una alternativa especialmente atractiva en medios con bajo riesgo, donde los contaminantes estén limitados a la zona radicular y donde no haya fuertes contrastes climáticos (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). Cuando la planta ha realizado su función de acumulación de contaminantes, son cosechadas y desechadas; sin embargo, si sus moléculas finales son inocuas como el dióxido de carbono no requieren ser desechadas en su disposición final. De acuerdo a lo establecido por Agudelo Betancur y colegas, (2005); existen varias limitaciones que se debe considerar para la aplicación de la fitoremediación: 1. El tipo de plantas utilizado, ya que determina la profundidad a tratar. 2. La concentración de los contaminantes: altas concentraciones de contaminantes pueden resultar tóxicas. 3. La estación climática en la que se haga el procedimiento. 4. La toxicidad y biodisponibilidad de los productos de la degradación no siempre se conocen y pueden movilizarse o bioacumularse en los animales que las consuman. La incineración controlada es el método más común para disponer las plantas que han absorbido cantidades grandes de contaminantes. Este proceso produce cenizas, que se pueden desechar en los sitios destinados para tal fin (Agudelo Betancur et al., 2005). Ventajas de la fitoremediación:  Las plantas suelen ser utilizadas como bombas extractoras de bajo costo para depurar suelos y aguas contaminadas.  Algunos procesos degradativos ocurren en forma más rápida con plantas que con microrganismos.  Es un método apropiado para descontaminar superficies grandes o para finalizar la descontaminación de cualquier área. Limitaciones de la fitoremediación:  El proceso se limita a la profundidad de penetración de las raíces o aguas poco profundas.  La fitotoxicidad es un limitante en áreas fuertemente contaminadas.  Los tiempos del proceso pueden ser muy prolongados.  La biodisponibilidad de los compuestos o metales es un factor limitante de la captación. 97




Se requiere comprender mejor la naturaleza de los productos de degradación (fitodegradacion).

Las anteriores características son complementadas en el Cuadro 12. Cuadro 12: Ventajas y desventajas de la fitoremediación (Delgadillo-López et al., 2011).

Para la descontaminación de elementos tóxicos en suelos se han empleado las técnicas de fitoextracción y fitoestabilización o fitoinmovilización (Carpena & Bernal, 2007) Para una guía completa de referencias que se pueden revisar en cuanto a fitoremediación se puede recurrir a la (EPA, 2000) y a libros un poco mas actualizados como (Walker, 2007).

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Lección 27. Metabolismo. La capacidad de metabolismo de las plantas verdes, en especial las plantas arbóreas, les permiten sintetizar, modificar y degradar una gran y mayor cantidad de moléculas. Es especialmente relevante en las fitoalexinas, ya que inhibe la germinación de esporas y el desarrollo del micelio en hongos patógenos, rompiendo la pared celular. De hecho, las reacciones que permiten crear nuevos enlaces intra e intermoleculares C-O, han sido descritas en el metabolismo de benzofenonas y bencilisoquinolinas, respectivamente, siendo catalizadas por citocromos P-450. La existencia en plantas arbóreas de un metabolismo secundario capaz de sintetizar y modificar compuestos aromáticos (Cuadro 13), cuya estructura es la base de contaminantes orgánicos de primer nivel, abre la puerta a la identificación de enzimas capaces de modificar y probablemente degradar xenobióticos. Cuadro 13: Ejemplos de plantas que fitodegradan contaminantes orgánicos (DelgadilloLópez et al., 2011).

Algunos compuestos orgánicos son utilizados por los microrganismos como fuente de carbono (Viñas, 2005). Los compuestos alifáticos se degradan fácilmente por oxidaciones sucesivas, en cambio los compuestos aromáticos se degradan luego de la ruptura del anillo. El orden decreciente de biodegradación es generalmente: n-alcanos > isoprenoides > aromáticos de bajo peso molecular > cicloalcanos > poliaromáticos > moléculas polares (Delgadillo-López et al., 2011; Leahy & Colwell, 1990).

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Otro tema importante es la atracción electrostática que existe entre las cargas eléctricas que generan las raíces de las plantas con las cargas opuestas de las partículas coloidales que les permiten adherirse a las superficies de las raíces, donde son absorbidas y transportadas a las partes aéreas donde las metaboliza o volatiliza. La metabolización de los compuestos orgánicos en las plantas se realiza en tres pasos (Delgadillo-López et al., 2011):  Fase I: Involucra la conversión/activación de los compuestos orgánicos lipofílicos (Komives & Gullner, 2005).  Fase II: Permite la conjugación de los metabolitos de la fase I a una molécula hidrofílica endógena como los azúcares, aminoácidos y glutationa (Dietz & Schnoor, 2001).  Fase III: Promueve la compartimentalización de los compuestos orgánicos modificados en las vacuolas o formación de enlaces con los componentes de la pared celular. Los mecanismos de tolerancia a los compuestos orgánicos varían entre las distintas especies de plantas y se determinan por el tipo de metal, eficiencia en la absorción, traslocación y secuestro. La incorporación y acumulación de estos metales pesados se resume en tres fases que son:  Fase I: Inicia con el transporte de los metales pesados al interior de la planta, y luego, al interior de la célula. La raíz tiene cargas negativas en sus células, por contener grupos carboxilo que interaccionan con las cargas positivas de los metales pesados, creando un equilibrio dinámico que facilita la entrada hacia el interior celular (Delgadillo-López et al., 2011).  Fase II: Los metales pesados ya ubicados en el interior de la planta, son secuestrados o acomplejados mediante la unión a ligandos específicos.  Fase III: Involucra la compartimentalización y detoxificación, proceso por el cual, el complejo ligando-metal queda retenido en la vacuola. Mecanismos usados por las plantas a. Micorrizas: Las plantas micorrizadas presentan una mayor tolerancia a los metales pesados, gracias a la capacidad para inmovilizar los metales en la raíz, impidiendo que éstos pasen a la parte aérea de la planta (Navarro-Aviño et al., 2007). El hongo restringe el movimiento del metal a las raíces de la planta de diversas maneras, según el tipo de hongo, de planta y de metal. Además favorece la acumulación, por lo que es una alternativa en la fitoremediación. En general, los procesos de las micorrizas en la fitoremediación son: absorción/adsorción de metales pesados en el hongo, reducción del acceso de los metales pesados al apoplasto por hidrofobia, quelación de los metales pesados con 100


exudados del hongo (Navarro-Aviño et al., 2007). b. Protección de la membrana plasmática: El metal produce efectos específicos a la membrana plasmática, según su tipo; generando daños mediante varios mecanismos: oxidación y entrecruzamiento de proteínas (conteniendo grupos tiol); inhibición de proteínas de membrana que son esenciales; cambios en composición y fluidez de los lípidos de membrana y cambios en la permeabilidad. La membrana genera mecanismos de reparación que mantienen su integridad utilizando proteínas de choque término como método de protección; mejorando los mecanismos de homeóstasis del metal incorporado; promoviendo un influjo reducido y un eflujo selectivo de manera metabólica. c. Compartimentalización vacuolar (Navarro-Aviño et al., 2007): El eflujo de iones y el transporte al interior de la vacuola son dos formas diferentes de conseguir el mismo objetivo: reducir la concentración de metales tóxicos en el citoplasma. El eflujo de iones no confirma que el problema de la toxicidad esté resuelto; el transporte a la vacuola si lo garantiza, ya que se forman complejos de alto y bajo peso molecular, reafirmando que el procesamiento y almacenamiento es complejo y debe ser estudiado mas a fondo. d. Biotransformación (Navarro-Aviño et al., 2007): Se denomina biotransformación al conjunto de procesos metabólicos por los cuales los tejidos incrementan la polaridad de un tóxico o la transformación química de un compuesto en un organismo. Al incrementar la polaridad aumenta la di fusibilidad del tóxico y por lo tanto puede incrementar la velocidad de excreción. La función es convertir un xenobiótico no polar en un compuesto soluble en agua. La biotransformación se divide en dos fases:  

Fase I: Biotransforma los xenobióticos convirtiéndolos en substratos de las enzimas, haciéndolos más hidrófilos. Fase II: Agrega un grupo polar de tamaño relativamente grande a los productos de las reacciones de la fase anterior.

e. Mejora de la entrada y acumulación de metales pesados en plantas (Navarro-Aviño et al., 2007): Para lograr que una planta acumule más metales se tiene que estudiar la secuencia de acontecimientos que permiten la mayor acumulación del tóxico, a saber: 1. Transporte: Entrada y salida de metales pesados al interior de la planta y de la célula. 2. Quelación: Secuestro de los metales contaminantes mediante la unión a ligandos específicos. 101


3. Compartimentalización: El complejo ligando-metal queda retenido en una vacuola. 4. Biotransformación: Conjunto de reacciones de descomposición, conjugación o síntesis implicadas en el correcto procesamiento de los contaminantes. 5. Mecanismos de reparación celular: Respuesta celular al deterioro sufrido por el metal tóxico, restableciendo sus características iniciales. Se debe asegurar que el metal no produzca un efecto tóxico importante. El daño no se producirá si el metal fluye de una manera rápida por la raíz y los tejidos. Luego se debe disponer del complejo ligando-metal en vacuola, porque el metal sigue siendo tóxico mientras no se deposite en este organelo. Después se incrementa el transporte ya que el metal será adecuadamente dispuesto. Finalmente quedan los procesos de biotransformación y los mecanismos de reparación celular.

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Lección 28. Clases. Existen varias clases de fitoremediación, se muestran los aspectos más importantes de cada una de ellas. A. FITOESTABILIZACIÓN.

Figura 28: Esquema de la fitoacumulación (EPA, 2000). Permite inmovilizar contaminantes en el suelo a través de su absorción y acumulación en las raíces, o por precipitación en la rizósfera (lugar donde están las raíces); reduciendo la movilidad de los contaminantes y evitando su migración a aguas subterráneas o al aire (Barton et al., 2005; Mendez & Maier, 2008)(Figura 28). En otras palabras, reduce la biodisponibilidad de los contaminantes en el entorno, mejorando las propiedades físicas y químicas del medio (Carpena & Bernal, 2007). La fitoestabilización es más efectiva en suelos de textura fina con alto contenido de materia orgánica (Padmavathiamma & Li, 2007), es de menor costo, fácil de aplicar y estéticamente agradable. Con este método se han tratado lagunas de deshecho de yacimientos mineros y aguas residuales (Arias Martínez, Betancur Toro, Gómez Rojas, Salazar Giraldo, & Hernández Ángel, 2010). B. RIZOFILTRACIÓN.

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Figura 29: Esquema del proceso de rhizofiltración (EPA, 2000), Utiliza las plantas para eliminar del medio hídrico contaminantes a través de la raíz (Dushenkov, Kumar, Motto, & Raskin, 1995) Se cultivan de forma hidropónica. Cuando el sistema radicular está bien desarrollado, las plantas se introducen en el agua contaminada con metales, donde la raíz los absorbe y acumula. Cuando las raíces se saturan, las plantas se cosechan y se disponen para su disposición final (Figura 29). La rizofiltración está indicada para aguas contaminadas con cadmio, cobalto, cromo, níquel, mercurio, plomo, selenio, zinc, isótopos radiactivos y compuestos fenólicos. C. FITOEXTRACCIÓN O FITOACUMULACIÓN.

Figura 30: Esquema del proceso de fitoextracción y fitoacumulación (EPA, 2000). Es la absorción de metales contaminantes mediante las raíces de la planta y su acumulación en tallos y hojas (Figura 30). En este método se deben seleccionar las plantas más adecuadas para el tipo de contaminante presente y sus características de emplazamiento. Estas plantas se siembran y se permite que completen su desarrollo vegetativo, luego de lo cual se cortan y se incineran, eliminando sus cenizas en un vertedero de seguridad. Esta acción de puede repetir indefinidamente hasta que la concentración de metales en el suelo este dentro de los límites aceptables (Kumar, Dushenkov, Motto, & Raskin, 1995). 104


D. FITOVOLATILIZACIÓN.

Figura 31: Esquema del proceso de fitovolatilización (EPA, 2000). Se produce simultáneamente al proceso en el cual árboles y otras plantas en crecimiento absorben agua con contaminantes orgánicos e inorgánicos. Estos contaminantes pueden llegar hasta las hojas y evaporarse o volatilizarse en la atmósfera en bajas concentraciones por medio de la transpiración (Figura 31). De esta manera se han eliminado elementos volátiles como el benceno, tolueno y m-xileno, reconocidos compuestos orgánicos tóxicos. También funciona para eliminar contaminantes del aire. La fitovolatilización se ha realizado en aguas residuales agropecuarias, aguas con mercurio, selenio y solventes clorados.

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E. FITODEGRADACIÓN.

Figura 32: Esquema del proceso de fitodegradación (EPA, 2000). Las plantas y los microrganismos asociados a ellas degradan los contaminantes orgánicos en productos inofensivos o los mineraliza hasta llegar a CO2 y H2O. En este proceso los contaminantes son metabolizados dentro de los tejidos vegetales y las plantas producen enzimas que ayudan a catalizar la degradación (O. V. Singh & Jain, 2003). Torres Delgado & Zuluaga Montoya (2010) lo presentan como el proceso mediante el cual las plantas toman el contaminante y lo metabolizan transformándolo en un material sin riesgos para el medio natural (Figura 32). Esta técnica se ha empleado para eliminar explosivos como el TNT, DNT, RDX y pesticidas organoclorados y organofosforados, entre otros (Hannink et al., 2001), aguas residuales agropecuarias, solventes clorados, DDT, fenoles, nitrilos, etc. (Arias Martínez et al., 2010).

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F. RIZODEGRADACIÓN.

Figura 33: Esquema del proceso de rhizodegradación (EPA, 2000). También llamada biodegradación de la rizósfera, fitoestimulación o bioremediación asistida, es la disminución de contaminantes en el suelo por medio de la actividad microbiana por la presencia de rizosfera, siendo un proceso más lento que la fitodegradación. Los microrganismos consumen y digieren sustancias orgánicas para su nutrición y energía (Figura 33). La rizodegradación se lleva a cabo en el suelo que rodea a las raíces. Las sustancias excretadas naturalmente por éstas, suministran nutrientes para los microrganismos, mejorando así su actividad biológica. Algunos microrganismos consumen sustancias orgánicas como combustibles o solventes que son peligrosos para los humanos y los degradan a productos inofensivos por medio de la biodegradación. G. FITOINMOVILIZACIÓN. Provoca la sujeción y reducción de la biodisponibilidad de los contaminantes mediante 107


la producción de compuestos químicos en la interfaz suelo-raíz, los que inactivan las sustancias tóxicas por procesos de absorción, adsorción o precipitación (Carpena & Bernal, 2007; Delgadillo-López et al., 2011). En resumen, son 6 los mecanismos que pueden utilizar las plantas para la fitoremediación, los cuales pueden usarse independientemente o pueden ser utilizados simultáneamente Cuadro 14. Cuadro 14: Mecanismos de fitoremediación (Delgadillo-López et al., 2011). Proceso Fitoestabilización

Mecanismo Complejación

Fitoextracción Fitovolatilización

Hiperacumulación Volatilización a través de las hojas Acumulación en la rizosfera Uso de plantas y microorganismos asociados para degradar contaminantes Uso de raíces para absorber y adsorber contaminantes del agua.

Fitoinmovilización Fitodegradación

Rhizofiltración

Contaminantes Orgánicos e inorgánicos. Inorgánicos Orgánicos e inorgánicos. Orgánicos e inorgánicos Orgánicos.

Orgánicos e inorgánicos.

Al proceso por el cual la concentración de contaminantes del suelo se reduce a niveles tolerables a través de la acción de las plantas se le denomina FITODESCONTAMINACIÓN y comprende: - Fitoextracción. - Fitovolatilización. - Fitodegradación. Lección 29. Procesos involucrados en la fitoremediacion. La toma de una decisión de si usar o no una técnica de fitoremediación como una opción viable es indicado por un conjunto de pasos (EPA, 2000). 1. Definir el problema, conduciendo una caracterización e identificando el problema: medios/contaminantes, los requerimientos de la entidad reguladora, identificar los 108


2.

3.

4.

5.

objetivos de la remediación, establecer criterios para definir el éxito de un sistema de fitoremediación. Obtener información del sitio.  Localidad (también la información relacionada a la vegetación propia de la zona).  Temperatura: promedio y rango.  Precipitación: cantidad y periodicidad.  Longitud del periodo de crecimiento.  Cantidad de sol y sombra.  Textura, salinidad, pH, fertilidad del suelo, contenido de agua, estructura, etc.  Forma del contaminante y concentración.  Consideraciones o características propias del sitio.  Identificación de las plantas que crecen en la sección contaminada del sitio (provee una idea de las plantas a seleccionar).  Identificar las cosechas y plantas locales (brinda una idea de las plantas a seleccionar). Identificar criterios importantes para la selección de las plantas.  General: Resistencia a enfermedades, tolerancia al calor y frío, tolerancia a insectos, sequia, sales, a las condiciones químicas, condiciones de estrés, seleccionar si leguminosa o no, si plantas anuales, bimensual o perenne.  Requerimientos de cultivo: debido a que las plantas se someten a una nueva condición de estrés, las condiciones de cultivo y mantenimiento han de ser cuidadosamente monitoreados, como tratamiento de semillas antes de la germinación, método de siembra, irrigación, control de pH del suelo, fertilización, protección contra plagas y enfermedades, hojas caídas y residuos, requerimientos para cosecha, la labor y costos no deben ser excesivos.  Metabolicas: Características tóxicas, invasivas o indeseables, fuente de las semillas, tasa de establecimiento, tasa y método de reproducción, tasa de crecimiento, efectos alelopáticos o competitivos, valor de la planta como cosecha.  Relacionados con la fitoremediación (Cuadro 15): Eficacia demostrada de la planta, fitotoxicidad del contaminante, tipo y forma de la raíz, profundidad de la raíz, profundidad y distribución del contaminante, especies deciduas o no, monocultivo Vs cultivos mixtos, plantas nativas Vs no nativas, temporada de crecimiento, esterilidad (masculino o femenino), rotación de plantas, tecnología de fitoremediación mas adecuada. Comparar los anteriores criterios con la lista de plantas propuestas y disponibles  Seleccionar todos los candidatos apropiados (eliminar plantas no apropiadas).  Desarrollar una evaluación detallada de los criterios de las plantas restantes.  Realizar un análisis de costo-beneficio de las principales plantas.  Realizar estudios preliminares para valorar la germinación, sobrevivencia y biomasa. Seleccionar las plantas e implementar la fitoremediacion ( 109


6. Cuadro 16).  Diseñar y construir el sistema.  Mantener y operar el sistema.  Monitorear y evaluar el crecimiento de las plantas y el éxito de la fitoremediación.  Reevaluar la selección de especies basado en las observaciones.  Realizar una medición cuantitativa.  Resembrar y replantar conforme sea necesario con la misma o diferentes plantas.  Conocer los criterios de éxito. Cuando se planea cualquier sistema de remediación, es importante primero definir el objetivo de remediación deseado: el destino que se desea para los contaminantes y la concentración que se desea al final. Una tecnología de remediación adecuada o diferentes tecnologías como parte de un tratamiento pueden ser seleccionados, basados en las características y desempeño de una tecnología en miras a alcanzar las metas. Cuadro 15: Tecnologías de fitoremediación aplicables a diferentes tipos de contaminantes1,2 (EPA, 2000). Tecnología Medio Solventes clorinados Metales Metaloides Municiones No metales Nutrientes PAHs PCBs PCP Pesticidas Hidrocarburos de petróleo Radionucleotidos Surfactantes 1

Fitoextracción Rizofiltración Fitoestabilización Rizodegradación Fitodegradación Suelo Agua Agua Suelo Suelo Suelo Agua T F G F F F F F T F (Se) T G G F T F3

G T G

F

F

G F T F F F

Fitovolatilización Suelo Agua T T T (Hg) G F (Se)

F/F

F F

F

T T

G T

La aplicabilidad de un método de fitoremediación en particular para cada tipo de contaminante ha sido juzgado en el momento de aplicación, este es indicado por las siguientes convenciones: T – La aplicación está en estado teórico. G – La aplicación ha de ser investigada en invernadero o laboratorio. F – La aplicación ha de ser investigada usando cuadrantes de campo o ha de ser aplicada a sistemas de campo a escala completa. 2 Todos los contaminantes pueden ser controlados usando coberturas vegetales. La cobertura vegetal, corredores riparios, zonas de transición o buffer y el control hidráulico no son incluidos en la tabla porque pueden ser considerados combinaciones de otras tecnologías de fitoremediación. 3 En humedales construidos

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Cuadro 16: Parámetros de monitoreo una vez implementada la fitoremediación, adaptado de EPA (2000). Parámetro Datos climáticos Temperatura. Precipitación. Humedad relativa. Radiación solar. Dirección y velocidad del viento. Plantas Características visuales (viabilidad, síntomas de estrés, daño por insectos o animales, crecimiento, masa foliar, etc.). Composición de tejidos (Raíces, tallos, hojas). Gases transpirados. Tasa de transpiración. Densidad de raíces. Suelo Parámetros geoquímicos (pH, concentración de nutrientes, contenido de agua y oxígeno, etc.). Poblaciones microbianas. Contaminantes y grado de rompimiento de los éstos.

Aguas subterráneas. Información de acuíferos (dirección y tasa de flujo, profundidad). Contaminantes y grado de rompimiento de los éstos.

Razones de monitoreo Mantenimiento de los requerimientos de irrigación. Determinar el balance de agua y las tasas de evapotranspiración.

Mantenimiento (remplazo de plantas, fertilizantes, aplicación de pesticidas, etc.). Cuantificar contaminantes y subproductos. Cuantificar y/o predecir la operación del sistema.

Optimizar el crecimiento de la parte aérea o radical de la planta o de los microorganismos. Determinar el balance hídrico y las tasas de evapotranspiración. Cuantificar contaminantes y subproductos. Cuantificar y/o predecir la operación del sistema. Cuantificar contaminantes y subproductos. Cuantificar y/o predecir la operación del sistema.

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Lección 30. Aplicaciones. La fitoremediación es un método para el tratamiento de aguas y suelos contaminados con sustancias tóxicas que permite su remoción de acuerdo al tipo y tiempo del método usado. Se conocen alrededor de 400 especies de plantas con capacidad para hiperacumular selectivamente alguna sustancia. Por lo general son plantas conocidas. El girasol (Heliantus annus) es capaz de absorber grandes cantidades de uranio depositado en el suelo. Los álamos absorben niquel, cadmio y zinc. Otras posibles fitoremediadoras que están en estudio son la alfalfa, la mostaza, el tomate, la calabaza, el esparto, el sauce y el bambú (EPA, 2000). Se han utilizado plantas con hongos de micorriza arbuscular para la extracción de plomo de sitios de alta concentración de este metal pesado, principalmente por el mecanismo de fitoestabilización y fitoextracción del suelo (Alvarado et al., 2011). El boletín docente “El cuaderno de por qué Biotecnologia” (Consejo Argentino para la Información y el Desarrollo de la Biotecnología” indica ejemplos en laboratorio y campo sobre experimentos con la técnica de la fitoremediación: Encontraron que el geranio tolera más la contaminación por Ni y Pb mientras la mostaza es más tolerante al Cd. El método de rizofiltración fue usado para la extracción de uranio de aguas subterráneas de Asthabula, Ohio, USA. Tambien fue usada a nivel de cultivo in vitro para detoxificar compuestos fenólicos en aguas contaminadas en la Universidad Nacional de Rio Cuarto, Córdoba por el grupo de investigación de la Dra. Elizabeth Agostini. Se ha logrado la fitovolatilización de Hg por medio de plantas transgénicas que fueron transformadas por dos genes provenientes de microrganismos que pueden transformar el mercurio iónico en mercurio más estable. Haciendo uso también de plantas transgénicas de tabaco con genes provenientes de bacterias que le permiten detoxificar TNT y GTN, se han encontrado resultados positivos en suelos minados. En conclusión, la fitoremediación es una alternativa novedosa, eficiente y con costos menores en relación a los tratamientos convencionales de remoción de contaminantes tóxicos. Se puede realizar tanto en medios acuáticos como terrestres y ofrece variedad de opciones de acuerdo al tipo de contaminante, al tipo de planta usado como fitoremediador y al método de remoción de dicho material.

112


Se conocen alrededor de 400 especies de plantas con capacidad para hiperacumular selectivamente alguna sustancia. En la mayoría de los casos, no se trata de especies raras, sino de cultivos conocidos. Así, el girasol (Heliantus anuus) es capaz de absorber en grandes cantidades el uranio depositado en el suelo. Los álamos (género Populus) absorben selectivamente níquel, cadmio y zinc. También la pequeña planta Arabidopsis thaliana de gran utilidad para los biólogos es capaz de hiperacumular cobre y zinc. Los costos de la implementación de técnicas de fitoremediación implican considerables reducciones y ahorros, sin embargo es poco generalizado su uso dado el desconocimiento de las precisiones requeridas para cada especie vegetal y las condiciones de campo, en el Cuadro 17, se detallan algunos costos comparativos entre el tratamiento convencional y con fitoremediación.

Cuadro 17: Ejemplo de métodos de remediación. Comparación de costos, tomado de Delgadillo-López et al. (2011). Como algunos ejemplos puntuales se puede citar al área de Edgewood en Maryland (EPA, 2000) en el cual un suelo contaminado con Tricloroetileno a concentración de 170 ppm, fue tratada con Populus tricocarpa X deltoides (conocido como Poplar híbrido), se sembró un área de 1 acre y se logró la descontaminación en abril de 1996. En el procedimiento se midió el crecimiento de las plantas por medio de observaciones visuales (diámetro, altura, salud, reproducción y remplazo), también la zona bajo tierra mediante análisis en el cual se determinó contaminantes volátiles, metales y nutrientes. El suelo fue muestreado para evaluar la actividad de biodegradación y los derivados volátiles contaminantes; el muestreo de tejidos fue analizado en cuanto a degradación de los productos absorbidos y el contenido de compuestos volátiles. Adicionalmente se valoró el flujo de sabia para ser correlacionado a los datos meteorológicos y se realizó un muestreo y análisis de los gases transpirados mediante varios métodos para medir la tasa de evapotranspiración de tricloroetileno en forma de vapor.

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El costo de instalación de cada árbol fue aproximadamente 80 dólares o aproximadamente 15000 dólares por 184 árboles, el costo de monitoreo fue altamente variable debido a las numerosas técnicas de monitoreo empleadas. La fitoremediación usando árboles para limpiar aguas contaminadas con compuestos orgánicos volátiles fue la decisión ideal para el sitio debido al bajo costo, bajo mantenimiento y bajo impacto asociado con la tecnología. En el sitio Carswell de Fort Worth, Texas (EPA, 2000) fue realizado un experimento para evaluar la capacidad de biodegradación de Populus deltoides (algodón de madera del este) en comparación a especies de Populus traídas y probadas. En un terreno de una hectárea (Figura 34) contaminada a nivel subsuperficial con Tricloroetileno en 1996 se sembraron los árboles, dejando como testigo algunos árboles de la misma especie en zonas vecinas y hacia donde no se movilizaba el TCE. Al cabo de 16 meses se observó una reducción substancial de la contaminación, con el inconveniente de que las tasas de transpiración dependían mucho de la época del año y por lo tanto los tratamientos eran mas efectivos en los meses de verano cuando las hojas habían alcanzado su máximo tamaño.

Figura 34: Diseño experimental en Carswell (Forth Texas), tomado de EPA (2000).

Cuadro 18: Costo estimado de la fitoremediación en el sitio Carswell. 114


Los costos son un poco elevados (Cuadro 18) debido a la innovación de la tecnología de monitoreo. Los costos finales del proyecto no están dados en el documento consultado, pero están alrededor del 10 al 20% del tratamiento mecánico.

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UNIDAD 3 Nombre de la TÉCNICAS DE BIOREMEDIACIÓN. Unidad CAPÍTULO 7

ATENUACIÓN NATURAL

Lección 31

Introducción.

Lección 32

Parámetros de diseño.

Lección 33

Funcionamiento.

Lección 34

Posibles costos.

Lección 35

Parámetros de monitoreo y seguimiento.

CAPÍTULO 8

BIOESTIMULACIÓN.

Lección 36

Introducción.

Lección 37


Lección 38

Funcionamiento.

Lección 39

Posibles costos

Lección 40


CAPÍTULO 9

BIOAUMENTACIÓN

Lección 41

Introducción.

Lección 42


Lección 43

Funcionamiento.

Lección 44

Posibles costos.

Lección 45


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UNIDAD 3. TÉCNICAS DE BIOREMEDIACIÓN. Una vez se conocen los conceptos básicos acerca de bioremediación, del suelo, el agua y se han logrado diferenciar los términos que se usan en bioremediación del significado que puede tener en otras disciplinas del conocimiento, se cuenta con el esqueleto sobre el que se pueden basar los procesos de bioremediación. El conocimiento de los xenobióticos fue explorado en detalle, para conocer su origen, clasificación, toxicidad, permanencia y consecuencias de su presencia, de esta manera se posee los criterios para poder diferenciar diferentes contaminantes, los cuales son báses para saber como estos pueden ser degradados por entes biológicos o como pueden ser afectados por éstos. Luego se conocieron los organismos con capacidad de degradar xenobióticos, los procesos metabólicos que subyacen el proceso de degradación de éstos y se conoció la especificidad y eficiencia de cada organismo con respecto a los contaminantes; todo esto fue confirmado con ejemplos particulares, lo que indica que se comprendido la importancia de los aspectos bióticos, por lo tanto se poseen las herramientas para poder comprender las diferentes técnicas involucradas en la bioremediación. Finalmente la presente unidad muestra una integración entre aspectos bióticos, químicos, físicos, ambientales e ingenieriles en búsqueda de dar solución a los problemas de contaminación por xenobióticos. Solo se pretende mostrar tres de las técnicas mas usadas, como son la atenuación natural, la bioaumentación y la bioestimulación, así mismo se muestra elementos importantes a tomar en cuenta para la selección de uno u otro y la forma como se puede planear su implementación.

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CAPITULO 7: ATENUACIÓN NATURAL. Lección 31. Introducción. La atenuación natural aprovecha recursos naturales para contener la contaminación causada por derrames de productos químicos y reducir la concentración y la cantidad de contaminantes en los lugares afectados. Conocida también como medidas correctivas intrínsecas, bioatenuación o biocorrección intrínseca, es un método de tratamiento in-situ, o sea que se dejan los contaminantes donde están mientras se produce la atenuación natural. Con frecuencia se utiliza la atenuación natural como parte de la limpieza de un sitio donde también se recurre al control o la extracción de la fuente de contaminación. La atenuación natural es un método de bioremediación que puede ser utilizado eficazmente en ambientes contaminados específicos. La bioremediación puede ser efectiva para un amplio rango de hidrocarburos del petróleo, siendo de más rápida la degradación de los solubles en agua, de cadena corta y bajo peso molecular que los compuestos de cadena larga, alto peso molecular y menor solubilidad. La bioremediación puede ser in-situ o ex-situ. La bioremediación in-situ busca estimular y crear un ambiente favorable para el crecimiento microbiano a partir de los contaminantes (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008). Dentro de los métodos in-situ se encuentra la forma aerobia, anaerobia y cometabólica. La aeróbica es mas eficiente para reducir niveles de contaminantes alifáticos e hidrocarburos aromáticos del petróleo. Los métodos anaeróbico y cometabólicos son a menudo usados para la remediación de otros compuestos como solventes clorados (Manacorda & Cuadros, 2005). Los métodos o técnicas más usados en la bioremediación in-situ son la bioestimulación, bioventeo y bioaumentación. Los métodos ex-situ incluyen biodegradación, landfarming, compostaje, biopilas y biorreactores. Habitualmente la bioremediación es usada como un paso posterior a la limpieza por medios físicos o mecánicos de la parte más palpable del vertido o bien directamente sobre determinados residuos. Para implementar un programa de bioremediación se requiere un estudio de bioviabilidad que debe contar con las siguientes fases (Rodríguez Gallego & Sánchez Martín, 2003): a. Revisión bibliográfica, para obtener datos sobre la biodegradabilidad de los contaminantes del emplazamiento y sobre la existencia de casos similares (Head & Swannell, 1999). 118


b. Estudios iniciales, para obtener parámetros ambientales de importancia: nutrientes, presencia de aceptores de electrones, potencial redox, pH, temperatura, etc. (Gallego, Loredo, Llamas, & Sánchez, 2001a; B. Vallejo, Izquierdo, Blasco, Pérez del Campo, & Luque, 2001). c. Muestreo detallado, para analizar los microrganismos autóctonos, la densidad de las poblaciones biodegradadoras y su potencial enzimático (Gallego, Loredo, Llamas, & Sánchez, 2001b; Röling et al., 2002). d. Estudios de laboratorio y a escala piloto, que permitan evaluar las diferentes alternativas de bioremediación (Head, 1998; Rodríguez Gallego & Sánchez Martín, 2003; Skladany & Baker, 1994). e. Evaluaciones permanentes a lo largo de un tiempo prolongado para mantener un monitoreo de la eficiencia de la bioremediación y proponer medidas adicionales en caso de ser necesario. El estudio previo de los parámetros de degradación en el laboratorio es una fuente muy valiosa para su aplicación posterior en el campo (Pritchard, 1997; Rodríguez Gallego & Sánchez Martín, 2003). La capacidad intrínseca de asimilación de un medio depende de las capacidades metabólicas de los microorganismos, del tipo de contaminante y de la bioquímica e hidrogeografía de la zona (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008). Durante el desarrollo del proceso de bioremediación, la monitorización juega un papel clave en la evaluación de la efectividad del trabajo, con el objeto de evaluar la desaparición del contaminante con el tiempo y la disminución del riesgo para el medio receptor (Rodríguez Gallego & Sánchez Martín, 2003; Shannon & Unterman, 1993). La técnica de la atenuación natural se aplica en aquellos casos en los que exista contaminación tanto en suelos como aguas subterráneas producidas por hidrocarburos halogenados y no halogenados. Entre los factores que influyen en la eficacia y viabilidad de esta técnica se destacan: a) la exigencia de protección y el riesgo de los potenciales receptores durante el tiempo que dura la atenuación, b) la existencia de unas condiciones geológicas y geoquímicas favorables, c) las necesidades de reducción de la masa contaminante en un intervalo razonable de tiempo (meses a años), tanto en la superficie del suelo como en la zona más subsuperficial del mismo, asi como de la calidad de las aguas subterráneas, d) confirmación de la existencia de los tipos y números de poblaciones de microrganismos que puedan biodegradar los contaminantes, e) producción y conservación en el medio de subproductos de carácter persistente o más tóxicos que los iniciales, durante y después de la atenuación natural, f) no existencia de producto libre en flotación sobre el nivel freático, g) para condiciones aerobias la condición ambiental óptima de concentración de oxígeno disuelto en el agua debe ser superior a 0,5 mg/L., h) el potencial redox debe estar situado entre un rango de -400 y 800 mV, i) que se produzca una dilución suficiente para que la concentración se vea disminuida aguas abajo del foco contaminante, j) la dispersión de los contaminantes aguas 119


abajo del foco y en la dirección del flujo debe ser adecuada para que exista una mayor disponibilidad y proporción entre los contaminantes y los aceptores de electrones (Corona-Ramírez & Iturbe-Argüelles, 2005). Los procesos de atenuación natural a menudo se clasifican en destructivos y no destructivos. Los procesos destructivos destruyen el contaminante. Los procesos no destructivos no destruyen el contaminante, sino que reducen su concentración. Estos procesos pueden reducir la masa del contaminante (por medios de procesos destructivos tales como biodegradación y transformaciones químicas), reducir su concentración (mediante dilución o dispersión) o unir los contaminantes a partículas de tierra a fin de que la contaminación no se propague o no se extienda demasiado (adsorción) (EPA, 1996). La biodegradación o biocorrección es un proceso en el cual los microorganismos naturales – levaduras, hongos o bacterias - descomponen o degradan sustancias peligrosas, transformándolas en sustancias menos tóxicas o inocuas, principalmente dióxido de carbono y agua en caso de la biodegradación aerobia. Una vez degradados los contaminantes, la población de microorganismos disminuye porque ha agotado su fuente de alimentos. Los microorganismos muertos o una población pequeña de microorganismos sin alimentos no presentan riesgo de contaminación. Ciertos microorganismos pueden digerir sustancias orgánicas, como combustibles o solventes, que son peligrosas para los seres humanos; la biodegradación también puede descomponer solventes clorados, como tricloroetileno en aguas subterráneas. Cuando los compuestos clorados se biodegradan, es importante que la degradación sea completa porque algunos productos de la descomposición pueden ser más tóxicos que los compuestos originales (EPA, 1996).

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Lección 32. Parámetros de diseño. La atenuación natural (AN) es un método activo centrado en la confirmación y la vigilancia de procesos de corrección natural. Los hidrocarburos móviles y tóxicos son buenos candidatos para la atenuación natural; no sólo son difíciles de atrapar debido a su movilidad, sino que también se encuentran entre los contaminantes que más fácilmente se destruyen con la biodegradación. La atenuación natural es un método no invasivo, la superficie del suelo puede seguir usándose mientras se produce la atenuación natural en el subsuelo. Para calcular el resultado que dará la AN y cuanto tardará se necesita un estudio pormenorizado del lugar contaminado; la atenuación natural no es una opción apropiada para cualquier lugar debido a que los procesos naturales generalmente son lentos. Se necesita una vigilancia a largo plazo para comprobar que la concentración de contaminantes disminuya continuamente y lo suficiente para que no se convierta en una amenaza para la salud (EPA, 1996). Como la eficacia de la AN como método de limpieza depende de diversas condiciones, es necesario caracterizar bien el sitio a fin de determinar si se está produciendo o se producirá atenuación natural. Los suelos con gran cantidad de materia orgánica, como las zonas pantanosas o antiguos pantanos, con frecuencia son aptos para la atenuación natural. Hay muchos factores que pueden limitar o impedir la AN en un medio como: a) la ausencia de elementos esenciales para los microorganismos, b) ausencia de aceptores adecuados, generalmente oxigeno, c) ausencia de poblaciones microbianas con el potencial enzimático adecuado para degradar los contaminantes, d) presencia de componentes tóxicos en la mezcla contaminante (Corona-Ramírez & Iturbe-Argüelles, 2005). El diseño y aplicación de los sistemas de biotratamiento comprende varias fases (Maroto Arroyo & Rogel Quesada, 2001): 1. Investigación y Caracterización de la contaminación y del emplazamiento. Para realizar el diseño del biotratamiento se debe hacer un estudio exhaustivo de la caracterización del emplazamiento y del tipo y concentración de la contaminación existente. Dicha caracterización se lleva a cabo mediante el estudio del mismo detallando la volumetría del suelo a tratar, las condiciones geológicas e hidrogeológicas, analizando las características del suelo y sus propiedades. La caracterización del contaminante se centrará en la investigación del tipo y concentración del mismo, así como la biodisponibilidad de los compuestos del suelo. 121


2. Análisis y elección de las medidas biocorrectivas. Luego de la investigación inicial, se pasa al análisis y elección de las medidas biocorrectivas más adecuadas. Para esto se debe tener en cuenta lo siguiente: a. Identificar y cuantificar los contaminantes: Propiedades físico-químicas, identificación y clasificación de los compuestos, concentración en suelos y aguas subterráneas, caracterización de la presión de vapor, constante de Henry, densidad y grado de solubilidad del contaminante. b. Conocer los factores que influyen en la transformación biológica de los contaminantes: Factores ambientales y microbiológicos. c. Designar las medidas biocorrectivas: En función de los factores estudiados, elegir el sistema de bioremediación más adecuados. 3. Diseño y evaluación del sistema. Es necesario establecer unas etapas de trabajo que determinen los parámetros fundamentales para la eficacia del diseño. Estas etapas son: a. Evaluación de la viabilidad de la técnica. b. Evaluación del diseño. c. Evaluación del control y seguimiento. 4. Control y Seguimiento. Para una correcta optimización se deben controlar los siguientes puntos: a. Control de las condiciones de degradación y biodegradación. b. Control de los parámetros que afectan directamente en el funcionamiento del sistema. 5. Análisis e Interpretación de resultados. En esta última etapa se analizan los resultados obtenidos, haciendo un balance entre los objetivos alcanzados y los propuestos inicialmente. En este punto, si es necesario, se deben proponer y estudiar mejoras o modificaciones necesarias para la optimización del sistema. Procesos de Atenuación Natural Monitoreada: La Atenuación Natural Monitoreada (ANM) es un método de limpieza o remediación del sitio cuidadosamente controlado y monitoreado, se usa en combinación con el control de la fuente de contaminación. En la práctica se debe demostrar que la pluma de contaminación no alcanzará ningún lugar de impacto ambiental y que los procesos de remoción están ocurriendo activamente, siempre protegiendo la salud humana. De acuerdo a Field, (2005) los procesos que intervienen en la ANM (Figura 35) son: a. Biodegradación: es la parte más importante de la atenuación natural, ya que causa la remoción total de los contaminantes tóxicos. 122


b. Adsorción: La adsorción del contaminante a las partículas del suelo retardará y reducirá la posibilidad de que el contaminante alcance a llegar a lugares de impacto ambiental. c. Dispersión y Dilución: A medida que la pluma del contaminante se mueve la concentración del contaminante será menor debido a la dispersión. Se recomienda ver detalladamente el video asociado (Video), en el cual se observa lo que puede suceder con la dispersión del contaminante y su concentración a medida que se dispersa en el suelo y se aleja de la fuente. d. Reacciones químicas: Son reacciones no biológicas que transforman al contaminante. e. Volatilización: Las pérdidas por volatilización son consideradas mayormente como otras formas de dilución.

Figura 35: Procesos presentes en la atenuación natural (Field, 2005). Para que la ANM sea un método de bioremediación eficaz se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: 1. Información específica requerida del sitio: datos históricos de la química del agua subterránea y/o suelo, datos hidrogeológicos y geoquímicos, estudios de campo y de microcosmos. 2. Tiempo estimado razonable: uso actual, potencial y futuro del agua subterránea afectada, relatividad del tiempo estimado de uso del acuífero, aceptación pública de la remediación a largo plazo, confiabilidad de los controles de monitoreo e institucionales. 3. Condiciones necesarias: humedad (50-80%), temperatura (> 5oC requerida para biodegradación significante), pH (6.5 a 8.5), disponibilidad de oxígeno, nutrientes, aceptores de electrones alternativos, donadores de electrónes, potencial redox (> 50mV aeróbico, < 50mV anaeróbico). 4. Evidencia de atenuación natural: evidencia geoquímica (disminución del contaminante en el campo, incremento de la población microbiana, cambios en los aceptores de electrones, evidencia de isótopos) y estudios de microcosmos. 123


Lección 33. Funcionamiento. Cuando el medio ambiente se halla contaminado con sustancias químicas, la naturaleza las elimina por cuatro vías: 1. Acción bacteriana: las bacterias que viven en el suelo y en las aguas subterráneas utilizan algunas sustancias químicas como alimento. Cuando las sustancias químicas están completamente digeridas, las transforman en agua y en gases inofensivos. 2. Sorción: las sustancias químicas se pegan o sorben al suelo, que las fija al lugar. De ese modo no se eliminan las sustancias químicas pero si se impide que contaminen las aguas subterráneas y que escapen del lugar. 3. Mezcla y dilución: la contaminación se puede mezclar con el agua limpia, diluyendo la contaminación. 4. Evaporación: algunas sustancias químicas, como el petróleo y los solventes, se evaporan, lo que significa que se convierten de líquidos a gases dentro del suelo. Además, si esos gases escapan al aire en la superficie del terreno, la luz del sol puede destruirlos. Tomando en cuenta las consideraciones necesarias para realizar el proceso de atenuación, uno de los elementos mas importantes y críticos a considerar es asegurar proveer las características adecuadas para el desarrollo de los microorganismos degradadores, entre estas características se encuentra el contenido de oxígeno, el cual se debe asegurar a lo largo del proceso en especial cuando la contaminación es por hidrocarburos. Según Pérez & Saval (2007) las bacterias degradadoras de diesel inoculadas no sobreviven en el suelo al parecer por la falta de nutrientes y oxígeno, lo que indica que el control de los parámetros en la bioaumentación y en las compostas debe manejarse con mucho cuidado para lograr los objetivos de bioremediación deseados. Un aspecto importante es proveer desde el inicio y a lo largo del proceso los nutrientes adecuados en la cantidad necesaria, la ausencia de los contenidos de nitrógeno, fósforo necesarios para el crecimiento microbiano, la relación C: N: P debe ser 100:10:1, la adición de nutrientes es clave para garantizar que los microorganismos logren realizar los procesos metabólicos que sustentan la biorremediación. La adición de nutrientes debe realizarse en base a un análisis previo ya que una sobreexposición puede inhibir el proceso y provocar contaminación del suelo; por otro lado puede haber una pérdida de nutrientes por la adsorción del suelo o procesos paralelos. De acuerdo a los resultados de A. J. Acuña, Pucci, & Pucci (2008) en suelos deficientes de nitrógeno en la Patagonia, es posible la degradación de hidrocarburos siempre y cuando los tiempos de tratamiento sean más prolongados que en aquellos que se realiza una fertilización con nitrógeno. El nitrógeno necesario para el proceso será obtenido por los microorganismos del suelo por fijación biológica. 124


En el trabajo de Garcia, Roldán, & Garzón (2011) se encontró que el empleo de sales inorgánicas simples (SIS) estimularon más el metabolismo microbiano en comparación a los fertilizantes inorgánicos compuestos (FIC), lo cual posiblemente esté relacionado con el efecto inhibitorio generado por la acumulación de amoniaco, limitando el crecimiento de la población degradadora. Algunos sistemas recuperados con AN se recuperan más efectivamente que otros, lo cual parece estar asociado al material parental, la presencia de piritas como material constituyente del suelo. Soler, Otero, Mencio, Mas-Pla, & Torrento (2006) han mostrado que la biodegradación funciona de una manera significativa a partir de la oxidación de las piritas, abriendo nuevas perspectivas en cuanto a su uso en barreras permeables reactivas. La ANM funciona con mayor eficacia en los sitios donde se ha eliminado previamente la fuente de contaminación. Dado que se realiza bajo tierra, no es necesario excavar ni construir. Por lo tanto, no es necesario eliminar desechos enterrándolos, por lo que se afecta menos el medio ambiente al evitar el contacto con la contaminación, siendo usada en derrames de petróleo y gasolina de los tanques. La técnica de tipo landfarming (Figura 37), aprovecha la superficie donde se ha realizado el vertimiento, luego de hacer la remoción de éste, las operaciones principales son, en primer lugar, la promoción de la humificación de manera controlada, mediante la adición de materia orgánica al suelo, y en segundo lugar, el incremento del metabolismo de los microorganismos mediante la agregación de fuentes de carbono de pequeño peso molecular, fácilmente asimilables por los microorganismos, así como otros nutrientes; los procesos bioquímicos que realizan los microorganismos a cada proceso en el transcurso de la ANM se pueden observar en la Figura 36. Se trata de proporcionar poco nitrógeno como nutriente, ya que de esta forma los microorganismos se verán obligados a degradar los contaminantes, utilizándolos como fuente de nitrógeno (Cortón & Viale, 2006).

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Figura 36: Rutas comunes de biodegradación (ITRCWG & RTDF, 1999).

Figura 37: Técnica de Landfarming, modificado de (EPA, 1994a). La atenuación natural se está usando para limpiar la contaminación causada por fugas de petróleo de depósitos subterráneos en todo Estados Unidos. Ha sido uno de los métodos de limpieza de 73 lugares con agua subterránea contaminada, siendo algunos de estos sitios vertederos municipales e industriales, refinerías y centros de reciclaje. 126


En Estados Unidos, al emplear la AN, en un sitio con presencia de aguas contaminadas con Tricloroetileno (TCE), se pudo aevaluar su movimiento subterráneo desde su lugar de origen hasta el punto de entrada al lago Michigan. En el predio se encontraron concentraciones de TCE superiores a 200.000 microgramos por litro, pero cuando la estela llegó a la orilla del lago Michigan, contenía mil veces menos TCE. La estela tardó alrededor de 20 años en llegar desde la fuente de contaminación hasta el lago Michigan, dando suficiente tiempo a los microorganismos naturales que están en el agua subterránea para destruir el TCE sin intervención externa. De hecho, los microorganismos estaban destruyendo alrededor de 270Kg de TCE por año (EPA, 1996).

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Lección 34. Posibles costos. Son pocos los estudios comparativos encontrados en diferentes fuentes bibliográficas a pesar de realizarse estudios comparativos cuando se van a proponer diferentes alternativas de tratamiento, por lo tanto la información se restringe a algunos pocos casos. La atenuación natural puede ser menos costosa que otras opciones dirigidas para el tratamiento de bioremediación, ya que no requieren una fuente de energía ni equipo especial, como otros tratamientos que se usan para el agua subterránea (Olguin, Hernández, & Sánchez-Galván, 2007). De acuerdo con los diferentes estudios que se han realizado, la atenuación natural es un proceso largo, lento generada por organismos autóctonos degradadores de petróleo y ha demostrado su efectividad en manglares, pantanos y suelos limosos y arcillosos antes que en los arenosos; ya que la permeabilidad permite poco desplazamiento de los contaminantes. La atenuación natural monitoreada requiere menos equipamento y trabajo que la mayoría de otros métodos y por lo tanto resulta más económico (Cuadro 19). Puede que la supervisión durante años sea costosa, pero el costo sigue siendo menos que el de otros métodos de biocorrección. Tratamiento in-situ Enjuague de suelo Bioremediación Fitoremediación Tratamiento ex-situ Excavación y trasporte a vertedero Disposición en un vertedero Incineración o pirólisis Lavado de suelo. Bioremediación Solidificación Vetrificación

Costos (Dólares por m3) 50-80 50-100 10-35 30-50 100-500 200-1500 150-200 150-500 100-150 hasta 250

Cuadro 19: Costos comparativos de diferentes tecnologías de remediación por unidad de suelo, adaptado de Adriano (2001). Por otro lado, aún no existen estudios que especifiquen claramente las ventajas de las diversas opciones de biorremediación en términos de costos. Sin embargo, es posible prever que la opción de aireación a gran escala puede ser muy costosa y que 128


prácticamente es preferible la opción de labranza manual para favorecer la aireación de capas poco profundas del suelo de manglar (Olguin et al., 2007). Limitando la visión sólo a los grandes trazos, puede decirse que a las ventajas que la ANM presenta (menor cantidad de residuos, ausencia de riesgos asociados al traslado de equipos, materiales y residuos, menor intrusión de estructuras superficiales, menor costo potencial asociado a actividades de remediación, etc.), se contrapone la dificultad de caracterización de cada situación específica, por el número y tipo de factores a tener en cuenta, la incertidumbre asociada a los datos experimentales (algunos de difícil obtención) y las predicciones que de éstos se implican. Hay que sumar, además, el costo y tiempo de la mayor cantidad de análisis y monitoreos que involucra, en relación con otras alternativas de remediación activas (Mateu, 2008). En una comparación realizada por (ITRCWG & RTDF, 1999) entre la atenuación natural y otras tecnologías de remediación con respecto a una fuente con solventes clorinados se encuentran detalles como:  Asumiendo el costo de 20 pozos.  La restauración completa.  El largo tiempo de restauración.  El 3% de inflación.  El impuesto del 12%. Incluyendo todos los costos asociados al sistema de atenuación natural por un periodo de 30 años y mostrados en la tabla 4 del mismo documento (ITRCWG & RTDF, 1999), el costo estimado es de U$ 908.300, mientras que el sistema con bombas el costo es de U$ 2134.000, dando una diferencia de U$ 1225.700, lo cual confirma los menores costos de la atenuación natural. Siempre ha de considerarse la contraparte a los bajos costos en la atenuación natural, como lo son la extensión del proceso de recuperación a años y el monitoreo asociado por el mismo periodo de tiempo, el cual depende en muchas ocasiones de la voluntad de seguimiento por parte de las instituciones encargadas, por el periodo estimado.

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Lección 35. Parámetros de monitoreo y seguimiento. La decisión de emplear la ANM como remedio debe ser adecuadamente soportada en una exhaustiva caracterización del sitio específico: ya que es necesario que esta sea más compleja y detallada que cuando se trata de aplicar un método activo. También se requiere la obtención de elementos adicionales, por ejemplo: evaluar las contribuciones de la sorción, la dilución y la dispersión a las aguas subterráneas contaminadas (Mateu, 2008). Una evaluación cuantitativa de la masa contaminante, el flujo del agua subterránea incluyendo caminos preferenciales, la distribución del contaminante entre fases y la partición entre suelo y agua, suelo y gas, y las tasas de transformación biológica y no biológica, además de saber cómo todos estos factores varían con el tiempo, son también necesarios para una adecuada decisión acerca de la viabilidad de la ANM (Mateu, 2008). El monitoreo consiste en la caracterización inicial del sitio y/o material a remediarse, debe de realizarse un monitoreo de por lo menos un muestreo con los respectivos análisis cada 6 meses y una caracterización final una vez concluidos los trabajos (Orosco Verdezoto & Soria Guano, 2008), el cual muchas veces no se sabe cuando será. Los marcos temporales requeridos para la ANM son a menudo más largos que los requeridos para otros remedios activos, lo que incrementa la incertidumbre asociada a las determinaciones de las tasas de atenuación, y a todo aquel factor sobre el cual deba ser efectuada una predicción a futuro (Mateu, 2008). Se determinan la mineralización y se mide el contenido de hidrocarburos, se deben hacer recuentos bacterianos al inicio y final del experimento, para esto se deben realizar siembras periódicas en medios de cultivo selectivos, en las cuales se determinarán las UFC/g suelo de bacterias heterótrofas e hidrocarbonoclastas. Los aislamientos bacterianos que crecen en cultivo utilizando el diesel como única fuente de carbono deben ser caracterizados por métodos bioquímicos y moleculares (Arrieta Ramírez, 2011); también se debe determinar el contenido de nitratos, nitritos y amonio de manera semanal (A. J. Acuña et al., 2008), y se deben medir variables de control como humedad, tempratura, pH y potencial redox (Arrieta Ramírez, 2011). Diferentes factores deben ser puestos en consideración como la clasificación del recurso afectado, el tiempo estimado en que el recurso tenga un determinado uso; condiciones subsuperficiales que pueden llegar a afectar en el largo plazo otros recursos cercanos; determinación de las masas de contaminantes y los análisis predictivos (Mateu, 2008). Existen múltiples métodos para evaluar los procesos de biorremediación, entre los que se encuentran: Métodos no moleculares: 130


     

               

Cultivo y número más probable de organismos con actividad catalitica (NMP). Patrones de utilización de sustrato (BIOLOG). Respirometría (metabolismo aeróbico). Evaluación del potencial redox (metabolismo anaeróbico). Análisis de biomasa (acido muriámico para bacterias, ergosterol para hongos). Análisis de la formación de sub productos, metabolitos o desaparición de sustratos en el terreno, aguas contaminadas y/o percolados de pilas de biorremediación. Uso de técnicas de análisis químico: Predicción de biodegradabilidad mediante modelos (QSBRs): Acidos grasos de los fosfolípidos (PLFAs). Enzimas en suelo (deshidrogenasas, lipasas, ureasas, fosfatasas ácidas y alcalinas). Métodos inmunoquímicos: (Elisa para el contaminante, inmunofluorescencia directa). Metodos moleculares: Razón rDNA/rRNA 16S (RNA aumentado en condiciones de alto metabolismo). PCR / microarreglo para genes catabólicos especie específicos. Biosensores. Métodos analíticos para estimar el grado de biorremediación. Mecanismos mixtos de remediación abióticos +bióticos. Reacciones químicas o procesos físicos que complementan los procesos de biorremediación. Reacciones de fenton en hongos ligninolíticos. Fotocatálisis mediada por TiO2. Oxidación por Ozono, Permanganato, Ion ferrato (FeVI) . Reacción de Fenton: Fe2+ + H2O2 ----> Fe3+ + .OH + OHFe3+ + H2O2 ----> Fe2+ + .OOH + H+ Adición: OH + C6H6 ----> (OH)C6H6. Abstracción de hidrogeno: OH + CH3CH2OH ----> CH2CH2OH + H2O. Transferencia de electrones: OH + [Fe(CN)6]4- ----> [Fe(CN)6]3- + OH. Interacción con otros radicales: OH + OH ----> H2O2.

Durante todo el desarrollo del proceso de biorremediación, la monitorización juega un papel clave en la evaluación de la efectividad del trabajo, con el objeto de evaluar la desaparición del contaminante con el tiempo y la disminución del riesgo para el medio receptor (Shannon & Unterman, 1993). En este sentido es necesario distinguir entre la desaparición de contaminantes por fenómenos físicos o químicos y por la acción biológica, para lo cual se aplican diversos procedimientos, como el análisis de biomarcadores (Bragg, Prince, Harner, & Atlas, 1994; Rodríguez Gallego & Sánchez Martín, 2003).

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Para asegurar la correcta ejecución y un progreso adecuado del tratamiento se debe llevar a cabo un plan de control y seguimiento del sistema, los cuales se pueden observar en la Figura 38.

Figura 38: Diagrama de flujo para evaluar la implementación de la atenuación natural, adaptado de ITRCWG & RTDF, (1999). 132


Y para una correcta optimización se deberán controlar los siguientes puntos: 1. Control de las condiciones de degradación y biodegradación. Se registrará la variación de concentración de TPH, BTEX, COV’s, CO2 desprendido y oxígeno disuelto, variación de nutrientes (N, P, etc). 2. Control de los parámetros que afectan directamente en el funcionamiento del sistema (Arrieta Ramírez, 2011). No debe desestimarse que la necesidad de controles y monitoreos de largo plazo implican voluntad institucional firme y estable para su mantenimiento durante largo tiempo y, por sobre todo, la provisión de los recurso económicos para su realización (Mateu, 2008).

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CAPÍTULO 8. BIOESTIMULACIÓN.

Lección 36. Introducción La bioestimulación así como la bioaumentación son métodos de bioremediación que implican la circulación de oxígeno a través del suelo contaminado, para mejorar la biodegradación de contaminantes orgánicos o la inmovilización de contaminantes inorgánicos (Van Deuren, Wang, & Ledbetter, 1997). En muchos trabajos se requiere que ambos métodos sean utilizados de forma simultánea o intercalada, brindando los mejores resultados de degradación de contaminantes, sin embargo hay situaciones en donde solo uno de ellos es necesario o adecuado para descontaminar el suelo o agua. En actividades como el compostaje es una de estas situaciones particulares, donde se adicionan los contaminantes a degradar en conjunto con el suelo, sustrato vegetal o materia orgánica, cal, lo que constituye una bioestimulación, pero adicionalmente se adicionan mezclas de microorganismos con el potencial de poder degradar los contaminantes agregados, por lo tanto se está haciendo bioaumentación. En este caso es necesario realizar ambos procesos para que se realice el compostaje, la diferencia radica en los microorganismos utilizados, los cuales pueden ser generalistas o adicionados con aislamientos especializados en la degradación de los contaminantes agregados. Otro caso muy común es el landfarming o labranza del terreno, en la cual lo más común es el arado del suelo con el fin de brindar oxígeno a la flora autóctona del suelo, en algunas ocasiones con retroexcavadoras para hacer una labor mas profunda, en este caso se puede hablar de una bioestimulación, sin embargo se encuentran reportes en literatura donde para mejorar el proceso se adicionan nutrientes como N y P al suelo con el fin de estimular la degradación de los contaminantes por la flora nativa. Actualmente con miras a mejorar el proceso se ha optado por dos alternativas para la adición de microorganismos, la primera es obtener los organismos nativos y cultivar aquellos que presenten el potencial de degradación, o la segunda es agregar microorganismos alóctonos con capacidad reconocida de degradación de los contaminantes; cualquiera sea el caso se procura hacer la bioaumentación con el fin de acelerar o mejorar los procesos biodegradativos. En el capítulo 9 referente a la bioaumentación se hará más énfasis en los procesos de compostaje y labranza de terreno “landfarming”, dando lugar a que en el presente capítulo se haga énfasis en algunos procesos más específicos de aplicación de la técnica de bioestimulación. La bioestimulación es un método de bioremediación in-situ, que implica la circulación de soluciones acuosas que contengan nutrientes y/o oxígeno a través del suelo contaminado, 134


para estimular la actividad de los microorganismos autóctonos y mejorar asi la biodegradación de contaminantes orgánicos o la inmovilización de contaminantes inorgánicos in-situ (Van Deuren et al., 1997). La bioestimulación no es un método recomendable para suelos arcillosos, altamente estratificados o demasiado heterogéneos, ya que pueden provocar limitaciones en la transferencia de O2. Otros factores que pueden limitar su aplicación, incluyen: a) Que el tipo de suelo no favorezca el crecimiento microbiano. b) El incremento en la movilidad de los contaminantes. c) La obstrucción en los pozos de inyección provocada por el crecimiento microbiano. La bioestimulación puede favorecer que los procesos se realicen de forma más acelerada que con otros métodos de bioremediación como la atenuación natural, de tal forma que en periodos prolongados los resultados pueden ser los mismos con diferentes procedimientos, haciendo que la bioestimulación haga más rapidos los procesos como se ha demostrado por V. Vallejo, Salgado, & Roldan, (2005) con los hidrocarburos totales de petróleo, en un estudio realizado en la Universidad Javeriana sede Bogotá. La bioaumentación también se ha usado con éxito para remediar suelos contaminados con gasolinas, Compuestos Orgánicos Volátiles, Compuestos Orgánicos Solubles y pesticidas (Alexander, 1994); incluso estudios a escala piloto, han mostrado la biodegradación de suelos contaminados con desechos de municiones. También se ha demostrado su eficiencia en el tratamiento de aguas subterráneas contaminadas con hidrocarburos, derivados de petróleo, pesticidas, disolventes, conservantes de la madera y otros químicos contaminantes.

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Lección 37. Parámetros de diseño La bioestimulación requiere para su diseño los siguientes estudios iniciales: A. Caracterización general del área: Comprende entre otros la topografía, hidrogeología, las características climáticas, características edáficas del suelo, características microbiológicas, procedencia y composición del residuo. La entrega de nutrientes depende de las características hidrogeológicas del terreno: Terrenos compactos, rocosos, impermeables así como fracturas en la superficie disminuyen distribución de nutrientes. B. Caracterización fisicoquímica y edafológica del suelo: Los parámetros edáficos que determinan y condicionan la elección de un suelo para landfarming son la textura, estructura, pH, temperatura, porosidad, velocidad de percolación, capacidad de retención de agua, infiltración, contenido de oxígeno, contenido de macro y micronutrientes, y humedad (María Graciela Pozzo Ardizzi, Ferrari, & Calderón, 2010). C. Caracterización microbiológica: Se debe estudiar la compatibilidad residuo-población microbiana autóctona. 1) Microorganismos nativos con el hidrocarburo como única fuente de carbono. 2) Microorganismos alóctonos de suelos empetrolados, en medio mínimo y con gasoil como única fuente de carbono. 3) Microorganismos de preparación comercial (alóctonos), en medio mínimo y con gasoil como única fuente de carbono. 4) Microorganismos nativos, en medio mínimo y con emulsión inversa pura como única fuente de carbono. 5) Microorganismos nativos con medio mínimo desarrollado con agua extraída del pozo y gasoil como fuente de carbono. 6) Microorganismos nativos, en medio mínimo desarrollado con agua destilada y con gasoil como fuente de carbono. D. Monitoreo y evaluación del biotratamiento: 1) El seguimiento, control y eficiencia del laboreo mecánico permiten visualizar en escala macroscópica la marcha del bioproceso. 2) El registro de parámetros climáticos, ayuda a la toma de decisiones respecto a ciertas acciones de manejo, por ejemplo frecuencias a intensidades de riego. 3) Los resultados de las pruebas fisicoquímicas y microbiológicas que se obtienen en los monitoreos, reflejan en escala microscópica la eficiencia del laboreo y permiten corregir acciones. El plan de monitoreo debe realizarse respecto al sistema suelo- microorganismos – residuo: 136


a) Seguimiento superficial del bioproceso, es decir en el sector de suelo de los primeros 20 a 30cm, donde se realiza el tratamiento biológico del residuo. b) Seguimiento del proceso en el perfil del suelo. E. Modificación del ambiente para estimular el crecimiento o la actividad de bacterias ya existentes: la adición de nutrientes y aceptores de electrones (fósforo, nitrógeno, oxígeno o carbono) por medio de una inyección de aire en forma de burbujas o como peróxido de hidrogeno soluble. En los lugares de clima frio donde la temperatura del agua es baja, el uso de calefactores sobre el terreno ayuda a aumentar la temperatura del suelo y la tasa de degradación. Cuando la fuente de contaminación es profunda o cuanto la contaminación no solo es superficial sino principalmente a unos cuantos metros de la superficie del suelo, las consideraciones anteriores tienen ciertos cambios. En algunos casos la mayor parte del residuo de hidrocarburos en el sitio contaminado se encuentra en la zona vadosa del suelo, en el margen de capilaridad e inmediatamente por debajo de la tabla de agua, en estas circunstancias el aire a presión se inyecta por debajo de la tabla de agua y a medida que va llenando los poros desplaza el agua de la matriz del suelo y con ella los contaminantes (Figura 39), proceso que generalmente es conocido como bioventeo. Los compuestos que presentan baja presión de vapor difícilmente se volatilizan por lo que su desaparición se le atribuye a la biodegradación incentivada por el bioventeo. El proceso de bioventeo estimula la actividad biológica in-situ y promueve la biorremediación (Manacorda & Cuadros, 2005).

Figura 39. Proceso de bioremediación in-situ de agua y suelo. http://superfund.pharmacy.arizona.edu/toxamb/c4-3-2-2.html 137


Generalmente debe ser aplicado en zonas vadosas y es aplicado para aquellos químicos que son biodegradados aeróbicamente, aunque en principio se ha utilizado para sitios contaminados con petróleo. Es uno de los métodos considerado de mayor costo-beneficio para la remediación de la zona vadosa. El excesivo calcio, magnesio o hierro en el agua subterránea puede reaccionar con el fosfato, el cual es suministrado como un nutriente en la forma de tripolifosfato, o con el dióxido de carbono (producido por los microorganismos en la respiración aeróbica). Los productos de estas reacciones pueden afectar negativamente la operación de un sistema de biorremediación in-situ. Cuando el calcio, magnesio o hierro reaccionan con el fosfato o el CO2, se forma sarro o cristalina precipitada; produciendo una compresión en los canales de flujo, pudiendo dañar los equipos (por ej: pozos de inyección). Además los precipitados de fosfatos de calcio o de magnesio unidos a compuestos fosforados no se encuentran disponibles por los microorganismos para ser usados como nutrientes (Manacorda & Cuadros, 2005). El oxígeno introducido como aceptor de electrones, puede reaccionar disolviendo el Fe(II) a una forma insoluble del mismo (oxido férrico), este precipitado puede ser dispuesto en el flujo de canales del acuífero, reduciendo su permeabilidad y dejando pozos de inyección inoperables; entonces, el manejo de O2, nutrientes y régimen de agua es fundamental para contener hidráulicamente a la zona contaminada y prevenir la migración de contaminantes móviles o de metabolitos potencialmente tóxicos fuera del sistema.

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Lección 38. Funcionamiento

Como funciona la bioestimulacion? Básicamente es la aplicación de oxígeno y los nutrientes necesarios para la que la microbiota funcione mejor que procesos como la atenuación natural monitoreada. Pero la conveniencia de aplicación de éstos depende de una evaluación previa de las condiciones del sistema, en donde se determina los principales contaminantes y su concentración, la presencia de microorganismos con la capacidad degradadora de estos contaminantes y su concentración en el sustrato, la presencia de los nutrientes básicos para su crecimiento y las proporciones de éstos con respecto al contaminante, los niveles de oxígeno en el sustrato contaminado y finalmente la actividad biodegradadora in-situ, dadas las condiciones actuales del sistema. Para realizar la bioestimulación se deben seguir los siguientes pasos: 1) Realizar un estudio para determinar si la adición de nutrientes es la tecnología apropiada para el vertido y la zona, si lo es, entonces. 2) Aplicación de nutrientes. 3) Realizar estudios adicionales para evaluar las técnicas de aplicación de nutrientes. 4) Poner en marcha un programa de larga duración para monitorizar la zona tratada. 5) Evaluar el potencial de utilización de microorganismos en la zona. Por lo general se usan nutrientes aplicados de liberación lenta, solubles en agua aplicados en forma de briquetas y granulares o con aspersores y con nutrientes oleofilicos liquidos. Uno de los ejemplos exitosos mas conocidos de bioaumentación sucedió en las playas de Alaska con la empresa EXXON VALDEZ, los cuales tuvieron en en 1989 una catástrofe ambiental por vertimiento de hidrocarburos en 470 millas de playa y la tecnología mas apropiada fue la aplicación de nutrientes en 110 de éstas (Figura 40). Como resultado se obtuvo un incremento en la velocidad de biodegradación entre 2 y 4 veces, adicionalmente se evaluó el potencial de la utilización de microoganismos a esas playas para favorecer la biodegradación (Chau, 2003). La Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos (EPA) determinó que el método mas práctico para estas playas era la aplicación de nutrientes oleofílicos (superficial) y granulares de liberación lenta (superficial + sub-superficial)(Chau, 2003).

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Figura 40. Localización geográfica del vertimiento EXXON VALDEZ en Alaska y foto del proceso de bioremediación. En el trabajo de Arrieta Ramírez (2011) con bacterias heterótrofas e hidrocarbonoclastas se ha encontrado que bacterias como Enterobacter sp, Bacillus sp, Staphylococcus aureus, Sanguibacter soli, Arthrobacter sp y Flavobacterium sp. se encuentran entre las responsables de los procesos de degradación de hidrocarburos en procesos de bioestimulación. En estudios de laboratorio desarrollados por Gómez, Gaviria, & Cardona (2009) se ha podido confirmar la mayor eficiencia (7.66%) de la bioestimulación con respecto a la atenucación natural, en aspectos como cantidad de hidrocarburos degradados y tiempos de acción, sin embargo los resultados son similares a los obtenidos con procesos de bioaumentacion. En el estudio de Gómez et al. (2009), tanto para el tratamiento de atenuación natural como de bioestimulación la población microbial decrece después de la séptima semana, comportamiento que fue similar al encontrado por Menéndez et al. (2007) después de 4 meses. Finalmente un área que está tomando fuerza es el uso de algas para procesos de bioremediación en casos específicos a cambio de hongos y bacterias; en un trabajo de laboratorio desarrollado por Aguirre Ramírez et al. (2007), se evaluó el efecto de diferentes concentraciones de nitrógeno y fósforo sobre las poblaciones de Chlorella vulgaris, un alga bioremediadora. Se encontró que para una proporción de N:P de 46,67:1, correspondiente al 200% del control de nitrógeno (8,4 mg/L N) se presentó inhibición, mientras para una proporción de N:P de 11,67:1, correspondiente al 200% del control de fósforo (0,36 mg/L P) se presentó estimulación. Este contraste implica que el fósforo es el nutriente limitante, sin embargo, el fósforo no debe ser analizado independientemente; su estudio debe ser realizado en términos de la relación estequiométrica con respecto a la concentración del nitrógeno; por lo tanto, al aumentar estequiométricamente el 140


nitrógeno la concentración el fósforo se hace limitante; es por ello que existe una inhibición en el crecimiento de la población cuando la relación N:P estequiométricamente favorece al nitrógeno; a su vez, cuando la cantidad de fósforo es mayor su condición no es limitante puesto que proporcionalmente la relación N:P favorece en este caso a dicho nutriente y en consecuencia la tasa de crecimiento poblacional aumenta. A pesar de que en la naturaleza el fósforo es considerado el nutriente más limitante, las concentraciones de nitrógeno deben conservar una proporción mayor en relación al fósforo.

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Lección 39. Posibles costos.

Los costos de la bioestimulación son bajos comparados con otros métodos de remediación usados para el tratamiento de vertimiento de hidrocarburos, pero son un tratamiento a largo plazo, que puede llevar muchos años para su completo funcionamiento. Son muy escasos los reportes donde se de una información clara acerca de los costos de diferentes casos exitosos de bioremediación por medio de bioestimulación (Olguin et al., 2007), sin embargo todos ellos coinciden en mencionar que es una de las alternativas más económicas que pueden existir dentro de todas las técnicas de bioremediación in-situ (Arrieta Ramírez, 2011; Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). La naturaleza y profundidad de los contaminantes y el uso de bioaumentación puede aumentar los costos (Van Deuren et al., 1997). Cuando la contaminación se realiza en suelos permeables, la filtración de los contaminantes pueden constituir un gran problema debido al incremento de los costos por el movimiento de tierra requerido (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). También es importante considerar los costos implicados en la selección y aplicación de los nutrientes apropiados; después de la evaluación de los contaminantes se procede a seleccionar los aislamientos más promisorios para la degradación y a la selección de los nutrientes y cantidades adecuadas para agregar al suelo y promover el crecimiento microbiano. Sin embargo no es suficiente con agregar nutrientes y esperar a que estimulen el crecimiento, también se requiere de una dosificación permanente y mantener las condiciones de aireación, o bien la adición de estos fertilizantes por mecanismos de lenta liberación, todo dependiente del contaminante y de las condiciones del terreno donde se ha producido la contaminación. No es lo mismo agregar fertilizantes inorgánicos compuestos (FIC) que sales inorgánicas simples (SIS). El FIC es de fácil aplicación, bajo costo y, por ser un fertilizante de liberación lenta, aporta los nutrientes en forma gradual y continua, a una tasa ajustada a las necesidades de los microorganismos. Sin embargo, su presentación en forma de gránulos secos en algunos casos dificulta su distribución uniforme y la homogenización en el suelo. Por el contrario, aunque las SIS se disuelven más rápidamente en el agua, son más costosas y aportan una baja cantidad de fósforo, el cual se consume rápidamente por los microorganismos degradadores al inicio de la biodegradación (V. Vallejo et al., 2005). De acuerdo al estudio realizado en la costa da Morte en una playa de sobre la costa del Golfo de Alaska, se aplicaron nutrientes a 110 millas de playa contaminada, el costo de la bioestimulación oscila entre 30 y 100 dólares/m3. En la bioremediación usada el tratamiento de bioestimulación fue económico, tras comparar el gasto de 12.000 euros por 500m de costa limpiados, frente al millón de euros necesarios en la catástrofe del Exxon Valdez para la limpieza física de cada kilómetro de litoral. 142


Lección 40. Parámetros de monitoreo y seguimiento. Desde un principio y a lo largo de todo el proceso es necesario realizar el seguimiento a algunos parámetros que se dividen en dos categorías: a. Análisis fisicoquímico de suelos y aguas. Toma de muestras de suelos, calidad del suelo, contenido de hidrocarburos, cromatografía separativa fase sólido-líquido, cromatografía gaseosa, pH por potenciometria, conductividad eléctrica, humedad, gravimetría, capacidad de retención de agua, nitrógeno total, carbono orgánico y total, fosforo asimilable, metales alcalinos y metales pesados. b. Análisis microbiológicos. Toma de muestras, manejo y almacenamiento para ensayos con microorganismos aeróbicos, población heterótrofa total, población hidrocarburolitica. Los datos microbiológicos obtenidos en los monitoreos temporales y espaciales de los suelos del biotratamiento, graficados en función de la concentración de hidrocarburos totales permiten el seguimiento global del biotratamiento. Estos gráficos permiten visualizar cuando un bioproceso llega a un estado estacionario, donde tanto la población hidrocarburolitica como la concentración de HTP remanente permanecen casi constantes. (Eusebi, Sosa, Altamirano, & Pozzo Ardizzi, 1998; M. G. Pozzo Ardizzi, 1998). Se pueden medir variables como humedad, temperatura, pH y potencial redox, pruebas de respirometria para cuantificar el CO2 producido y asi evaluar la actividad metabólica de los microorganismos del suelo durante el proceso de degradación del diesel. Los resultados muestran que el tratamiento de bioestimulación es el mas eficiente en la remoción de hidrocarburos totales de petróleo (Arrieta Ramírez, 2011). El pH es uno de los parámetros que mas variaciones registra pues favorece el desarrollo de los microorganismos degradadores (Arrieta Ramírez, 2011). Esto puede deberse a la adicion de nutrientes que estimula el crecimiento de microorganismos aumentando la biomasa y generando incrementos de pH; el descenso de pH observable aproximadamente después de la decima semana se deben a que la cantidad de oxígeno en el medio disminuye, presentándose incluso condiciones anóxicas, aumentando la cantidad de CO2 en el medio. La humedad debe mantenerse alrededor del 25%, cuando se observa exceso de agua en el microcosmos, el suelo se torna pantanoso y puede interferir en el transporte de oxígeno en el medio. La aireación en el medio favorece la degradación del hidrocarburo por volatilización, facilitando la migración de la fase volátil de los contaminantes, y por biodegradación, ya que al incrementar la oxigenación del suelo se va a estimular la actividad bacteriana. 143


La temperatura influye en la velocidad de degradación de los hidrocarburos, las temperaturas más adecuadas para un óptimo proceso de bioremediación se encuentran entre 20ºC y 40ºC. Los suelos contaminados con una población de microorganismos heterotróficos superior a 1000 UFC/g suelo (Troy, 1994), indica que puede llevarse a cabo la degradación de hidrocarburos mediante el uso de la bioestimulación (Arrieta Ramírez, 2011). Los procedimientos para valorar variables físico-químicas y baceriológicas están definidos según normas, lo que garantiza que siempre van a medirse de la misma manera y no van a diverger en los valores obtenidos, estas normas según María Graciela Pozzo Ardizzi et al. (2010) son: Normas ASTM D 5745 –95 Standard Guide for Developing and Implementing Short Terms Measures or Early Actions for Site Remediation. Análisis fisicoquímicos de suelos y aguas:  Guía de diseño para toma de muestras en suelos, según Norma IRAM 29481-1; ISO-DIS 10381-1: 1993. Soil quality.  Toma de muestras de suelos, según Norma IRAM 29481-2; ISO-DIS 10381- 2: 1993 Soil quality.  Pretratamiento de muestras para análisis fisicoquímicos. Según Norma IRAM 29402: 1998.  Calidad del suelo: equivalente a ISO 11464: 1994.  Contenido de hidrocarburos (%) (HTP). Extracción por Soxhlet, con tetracloruro de carbono. (según Método EPA 418.1). Con modificaciones próxima Norma IRAM.  Cromatografía separativa fase sólido-líquido. Analiza por fracciones: saturados, aromáticos, resinas y asfaltenos.  Cromatografía gaseosa-Espectrometría de masa (GC/MS) (analiza componentes de cada fracción).  pH Potenciometría. Según Norma IRAM 29410-ISO 10390.  Conductividad eléctrica. Potenciometría. Según Norma ISO 11265: 1994.  Humedad (%). Gravimetría. Según Norma ISO 11465: 1993.  Capacidad de retención de agua. Según Norma ISO-FDIS 11274: 1998.  Nitrógeno total. Según Norma ISO 11261: 1995.  Carbono orgánico y total. Según Norma ISO 10694: 1995.  Fósforo asimilable. Según Norma ISO 11263: 1994.  Metales alcalinos. Espectrofotometría de Absorción atómica (Según Standard Methods 3113 B). 144




Metales Pesados. Espectrofotometría de Absorción atómica (Según Standard Methods 3113 B).

Análisis microbiológicos:  Toma de muestras, manejo y almacenamiento para ensayos con microorganismos aeróbicos, según Norma IRAM 29481-6: 1998; ISO 10381-6: 1993.  Población heterótrofa total. Recuento por NMP.  Población hidrocarburolítica. Recuento por NMP, en medio mínimo con petróleo estéril como única fuente de carbono. Bioensayos para establecer compatibilidad y biodegradabilidad. Según Norma ISO 11266:1994 (con modificaciones). Las especies que respondan sin indicar alteraciones en sus distintos estados fenológicos, serán las elegidas para repoblar los suelos del predio. Durante los bioensayos con plantas, se obtendrán muestras de material vegetal donde se analizará contenido de hidrocarburos en los tejidos vegetales. Los controles sobre las plantas se realizarán siguiendo la Norma ISO 11269-1: 1993. Calidad del Suelo. Determinación de los efectos de contaminantes en la flora del suelo (Norma IRAM en estudio) según María Graciela Pozzo Ardizzi et al. (2010).

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CAPÍTULO 9. BIOAUMENTACIÓN. La bioaumentación es el término general que se suele emplear para referirse al incremento en la cantidad de agentes descontaminantes, en especial a microorganismos (virus, bacterias, actinomicetos), proceso que se puede llevar a cabo tanto in-situ como ex-situ, siempre dependiendo de factores económicos, del tipo de contaminante y de las facilidades que existan para manejo ex-situ o la adquisición de los bioremediadores en las cantidades y de la calidad requeridos. Lección 41. Introducción. La introducción de organismos puede realizarse tanto de organismos nativos como de organismos moficados genéticamente siempre teniendo en cuenta los conteos iniciales de microorganismos y las capacidades degradadoras de los organismos seleccionados, en especial cuando se trata de organismos genéticamente modificados. Cualquiera que sea el caso, en tratamientos in-situ o ex-situ, se debe tener en cuenta las propiedades del sustrato, para lo cual se requiere de una valoración inicial de los principales contaminantes y sus concentraciones, debido a que si se superan los límites tolerantes por los microorganismos estós serán ihhibidos o eliminados. A partir de estos datos también es importante considerar el tipo de tratamiento que va a ser mas adecuado, debido a que la degradación de algunos contaminantes se realiza mejor bajo condiciones aeróbias y en otros casos en condiciones anaerobias, mientras en otros casos se requerirá de tratamientos mixtos (aerobio-anaerobio) o trabajo complementario entre varios organismos, de acuerdo a esto se debe considerar el mejor tratamiento de bioaumentación y los microorganismos que han de ser empleados. Una de las técnicas más empleadas para reducir la contaminación por hidrocarburos exsitu en Ecuador es el uso de compostas, cuya efectividad fue comprobada por Espinosa Andrade, (2009)(Figura 41).

Figura 41: Representación gráfica de un sistema de biopilas alargadas (Velasco & Volke Sepúlveda, 2003). 146


Un pila o apilamiento de compost está compuesta de capas de material vegetal verde muerto que entra en proceso de descomposición, material vegetal seco y generalmente con adición de cal para reducir el pH, y como requerimiento la adición de microorganismos que van a realizar la actividad biodegradadora. Cuando la pila de compost tiene propósitos de bioremediación se adicionan los sustratos a recuperar o bioremediar en capas intermedias y por lo general son suplementados con microorganismos y/o nutrientes. Si en el proceso se generan gases o vapores de hidrocarburos volátiles regulados por la autoridad ambiental, o las condiciones climatológicas de la zona pueden afectar negativamente la eficiencia del proceso, la pila del suelo se debe cubrir con membranas o poner techo de forma similar a los invernaderos. Los vapores generados en el proceso se deben colectar y tratar antes de ser emitidos a la atmósfera. Lo que incurre a costos adicionales. Entre las técnicas ex-situ también se encuentra el tratamiento de biosuspensión, el cual es conocido como sistema biorreactor o contacto líquido-sólido. El procedimiento consiste en excavar el suelo contaminado y luego introducirlo en un reactor añadiendo nutrientes, agua, y los cultivos microbianos adecuados para que se lleve a cabo la degradación. Se mezcla bien y se airea la suspensión hasta que las transformaciones de los compuestos seleccionados su eliminación alcanzan el nivel deseado. A continuación se detienen el mezclado y la aireación, y se deja a los sólidos separarse de los fluidos por sedimentación. El sedimento es retirado y, si la transformación ha tenido éxito, el suelo se devuelve a su lugar de origen, mientras que los líquidos se tratan como aguas residuales. El tratamiento vía suspensión puede aplicarse en particular a los suelos contaminados con residuos oleosos y de consistencia alquitranada (siendo estos compuestos difíciles de biode gradar). Es más rápido y requiere menos superficie que otros sistemas. Se ha usado para tratar suelos contaminados con herbicidas (2,4-D, clorofam), insecticidas (lindano, clordano, paratión), clorofenoles (PCP) y nitrofenoles, BPCs, HTPs y HAPs (Alexander, 1994). También se ha aplicado efectivamente para tratar desechos con concentraciones relativamente altas de metales (Eweis et al., 1998). Debido al energético mezclado y a la aireación forzada se favorece el escape de emisiones de aire, por ello la suspensión no es una buena elección para suelos donde la mayoría de los compuestos sean volátiles. Esta técnica demanda mayor cantidad de dinero a comparación de otras técnicas de biodegradación (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). El éxito de estas inoculaciones depende no sólamente de factores abióticos como el pH, temperatura, potencial de reducción y la disponibilidad de agua y nutrientes, sino también 147


de factores bióticos tales como la competencia microbiana, amensalismo, parasitismo y depredación, que pueden limitar el crecimiento y desarrollo de las poblaciones inoculadas (Garbisu et al., 2002). Entre los beneficios se encuentran: A) Reducción de la formación del H2S (Ácido sulfhídrico). B) Mejoramiento de la bioactividad. C) Reducción de la DBO (Demanda bioquímica de oxígeno). D) Mejoramiento de la estabilidad del sistema. E) Mejoramiento de la sedimentación de sólidos. F) Reducción del volumen de lodos. Para el tratamiento in-situ, dentro de los cuales el más ampliamente conocido es el “landfarming”, dada la necesidad de excavación y posterior depósito del suelo contaminado, se requiere una superficie de trabajo relativamente grande cuyas dimensiones dependen del volumen de suelo a tratar (Figura 42).

Figura 42: Unidades de tratamiento (Ercoli, 2008). Antes de llevar a cabo la bioaumentación en un sitio, deben realizarse cultivos de enriquecimiento, aislar microorganismos capaces de cometabolizar o utilizar el contaminante como fuente de carbono, y cultivarlos hasta obtener grandes cantidades de biomasa (Alexander, 1994).

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Lección 42. Parámetros de diseño. Röben (2002) describio un conjunto de elementos a estudiar antes de crear una planta de compostaje, estos procesos pueden ser también aplicados en el caso de bioaumentación en el proceso de Landfarming, en donde la premisa fundamental radica en estudiar minuciosamente la situación actual y las posibilidades económicas. El estudio de factibilidad debería comprender al menos los siguientes puntos (Röben, 2002): 1. Desechos sólidos. - Cantidad de los desechos sólidos. - Cantidad de los desechos biodegradables. - Los desechos biodegradables especiales para considerar (tipo de contaminante); cantidad y tipo de esos desechos. 2. Lugar previsto. - Area disponible (considerando la tecnología que se intenta implementar, la cantidad de material, un área adecuada para almacenar el compost y una laguna de tratamiento de las aguas lixiviadas). - Material del suelo. - Costo del terreno. 3. Clima local. - Nivel de precipitaciones (importante especialmente en la Amazonía). 4. Operación de la planta de compostaje. - Personal disponible en el municipio (obreros, personal técnico). - Posibilidades de contratar nuevo personal. - Nivel de formación del personal. - Capacitaciones necesarias. - Alternativa de contratar el manejo de la planta de compostaje a una microempresa. - Análisis económico y técnico. 5. Tecnología seleccionada. - Planta manual o mecanizada?. - Cuales unidades de la planta se pueden o deben mecanizar?. - Presupuesto necesario para inversión y operación de las alternativas consideradas. - Ventajas y desventajas técnicas. - Capacidad financiera para asumir los costos. - Cotizaciones de diferentes productores para las unidades mecanizadas. Una vez hecha la anterior valoración, el diseño de la bioremediación es bastante sencillo y depende mucho de los requerimientos de las entidades gubernamentales en cuanto a eficiencia del proceso, los tiempos estimados y los resultados esperados. 149


Cualquiera que sea el proceso se requiere de:    

   

Caracterización de los contaminantes y su distribución en el terreno. Caracterización del terreno, determinar características geológicas e hidrogeológicas (Ej: presencia y velocidad de aguas subterráneas). Selección de los nutrientes y condiciones de biorremediación. Ej: Oxígeno (proceso aerobico) y/o poder reductor (proceso anaeróbico), necesidad de calefacción o electroestimulación. Generalmente requiere del estudio de los microorganismos presentes en el sitio y su capacidad para realizar la remediación deseada. Esta sujeta a las restricciones de geología e hidrogeología. Optimización de acceso a nutrientes y contaminantes: Vías de inyección o entrega de nutrientes, uso de biosurfactantes. Evaluar uso de procesos químicos y/o físicos complementarios a la biorremediación. Determinar las vías metabólicas principales y la posible producción de metabolitos inhibitorios o tóxicos. Diseñar e implementar métodos de evaluación del proceso de biorremediación: NMP, BIOLOG, determinación de sustratos, productos y metabolitos intermediarios.

En el caso del compostaje, la pila de material vegetal ha de ser de por lo menos un metro de altura por uno de ancho, y el largo solo está limitado de las dimensiones del terreno, lo cual favorece la actividad de los diferentes microorganismos involucrados (mesófilos, termófilos, aerobios y anaerobios). Aunque las dimensiones de ancho y alto pueden ser mucho mayores ya que en al finalizar el proceso las pilas de compost pueden corresponder a la tercera parte del volumen inicial. En el fondo de la pila el sistema cuenta con un aislante que generalmente son geomembranas o canales plásticos para el control de lixiviados. Estas pilas de compost pueden ser aireadas de forma activa, volteando la pila, o bien de forma pasiva, mediante tubos perforados de aireación, con distribución permanente de nutrientes, microorganismos y aire. En principio, las biopilas se pueden aplicar a la mayoría de los compuestos orgánicos, siendo más eficaz en los compuestos de carácter más ligero. Entre los factores a tener en cuenta se encuentran la humedad, el pH, la temperatura del suelo, el contenido de oxígeno, la concentración de nutrientes, la textura del suelo; y entre los parámetros de los contaminantes se encuentran la volatilidad, la estructura química, concentración y toxicidad (Cuadro 20). Entre los factores que influyen en la aplicación de las biopilas se destacan los hidrocarburos deben ser no halogenados y deben encontrarse en el suelo en concentraciones menores a 50.000 ppm. 150


Cuadro 20: Estructura química y biodegradabilidad (EPA, 1994b).

Los parámetros edáficos que determinan y condicionan la elección de un suelo para "landfarming" son: textura, estructura, pH, temperatura, porosidad, velocidad de percolación, capacidad de retención de agua, infiltración, contenido de oxígeno, contenido de macro y micronutrientes, humedad. La bibliografía existente al respecto indica la necesidad de mantener la relación hidrocarburo/N/P/K de manera que no exceda los valores 100/10/1/1 (María Graciela Pozzo Ardizzi et al., 2010). La fase biótica indígena de un suelo, posee naturalmente formas de resistencia que les permiten sobrevivir por largos períodos sin realizar actividades metabólicas, ante condiciones ambientales desfavorables. Un adecuado manejo del sistema suelo, permite amortiguar los efectos ambientales, generando una proliferación cuali y cuantitativa de los microorganismos autóctonos, permitiendo que realicen sus funciones bioquímicas en forma continua, aunque temporalmente menos activa. Los organismos alóctonos que se puedan incorporar a un suelo, generalmente, no participan significativamente en la actividad comunitaria. Esta población demanda un cierto período de adaptación, llegando a crecer y reproducirse, manteniéndose por cortos períodos, debiendo competir con las poblaciones autóctonas, por espacio colonizante, por nutrientes y oxígeno, pero sin llegar a contribuir en forma significativa a las numerosas transformaciones e interacciones de importancia ecológica que ocurren en el suelo (María Graciela Pozzo Ardizzi et al., 2010). 151


Lección 43. Funcionamiento.

Industrialmente el compostaje comprende los siguientes elementos: 1. Recepción de la fracción orgánica de la basura. Se tamiza para eliminar las pocas impurezas que aún contenga. 2. Una gran criba cilíndrica que separa la materia orgánica. 3. Selección manual, tras este control, un electroimán elimina los residuos metálicos. 4. Recepción de la fracción vegetal y trituración. 5. Mezcla y homogenización. Se mezclan las dos fracciones así: 65-75% orgánica y 2535% vegetal triturada. El resultado es lo que se compostará. 6. Disposición en pilas: Con una pala mecánica se forman pilas en un cobertizo sin paredes y preparado para recoger los lixiviados. 7. Volteado de las pilas y control de las condiciones ambientales del proceso. Para que se descomponga bien, hay que mantener las condiciones de humedad, temperatura y oxígeno. Por eso se riegan las pilas con los propios lixiviados y se remueven con una máquina volteadora. 8. Cribado del compost maduro. A las 12-14 semanas el compost se criba para que quede homógeneo y fino. Si quedan deshechos vegetales, vuelven al proceso. 9. El final del proceso es el compost. Sirve de abono o de corrector de suelos.

La fase bioremediadora del proceso de composting o compostaje puede dividirse en cuatro períodos, atendiendo a la evolución de la temperatura: 1. Mesolítico: La masa vegetal está a temperatura ambiente y los microorganismos mesófilos se multiplican rápidamente. Como consecuencia de la actividad metabólica la temperatura se eleva y se producen ácidos orgánicos que hacen bajar el pH. 2. Termofílico: Cuando se alcanza una temperatura de 40ºC, los microorganismos termófilos actúan transformando el nitrógeno en amoníaco y el pH del medio se hace alcalino. A los 60ºC estos hongos termófilos desaparecen y aparecen las bacterias esporígenas y actinomicetos. Estos microorganismos son los encargados de descomponer las ceras, proteínas y hemicelulosa. 3. De enfriamiento: Cuando la temperatura es menor de 60ºC, reaparecen los hongos termófilos que reinvaden el mantillo y descomponen la celulosa. Al bajar de 40ºC los mesófilos también reinician su actividad y el pH del medio desciende ligeramente. 4. De maduración: Es un periodo que requiere meses a temperatura ambiente, durante los cuales se producen reacciones secundarias de condensación y polimerización del humus.

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En cuanto al landfarming la actividad bioremediadora se ve limitada por la competencia de los organismos nativos cuando la bioaumentación es realizada por organismos alóctonos (María Graciela Pozzo Ardizzi et al., 2010), sin embargo la tendencia actual es a emplear organismos aislados del mismo sustrato contaminado, factor que lleva a una reducción de la competencia, una mayora adaptación a las condiciones del terreno y por consiguiente un mejor funcionamiento de la flora en los procesos de bioremediación; aunque surge el limitante si la flora autóctona o nativa tiene el potencial de descomponer los materiales contaminantes de una manera eficiente, lo que puede llevar a que los tratamientos sean mas demorados que lo esperado. Sin embargo este proceso no puede ser exitoso sin la adición de los nutrientes adecuados en especial nitrógeno, fósforo y potasio requeridos para el crecimiento y reproducción de los microorganismos. El carbono es proveido por el material contaminante, así como una abundante oxigenación, la cual en la mayoría de las ocasiones se realiza con ayuda de un tractor que permanentemente esté arando el terreno. El proceso de biodegradación en el landfarming adicionado a bioaumentación puede llegar a constituirse en un proceso lento (hasta 3 años) en comparación al de compostaje (6 meses), pero los estudios consultados indican que pueden llegar a ser similarmente eficientes en destruir los hidrocarburos, aromáticos y diferentes contaminantes. Tanto en el el uso de pilas de compost como en landfarming, priman los procesos aerobios sobre los anaerobios y esto garantiza que el proceso se realice de una forma más eficiente.

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Lección 44. Posibles costos. La bioaumentación es una tecnología que puede durar varios meses o años, y su utilización no implica mucho capital ni costos de operación. Como todos los tratamientos “Ex-situ”, cuando la contaminación es muy profunda, el movimiento de tierra puede implicar costos más altos. Las técnicas que se asocian con bioaumentación se caracterizan por:  Son simples en cuanto a implementacion y diseño.  Escaso requerimiento de infraestructura operativa.  Tecnica destructiva, ya que el contaminante es transformado en productos inocuos para el ambiente.  Tiempos de tratamientos relativamente cortos comparados con otros procesos biológicos.  Adecuada para distintos tipos de suelos y de contaminantes.  No requiere dilucion del material a tratar con lo cual se evita el incremento de volumen.  Adecuada para el tratamiento de suelos en zonas aridas o semiáridas.  Adecuada para el tratamiento en diversos climas.  No requiere incorporacion de agua, excepto en periodos de extrema sequia.  Es posible obtener metas de limpieza bastante rigurosas. Cualquiera que sea la técnica, bien sea compostaje o landfarming, unos altos costos se relacionan con la extracción de los microorganismos nativos con propiedades biodegradadoras y la posterior producción de los microorganismos en suficiente cantidad para poderse aplicar al sitio de donde fueron extraidos; así como un estudio piloto previo a la bioremediación a escala completa (Röben, 2002). En cuanto al compostaje en plantas manuales (sin ser industriales), aparte de la compra y nivelación del terreno, las plantas manuales casi no tienen costo de inversión. Se deberían confeccionar las tamices, comprar palas y, según el clima, se debe construir un techo para las pilas o lechos. Los costos de operación según Röben (2002) son: Costos de personal: 1 obrero para 3 toneladas diarias. 1 tecnico o profesional con buenos conocimientos de biología para la supervisión del trabajo (puede ser a la mitad del tiempo en plantas pequeñas). Costos de herramientas: palas, trinches, picas, carretillas, lampas, regadoras etc. 1 unidad por obrero y por año. Equipamiento personal de los obreros (uniformes, botas, guantes, masques): 2 overoles por año, 6 pares de guantes por año, 1 par de botas/año. 154


Compra de materiales: Saquillos, hilo, malla etc. Agua de riego. Las plantas mecanizadas implican mayores costos, se deben tomar en consideración los costos de inversión par una o más de las unidades siguientes: Pre-condicionamiento:  Confección del tamiz tambor.  Confección de la banda transportadora.  Confección de la trituradora / molino. Compostaje:  Cargador.  Contenedores o túnel de compostaje.  Máquina para mezcla/ revuelta. Además:  Tubería y motor de aireación filtro biológico (con tubería de aireación y desagüe). Condicionamiento del producto listo:  Tamiz tambor.  Equipo para separar materiales foráneos (ciclón, tamiz aireado, separador a corriente del aire). En el caso de compostaje o landfarming con bioaumentación, un costo importante lo constituye los análisis químicos y biológicos asociados, los cuales requieren de equipos y personal especializado. Estos análisis pueden subir los costos, pero son compensados con la rapidez (hasta aprox. 3 años en el caso de landfarming) en que pueden ocurrir los procesos. Además, hay costos de electricidad o de combustible, dependiente del tipo de la maquinaria. Se deberían obtener cotizaciones para el consumo de energía para cada tipo de maquina requerida. En general, se puede decir que cambia el consumo de energía eléctrica entre 10 kWh/ (tonelada de basura cruda) y 50 kWh / (tonelada de basura cruda). Se obtiene el valor bajo si se utiliza solamente un tamiz tambor con banda transportadora para el pre-condicionamiento, y un tamiz aireado para la separación de los materiales foráneos del producto listo. Si se intenta hacer una planta sofisticada con aireación, filtro biológico y máquina de mezcla/ revuelta, y por supuesto, precondicionamiento y condicionamiento del producto, el consumo de energía sube hacia los 50 kWh/ (t de basura cruda) (Röben, 2002). Los costos de repuestos y de mantenimiento se pueden estimar entre 5 - 10 % de los costos de inversión. Los costos proyectados según la Agencia de protección ambiental de Estados Unidos (EPA) no difieren mucho de las anteriores observaciones, pero dan valores cuantitativos, e indican que para el caso del landfarming los costos van de 150 dólares por metro cúbico 155


de suelo contaminado (EPA, 1994a), y en el caso de compostas el valor va de 150 a 220 dólares (EPA, 1994b), lo cual indica que los dos tratamientos, al adicionarle el procedimiento de bioaumentación pueden incrementarse hasta en un 50% y aún así siguen siendo económicos en comparación con los tratamientos químicos y físicos (Villaseñor Roa, 2011).

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Lección 45. Parámetros de monitoreo y seguimiento. En los tratamientos por bioaumentación es importante tener parámetros de seguimiento tanto de los microorganismos incorporados, de las densidades de organismos presentes y activos en el sustrato, de las características físico-químicas del sustrato (suelos o aguas) y de las concentraciones y tipos de contaminantes presentes en cada etapa del proceso. En el caso de las pilas de compost, estas se deben estar aireando permanentemente bien sea por volteo o de forma mecánica, en cualquiera de los casos es necesario evaluar la cantidad de oxígeno disponible. El pH puede ser un factor crítico para que se desarrollen los procesos en cualquiera de las etapas que se esté realizando ya que el sustrato debe conservarse cerca a la neutralidad (EPA, 1994b), esta valoración se tiene que realizar al menos con una frecuencia semanal. Debido a que si se desea realizar bioremediación, los suelos contaminados han de ser agregados a la pila de compost, así como los microorganismos controladores, es necesario un monitoreo permanente de las poblaciones de microorganismos mesófilos, termófilos, aerobios y anaerobios, ya que pueden fácilmente competir por los sustratos y hacer el proceso de degradación menos eficiente, en este sentido el tratamiento de composteo demora aproximadamente 3 meses, durante los cuales se debe de realizar una valoración al menos quincenal de las poblaciones de microorganismos de interés. Estas valoraciones tienen que realizarse simultáneamente con una determinación del contenido de los contaminantes a degradar, los cuales se pueden realizar cada vez que se realice un volteo (cuando se realiza aireación mecánica) o quincenalmente cuando se dispone de un sistema de aireación (EPA, 1994b). Cuando el contaminante se agrega de forma líquida, este líquido debe de remplazar al agua que se adiciona en el proceso normal de compostaje y por lo tanto las valoraciones deben realizarse justo antes de la adición de nuevas dosis de contaminantes. Dentro de los parámetros de seguimiento se encuentra los contenidos nutricionales, en especial N:P:K, los cuales deben estar en proporciones definidas para que se puedan llevar a cabo los procesos de respiración, crecimiento y degradación, la fuente de carbono puede ser suplida tanto por el contaminante empleado como por la materia orgánica agregada desde el principio (EPA, 1994b). Cuando se realiza una valoración siempre ha de realizarse en varios sitios de la pila (la cantidad depende de las dimensiones de la pila), tomando muestras tanto de la parte superficial, intermedia y profunda y en cada caso son diferentes los microorganismos a evaluar. Parámetros como temperatura, humedad, oxígeno, pH y contenido nutricional son homogéneos en cualquier parte donde se esté muestreando, pero los 157


microorganismos dependen de la temperatura, la cual está directamente relacionada con la profundidad donde se está realizando el muestreo. La emisión de gases es un parámetro importante a evaluar si dentro de los contaminantes a degradar se encuentran algunos que produzcan compuestos orgánicos volátiles (COVs), esta valoración se ha de evaluar permanentemente desde un principio, ya que de su presencia se determinará la necesidad de una cubierta y la recolección de éstos (EPA, 1994b). También como producto de la descomposición, los lixiviados deben ser permanentemente evaluados en búsqueda de compuestos no degradables o recalcitrantes, los cuales no se puede permitir que se viertan ni en cuerpos de agua ni en los suelos. Cuando el tratamiento se realiza por biosuspensión es supremamente importante valorar las poblaciones de microorganismos, ya sea por número mas probable o UFC, dibido a que los procesos son supremamente rápidos y los productos del proceso son recogidos para ser tratados como aguas residuales (Torres Delgado & Zuluaga Montoya, 2009). Muy diferente cuando se trata de tratamientos in-situ, en los cuales debido a las grandes dimensiones de las pilas de tratamiento se hace más difícil una evaluación detallada de los parámetros; en tal caso se asegura por una parte la aireación por volteo, mientras que parámetros como pH, humedad y poblaciones de microorganismos deben realizarse por muestreo aleatorio. El plan de monitoreo en el landfarming debe realizarse en dos dimensiones respecto al sistema suelo- microorganismos-residuo: a) Seguimiento superficial del bioproceso, es decir en el sector de suelo de los primeros 20 a 30 cm, donde se realiza básicamente el tratamiento biológico del residuo. La frecuencia de este monitoreo debe ser inmediata a la puesta en funcionamiento de cada celda de “landfarming”, luego al mes, para seguir bimensualmente. Prácticamente comprende la toma de muestras de suelo en la capa arable. b) Seguimiento del proceso en el perfil del suelo. Las calicatas en el muestreo pretratamiento se realizan hasta 2 a 2,5 m de profundidad, luego de extraídas las muestras se tapan y luego cada 6 meses se realizan calicatas dentro de cada celda, hasta una profundidad de 1 m y en un sitio próximo a la anterior, pero nunca en el mismo lugar porque la primer excavación altera las propiedades del perfil aunque se sea muy cuidadoso en la reposición del material al suelo (María Graciela Pozzo Ardizzi et al., 2010). En las condiciones de landfarming es importante valorar la densidad microbiana en el suelo, el pH, la humedad y temperatura del suelo, la concentración de nutrientes y la 158


textura. Dentro de los productos a bioremediar es necesario valorar la volatilidad, la composición química, toxicidad y concentración tanto original como de productos metabólicos intermediarios. Finalmente dentro de los parámetros ambientales es importante valorar la temperatura, precipitación y vientos (EPA, 1994a). En cada país existen normas definidas para las determinaciones fisicoquímicas y bacteriológicas, entre ellas encontramos:  Normas ASTM D 5745 –95 Standard Guide for Developing and Implementing Short Terms.  Measures or Early Actions for Site Remediation. Análisis fisicoquímicos de suelos y aguas:  Guía de diseño para toma de muestras en suelos, según Norma IRAM 29481-1; ISO-DIS 10381-1: 1993. Soil quality.  Toma de muestras de suelos, según Norma IRAM 29481-2; ISO-DIS 10381-2: 1993 Soil quality.  Pretratamiento de muestras para análisis fisicoquímicos. Según norma IRAM 29402: 1998.  Calidad del suelo; equivalente a ISO 11464: 1994.  Contenido de hidrocarburos (%) (HTP) Extracción por Soxhlet, con tetracloruro de carbono. (según Método EPA 418.1). Con modificaciones próxima Norma IRAM.  Cromatografía separativa fase sólido-líquido (analiza por fracciones: saturados; aromáticos; resinas y asfaltenos).  Cromatografía gaseosa-espectrometría de masa (GC/MS)(analiza componentes de cada fracción).  pH Potenciometría. Según Norma IRAM 29410-ISO 10390.  Conductividad eléctrica. Potenciometría. Según Norma ISO 11265: 1994.  Humedad (%). Gravimetría. Según Norma ISO 11465: 1993.  Capacidad de retención de agua. Según Norma ISO-FDIS 11274: 1998.  Nitrógeno total. Según Norma ISO 11261: 1995.  Carbono orgánico y total. Según Norma ISO 10694: 1995.  Fósforo asimilable. Según Norma ISO 11263: 1994.  Metales alcalinos. Espectrofotometría de Absorción atómica (según Standard Methods 3113 B).  Metales Pesados. Espectrofotometría de Absorción atómica (según Standard Methods 3113 B). Análisis microbiológicos:  Toma de muestras, manejo y almacenamiento para ensayos con microorganismos aeróbicos, según Norma IRAM 29481-6: 1998; ISO 10381-6: 1993.  Población heterótrofa total. Recuento por NMP. 159


 

Población hidrocarburolítica. Recuento por NMP en medio mínimo con petróleo estéril como única fuente de carbono. Bioensayos para establecer compatibilidad y biodegradabilidad. Según Norma ISO 11266: 1994 (María Graciela Pozzo Ardizzi et al., 2010).

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Modulo proceso de biorremediacion.pdf

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