Praktikum Biokimia
2016
Modul IV Analisis Lipid I. Latar Belakang Lipid adalah campuran heterogen senyawa kimia. Sifat umum yang dimiliki oleh lipid adalah tidak larut dalam air. Uji keberadaan lipid dalam suatu campuran dilakukan dengan menganalisa konstituen senyawa kimianya. Makanan mengandung berbagai macam lipid, yang paling penting diantaranya adalah lemak, lipid kompleks dan steroid. Lemak adalah trigliserida, ester dari asam lemak dan gliserol. Lipid kompleks juga mengandung asam lemak, tapi komponen alkohol dapat berupa gliserol atau spingosin. Lipid kompleks juga mengandung mengandung konstituen lain seperti seperti fosfat, kolin kolin atau etanolamin etanolamin atau atau mono- sampai oligo yang paling penting adalah adalah adalah adalah lesitin, suatu gliserofosfolipid, gliserofosfolipid, yang – sakarida. Gugus yang mengandung asam lemak, gliserol, fosfat, dan kolin. Steroid yang paling penting dalam makanan adalah adalah kolesterol. kolesterol. Makanan yang berbeda mengandung jumlah gugus gugus yang berbeda dari ketiga gugus lipid tersebut. t ersebut.
Inti steroid
Kolesterol
Gambar 1. Struktur kimia kolesterol terdiri dari inti steroid yang umum untuk semua steroid.
Reaksi Lieberman-Burchard Lieberman-Burchard merupakan merupakan uji kolorimetri kolorimetri yang khusus khusus untuk uji kolesterol kolesterol yang menggunakan anhidrida asetat dan asam sulfat sebagai pereaksi, yang memberikan warna hijau dengan adanya kolesterol. W arna hijau ini sehubungan dengan gugus –OH dari kolesterol dan ikatan tak jenuh yang terdapat pada fusi cincin. Warna berubah secara gradual: pertama muncul warna pink yang kemudian berubah menjadi ungu dan akhirnya berubah menjadi warna hijau. Ketika lesitin dihidrolisa dihidrolisa dalam dalam media bersifat asam, asam, ikatan ester asam lemak dan ikatan ikatan ester fosffat terputus dan asam lemak bebas dan fosfat anorganik dilepaskan. Dengan menggunakan uji molibdat, dapat diuji keberadaan fosfat dalam hidrolisat dengan timbulnya warna ungu. Walaupun uji ini tidak spesifik untuk lesitin (lipid lain yang mengandung fosfat akan memberikan uji positif). Memberikan hasil uji yang berbeda antara lemak dan kolesterol (uji negatif) dan fosfolipid (uji positif).
Gambar 2. Reaksi hidrolisa lesitin
RFK-Institut Teknologi Del
Page 1
Praktikum Biokimia
2016
Uji lain yang dapat membedakan antara kolesterol dan lesitin adalah reaksi akrolein. Jika lipid yang mengandung gliserol dipanaskan dengan kehadiran kalium hidrogen sulfat, maka gliserol akan didehidrasi, membentuk akrolein, yang memiliki aroma yang tidak sedap. Pemanasan lebih lanjut akan menghasilkan polimerisasi akrolein yang ditandai dengan warna hitam pada campuran reaksi. Aroma yang tidak sedap dan warna hitam menandakan adanya gliserol, yang berarti ada lemak dan atau lesitin. Kolesterol memberikan uji negatif pada uji akrolein.
Gambar 3. Reaksi akrolein untuk gliserol
II. Tujuan Percobaan: Menganalisa komposisi lipid dari makanan seperti minyak goreng, mentega dan kuning telur. III. Bahan dan Alat 1. NaOH 6M 2. HNO3 6M 3. Reagen molibdat 4. Larutan asam askorbat 5. KHSO4 6. Kloroform 7. Anhidrida asetat 8. H2SO4 9. Kolesterol 10.Lesitin 11. Gliserol
IV.
12. Minyak sayur 13. Mentega 14. Hot-plate 15. Kain kasa 16. Tabung reaksi 17. Timbangan 18. Bunsen burner 19. Gelas kimia 250 mL 20. Erlenmeyer 50 mL 21. Penjepit tabung
Prosedur Percobaan 4.1.Uji Fosfat 1. Siapkan water bath dengan mendidihkan sekitar 100 mL air kran dalam gelas kimia 250 mL di atas hot plate. 2. Siapkan enam tabung reaksi yang bersih dan kering dan beri tanda. Masukkan masing-masing sampel ke dalam tabung reaksi kemudian lakukan hidrolisa dengan menambahakn 3 mL asam nitrat 6M ke dalam setiap tabung. 3. Tempatkan semua tabung reaksi yang telah berisi campuran reaksi dalam air mendidih selama 5 menit. Jangan menghirup uap yang timbul. Dinginkan campuran reaksi kemudian netralisasi dengan menambahkan 3 mL NaOH 6M. Selama hidrolisis mungkin terbentuk endapan, khususnya pada sampel kuning telur.
RFK-Institut Teknologi Del
Page 2
Praktikum Biokimia
2016
Untuk sampel yang menghasilkan endapan maka harus disaring dengan menggunakan kain kasa di atas labu Erlenmeyer 50 mL. 4. Pindahkan 2 mL sampel yang telah dinetralisasi ke dalam tabung reaksi yang bersih dan kering. 5. Tambahkan 3 mL reagen molibdat ke dalam setiap tabung dan campurkan hingga homogen. (Hati-hati karena larutan molibdat mengandung asam sulfat). Panaskan tabung reaksi yang berisi sampel di dalam water bath air mendidih selama 5 menit. 6. Tambahkan 0,5 mL asam askorbat dan homogenkan campuran. Tunggu selama 20 menit sampai timbul warna ungu. Tuliskan hasil pengamatan pada buku jurnal anda. 4.2.Uji Akrolein untuk Gliserol 1. Siapkan tujuh (7) tabung reaksi yang bersih dan kering dan beri tanda, kemudian masukkan sebanyak 1 g kalium hidrogen sulfat, KHSO 4 ke dalam setiap tabung. 2. Tambahkan 0,1 g sampel; gliserol, minyak sayur, mentega dan kuning telur pada tabung yang telah diberi tanda yang sesuai. 3. Tambahkan beberapa kristal sukrosa ke dalam setiap tabung. 4. Siapkan bunsen burner dalam lemari asam (Perlu dikerjakan di lemari asam karena akan menghasilkan aroma yang tajam dan tidak sedap). 5. Dengan hati-hati panaskan tabung reaksi menggunakan bunsen burner sambil tabung digoyang-goyangkan. Pemanasan dihentikan jika campuran reaksi sudah mulai menghitam. Cium bau aroma yang timbul dengan cara mengibas-ngibaskan tangan di atas permukaan tabung dan diarahkan ke hidung, tapi jangan menghirup uapnya. Aroma tajam dan tak sedap seperti bau hamburger yang gosong menandakan uji positif untuk gliserol. Sukrosa yang ada pada sampel juga akan terhidrasi dan memberikan warna hitam, tetapi aromanya berbeda dan bukan merupakan uji positif untuk akrolain. Jangan lakukan pemanasan yang berlebihan karena residu akan mengeras dan sukar dilepaskan dari tabung. 4.3.Uji Lieberman-Burchard untuk Kolesterol 1. Tempatkan 0,1 g sampel pada tabung reaksi yang bersih dan kering. Langkah selanjutnya dikerjakan dalam lemari asam. 2. Tambahkan 3 mL kloroform dan 1 mL anhidirda asam ke dalam setiap tabung, kemudian tambahkan 1 tetes asam sulfat pekat ke dalam setiap tabung. Campurkan hingga homogen, biarkan selama 5 menit dan catat perubahan warna yang terjadi.
REFERENSI Frederick Bettelheim and Joseph Landesberg, 2000, Laboratory Experiments for General, th Organic & Biochemistry 4 ed. Harcourt Brace College, London.
RFK-Institut Teknologi Del
Page 3
Praktikum Biokimia
2016
PRE-LAB QUESTIONS Jawaban dikerjakan per kelompok dan diserahkan sebelum praktikum dimulai. 1.
2. 3. 4.
Sefalin adalah gliserofosfolipid yang terdapat dalam makanan. Struktur sefalin berbeda dengan lesitin. Sefalin mengandung etanolamina atau serin pada strukturnya sedangkan lesitin mengandung kolin. Bagaimana anda membedakan antara lesitin dan sefalin berdasarkan ketiga uji lipid yang disampaikan pada modul ini? Kolesterol memiliki gugus alkohol, yang dapat didehidrasi (melepaskan satu molekul air). Gambarkanlah struktur kolesterol yang telah mengalami dehidrasi. Apakah struktur seperti pada pertanyaan no.2 akan memberikan uji positif pada uji Lieberman-Burchard? Jelaskan jawaban anda. Kolesterol pada jaringan kadang-kadang diesterifikasi oleh asam lemak. a. Gambarkan struktur kolesteril oleat b. Apakah senyawa ester pada 4a akan memberikan uji positif pada uji Lieberman-Burchard? Berikan alasan terhadap jawaban anda.
POST-LAB QUESTIONS Jawaban disertakan pada laporan, diserahkan bersamaan dengan penyerahan laporan. 1. Berdasarkan intensitas warna yang teramati pada uji kolesterol, bahan makanan apakah yang paling banyak mengandung kolesterol dan yang paling sedikit? 2. Di samping lesitin dan gliserofosfolipid yang lain, ada dua kelas lipid kompleks (a) sphingolipid dan (b) glikolipid. Lihat dan pelajari struktur kedua kelas lipid tersebut. Apakah senyawa-senyawa tersebut akan memberikan uji positif pada larutan molibdat. 3. Uji positif akrolein ditandai dengan aroma dan warna. Yang manakah yang muncul terlebih dahulu? Jelaskan jawaban anda. 4. Ketika sukrosa didehidrasi dengan pemanasan dan KHSO 4, anda dapat mengamati residu karbon dan air. Ini merupakan asal dari nama karbohidrat. Apakah anda dapat mendeteksi adanya akrolein melalui aroma pada dehidrasi sukrosa? 5. Mengapa perlu menghidrolisa sampel dengan asam nitrat sebelum melakukan uji molibdat?
RFK-Institut Teknologi Del
Page 4
